CN113025534A

CN113025534A - 一株具有较强抑菌作用的新种芽孢杆菌x901株及其应用

Info

Publication number: CN113025534A
Application number: CN202110453576.3A
Authority: CN
Inventors: 周淑贞; 辜质纯; 李成应; 谢志恒; 顾万军
Original assignee: Foshan Nanhai Eastern Along Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Foshan Nanhai Eastern Along Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-04-26
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-04-26
Also published as: CN113025534B

Abstract

本发明公开了一株具有较强抑菌作用的新种芽孢杆菌X901株及其应用。菌种保藏号为GDMCC No：61472。芽孢杆菌X901株是国内首次分离鉴定具有抑菌活性的新种芽孢杆菌菌株，培养整个过程都可产生抑菌性物质。抑菌产物粗品和胞外多糖提取物对革兰氏阴性细菌（大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和维氏气单胞菌）和革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌、猪链球菌和枯草杆菌）均产生较为明显的抑菌作用。菌株本身不具有耐药性或抗药性，口服无致病性，安全。在畜禽、水产等动物养殖生产中，可以作为益生素菌种或饲用微生物添加剂使用，减少抗生素的使用，提高动物的抗病力，具有非常高的应用价值。

Description

一株具有较强抑菌作用的新种芽孢杆菌X901株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一株具有较强抑菌作用的新种芽孢杆菌X901株及其应用。

背景技术

目前，因抗生素滥用导致的畜禽产品药物残留超标、耐药致病菌株大量增加等问题引起人们高度重视。我国是世界上最大的抗生素生产国和使用国，同时也是抗生素滥用和细菌耐药性的重灾区，特别是畜牧业领域最为严重，严重危害人们的食品健康。在国家减抗限抗的倡导下，养殖场尝试使用替抗产品，但是效果并不显著，所以，寻求饲用抗生素替代品迫在眉睫。

目前，现有饲料添加剂中，使用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其具有耐高温、耐酸碱、耐压等优点，随着芽孢杆菌在饲料添加剂中的应用越来越广泛，抑菌活性较高的芽孢杆菌的研究与开发意义重大，市场前景广阔。

芽孢杆菌(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌。芽孢杆菌由于产生芽孢，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外线辐射等所造成的伤害，维持自身能力不受影响。芽孢杆菌种类繁多、数量庞大，是自然界中广泛存在的非致病性细菌，对人畜无害，自然环境友好。鉴于芽孢杆菌的生物学特性使芽孢杆菌具有良好的应用前景，特别是在使用活菌制剂及其产物应用中表现出强大的生命力。芽孢杆菌在农业方面有着广泛的应用，很多生物农药是用芽孢杆菌制成的；有些菌株可用于养殖业上，提高畜禽产品的品质，由于芽孢的耐热性，又可以耐受胃中pH较低的酸性环境，芽孢杆菌作为饲料添加剂等可提高饲料利用率，降低饲养成本，同时可预防和减少疾病发生。养猪生产中减少抗生素生长促进剂或减少某些抗生素的使用，以不影响生猪生产又保证产品质量，有些芽孢杆菌是重要的候选者，目前已有较多成功的例证。

发明内容

本发明的目的在于提供一株新种芽孢杆菌X901株及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一株新种芽孢杆菌X901，其保藏在位于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No：61472，保藏日期2021年1月28日。该菌株已经于2021年1 月29日鉴定存活，提议的分类学名称为Bacillus sp.

本发明的第二个方面，提供：

一种微生物制剂，其添加有本发明第一个方面所述的芽孢杆菌X901株或其发酵物。

在一些实例中，还添加有载体。

在一些实例中，所述芽孢杆菌X901株的活菌数≥2.3×10⁹cfu/g。

在一些实例中，所述载体选自淀粉、羧甲基淀粉钠、农作物副产物、葡萄糖、麦芽糊精、脱脂奶粉、海藻糖、二氧化硅、碳酸钙。

在一些实例中，所述农作物副产物选自米糠、中草药粉、大豆粉、玉米粉、麸皮。

在一些实例中，所述淀粉为可溶性淀粉。

本发明的第三个方面，提供：

一种饲料，其添加有本发明第一个方面所述的芽孢杆菌X901株，或本发明第二个方面所述的微生物制剂。

在一些实例中，以制剂的活菌数为100亿/克计，所述微生物制剂的添加量为：

饲料加工：0.2％～0.6％；

拌料饲喂：0.04％～0.06％；

饮水饲喂：0.02％～0.03％。

饲料可以是各种养殖动物用的饲料，包括但不限于禽类、反刍动物、猪、水产品等养殖动物饲料。

本发明的第四个方面，提供：

本发明第一个方面所述芽孢杆菌X901株的应用，所述应用包括：制备抑菌剂中、制备饲料添加剂、环境净化剂、水体净化剂、免疫促进剂。

在一些实例中，所述抑菌剂用于抑制大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、维氏气单胞菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、枯草杆菌、沙门氏菌及弧菌等致病菌或有害菌。

在一些实例中，水体净化剂用于养殖水处理，以制剂的活菌数为100亿/克计，按100～ 200g/亩水体，先用适量水溶解后均匀泼洒。

本发明的有益效果是：

本发明的新种芽孢杆菌X901株(Bacillus sp.X901)，是国内首次分离鉴定具有抑菌活性的新种芽孢杆菌菌株，在培养后12h左右进入对数生长期，快速繁殖，菌体浓度增加；培养到30h左右进入稳定期；在培养过程中具有持续性耐酸生长的特性；培养整个过程都可产生抑菌性物质。抑菌产物粗品和胞外多糖提取物对6种指示菌，革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和维氏气单胞菌)和革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、猪链球菌和枯草杆菌) 均产生较为明显的抑菌作用。

与枯草芽孢杆菌相比，新种芽孢杆菌X901株(Bacillus sp.X901)对所选择的7种常用的代表性药物均在敏感水平以上，不具有耐药性或抗药性；口服新种芽孢杆菌X901株对小白鼠无致病性，安全。

本发明新种芽孢杆菌X901株(Bacillus sp.X901)的抑菌试验和安全性试验的结果表明其在畜禽、水产等动物养殖生产中，可以作为益生素菌种或饲用微生物添加剂使用，减少抗生素的使用，提高动物的抗病力，具有非常高的应用价值。

本发明新种芽孢杆菌X901株(Bacillus sp.X901)的发酵产物添加到饲料中，可以有效提高蛋鸡的生产性能。

附图说明

图1是新种芽孢杆菌X901株涂片的显微照片；

图2是新种芽孢杆菌X901株接种血清琼脂培养基37℃培养24h的照片；

图3是新种芽孢杆菌X901株基因组DNA16S rRNA区域PCR扩增结果；

图4是新种芽孢杆菌X901与其他芽孢杆菌16S rRNA序列同源性比较分析；

图5是新种芽孢杆菌X901 16S rRNA序列遗传发育树；

图6是新种芽孢杆菌X901株生长曲线；

图7是新种芽孢杆菌X901株的pH变化曲线；

图8是新种芽孢杆菌X901株抑菌产物的抑菌曲线；

图9是新种芽孢杆菌X901株的培养菌液和抑菌产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌图片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

新种芽孢杆菌X901株分离

发明人在金黄色葡萄球菌培养时，发现在平皿边缘有一抑菌的类似芽孢杆菌菌落，随即进行了简单的重复试验。在此基础上，分离获得新种芽孢杆菌X901株。

新种芽孢杆菌X901株鉴定研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1鉴定菌株：新种芽孢杆菌X901株。本室在动物病原菌的分离鉴定的研究过程中，发现了一种具有抑菌作用的芽孢杆菌，命名为：X901，用于进行分离鉴定菌株。抑菌试验用病原细菌：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，均为本室分离保存菌种。

1.1.2培养基：血清琼脂培养基(0.5％血清，0.5％NAD)。牛血清、NAD、营养琼脂、营养肉汤、MRS液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3细菌生化反应试剂：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.4细菌基因组DNA提取试剂盒：青岛海博生物技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1细菌基因组DNA制备：

(1)将血清琼脂平板活化的X901菌株接种于BSA培养基，37℃恒温培养18～24h，取1.5mL，5000g离心2min，保留菌泥；

(2)菌泥沉淀物加入567μL的TE缓冲液，吹打悬浮。加入3μL 10％SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；

(3)加入100uL 5mol/L NaCL，充分混匀，加入80uL CTAB/NaCL溶液，混匀，于65℃温育10min；

(4)加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000g，离心5min，将上清移入一个新离心管中；

(5)加入等体积的酚|氯仿/异戊醇，混匀，10000g，离心5min，将上清移入一个新离心管中；

(6)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，直到DNA沉淀下来，离心沉淀，70％乙醇洗涤2次；

(7)小心吸出乙醇，真空冷冻稍加干燥，重悬于100μL TE缓冲液，～20℃保存备用。

1.2.2细菌16S rRNA PCR扩增：设计合成细菌16S rRNA PCR引物，进行PCR扩增。产物在3％琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果。

16S rRNA PCR扩增反应体系如下：

2.结果

2.1 X901染色、菌落观察

将X901菌接种于血清琼脂培养基，37℃恒温培养24h，观察菌落形态特点。菌落涂片，革兰氏染色，显微镜观察菌体形态、染色特性。

图1是X901芽孢杆菌涂片的显微照片。结果显示革兰氏染色阳性，多单在、短直、中等大小杆菌。形成圆形或椭圆形中立芽孢。图2是X901芽孢杆菌接种血清琼脂培养基37℃培养24h的照片，可见其形成圆形或近圆形，直径2～3mm，灰白色、半透明菌落。菌落中间形成皱纹，边缘不整齐，似雪片状。

2.2 X901芽孢杆菌生化反应鉴定结果

按细菌生化鉴定说明书，将X901菌株接种反应管，37℃，24h培养，判定结果。

2.3芽孢杆菌X901的16S rRNA PCR扩增、测序分析结果

2.3.1 16S rRNA PCR扩增结果

按照方法中所述，提取芽孢杆菌X901基因组DNA，设计引物，对16S rRNA基因片段进行PCR扩增，采用3％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照、观察，见图3(图中，A:marker；B:“+”对照；C：“－”对照D、E：细菌DNA基因组)。结果显示，芽孢杆菌X901的16S rRNA的PCR扩增产物，在约1453bp处出现目的条带。

2.3.2芽孢杆菌X901的16S rRNA基因测序与分析

通过对16S rDNA基因片段测序，建立系统发育树(见图4和图5)。并与GenBank数据库进行序列同源性比较。结果表明：X901芽孢杆菌菌株为新种芽孢杆菌X901株(Bacillussp.X901)。因此，X901芽孢杆菌菌株确定为新种芽孢杆菌X901株(Bacillus sp.X901)。

新种芽孢杆菌X901株抑菌活性及安全性试验研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验用菌种：新种芽孢杆菌X901株：本室分离鉴定菌株。抑菌等试验用指示细菌：金黄色葡萄球菌、猪链球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、维氏气单胞菌均为本室分离或保存菌种。

1.1.3细菌药敏试纸片：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.4试验动物：BALB/c小白鼠，购自广东省实验动物中心。

1.2试验方法

1.2.1新种芽孢杆菌X901株的抑菌试验

1.2.1.1菌种活化及培养：自超低温冰箱中取出本实验室保存的新种芽孢杆菌X901株，于血清琼脂培养基上划线接种培养，37℃条件下，培养24h，培养皿中挑取单一菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18～24h。

1.2.1.2指示菌的培养:按2％的接种量接种在营养肉汤培养基中，37℃，培养24h。

1.2.1.3新种芽孢杆菌X901株抑菌产物粗品的制备:将活化的新种芽孢杆菌X901株，接种于200mL MRS液体培养基中，37℃摇床培养18～24h的MRS液体培养物，高速冷冻离心(12000r/min，20min，4℃)，取上清液，即为抑菌产物粗品，4℃保存备用。

1.2.1.4抑菌效果的测定采用牛津杯法:利用0.85％的生理盐水将指示菌制成约1×10⁷cfu/mL的菌悬液(OD_600nm≈0.3)，备用。待营养琼脂培养基凝固后，吸取200μL指示菌菌悬液于平板上，用涂布棒涂布均匀，倒置培养1h后，放置牛津杯，在杯中加入抑菌产物粗品200μL，每一样品3个重复，每批次试验以培养基作为对照。在4℃冰箱中扩散12h，将培养皿移到37℃下恒温培养24h，取出，测定抑菌圈直径(mm)，评价抑菌活性。

1.2.2试验设计

1.2.2.1生长曲线、pH、抑菌活性

将活化的新种芽孢杆菌X901株接种到MRS培养基中，37℃培养，每隔2h取样，以未接种的MRS液体培养基做空白对照，测定OD_600nm和pH，24h后，每隔4h测定一次，至36h。同时，测定每个时间点的抑菌活性能力。

1.2.2.2抑菌谱

分别取新种芽孢杆菌X901株24h和48h的抑菌产物粗品，采用牛津杯法对各指示菌做抑菌试验，以抑菌圈平均直径(mm)，描述抑菌效果。

1.2.4细菌胞外多糖(EPSs)提取方法

参照文献方法，活化菌种，挑取单个菌落，接种于50mL MRS液体培养基，37℃，摇床(120rpm)培养48h，5000rpm离心15min，收集上清，保留10mL上清，做平行试验。余下上清与4倍体积的冰冷无水乙醇充分混合，放置4℃10min，7000rpm离心10min，收集沉淀，以丙酮和二乙基乙醚分别洗涤2次，50℃干燥，溶于5mL无菌水中，即为初提细菌胞外多糖。保存于4℃备用。

新种芽孢杆菌X901株初提细菌胞外多糖与菌液的平行抑菌试验，参照本文1.2.1.4的方法进行。

1.2.5新种芽孢杆菌X901株药敏试验

应用1.2.1.1制备的新种芽孢杆菌X901株菌液，采用平皿药敏试纸片扩散法，进行药敏试验，37℃，培养24h，测量抑菌圈直径(mm)，记录结果。

1.2.6新种芽孢杆菌X901株小白鼠安全性试验

1.2.6.1喂饲菌液：活化菌种，挑取单个菌落，接种于MRS液体培养基，37℃，摇床(120rpm) 培养18～24h，置4℃备用。

1.2.6.2喂饲试验：选取BALB/c小白鼠，随机分成3组，每组5只。A组第一天口服菌液0.1mL/只；B组口服菌液0.2mL/只；C组口服MRS液体培养基，作为对照组。自第二天起，每天取菌液，按A组0.1mL/只；B组0.2mL/只，均匀拌于饲料中，自由采食。试验7天，每天观察记录临床状况，称量体重，观察粪便情况，记录结果。

2.结果及分析

2.1生长曲线、pH、抑菌活性

2.1.1生长曲线

新种芽孢杆菌X901株在培养后12h左右进入对数生长期，快速繁殖，菌体浓度增加；培养到30h左右进入稳定期。从所得到的生长曲线分析，新种芽孢杆菌X901株生长速度较慢，各时期维持时间较长(图6)。

2.1.2 pH值变化

新种芽孢杆菌X901株培养菌液的pH变化曲线见图7。图中可以看出，培养菌液pH自2h后开始缓慢下降，至36h维持在5.0左右。结合生长曲线分析，新种芽孢杆菌X901株在培养过程中持续产酸，对菌体繁殖影响不明显，说明新种芽孢杆菌X901株具有耐酸性生长的特性。

2.1.3抑菌活性曲线

新种芽孢杆菌X901株抑菌粗产物活性试验的抑菌曲线见图8。图中可以看出，培养菌液自2h产生开始具有抑菌活性物质，8h左右活性达到高峰，至12h开始下降，以后维持在一定水平至36h。综合分析认为新种芽孢杆菌X901株抑菌产物产生较快，且与菌体的繁殖相关性不明显。培养菌液在8～16h的pH维持在pH5.6左右，且在此期间X901抑菌产物活性维持在高水平。说明pH环境与X901抑菌产物活性相关，从本试验分析，X901抑菌产物在pH 5.6～6.0维持在较高水平。

2.2抑菌产物粗品及胞外多糖的抑菌谱

新种芽孢杆菌X901株抑菌产物胞外多糖的抑菌谱见表1。结果表明新种芽孢杆菌X901 株的24h、48h抑菌产物粗品和胞外多糖提取物对6种指示菌，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均产生较为明显的抑菌作用。参照抑菌圈直径(mm)≧12判为“++”；6～12判为“+”；无抑菌圈为“－”的判定方法，24h、48h抑菌产物粗品均在“++”；胞外多糖均在“+”。比较分析，胞外多糖的抑菌活性水平总体低于抑菌产物粗品。用于提取胞外多糖的菌液上清也同样低于抑菌产物粗品，可能与菌液上清保存在4℃时间较长有关。

表1、新种芽孢杆菌X901株抑菌产物胞外多糖的抑菌谱单位：mm

2.3药敏试验结果

新种芽孢杆菌X901株的药敏实验结果见表2。结果表明：与枯草芽孢杆菌相比，新种芽孢杆菌X901株对所选择的7种常用的代表性药物均在敏感水平以上，说明新种芽孢杆菌X901 株不具有对常用抗菌药的抗药性。

表2新种芽孢杆菌X901株药敏实验结果抑菌圈直径：mm

2.4小白鼠安全性试验

试验小白鼠试验期间食欲明显提高，粪便正常。无死亡、发病。表明：口服新种芽孢杆菌X901株对小白鼠无致病性，安全。鉴于喂饲试验时间较短，具体增重及相关指标与对照组差异不明显。

研究结果表明：

新种芽孢杆菌X901株在培养后12h左右进入对数生长期，快速繁殖，菌体浓度增加；培养到30h左右进入稳定期；在培养过程中具有持续性耐酸生长的特性；培养整个过程都可产生抑菌性物质，且抑菌物质是以细菌胞外多糖为主发挥作用。新种芽孢杆菌X901株在24h、 48h抑菌产物粗品和胞外多糖提取物对6种指示菌，革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和维氏气单胞菌)和革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、猪链球菌和枯草杆菌)均产生较为明显的抑菌作用。

与枯草芽孢杆菌相比，新种芽孢杆菌X901株对所选择的7种常用的代表性药物均在敏感水平以上，不具有耐药性或抗药性；口服新种芽孢杆菌X901株对小白鼠无致病性，安全。

综上，实验室分离获得的新种芽孢杆菌X901株具备益生素优良菌株的要求，在畜禽、水产等动物养殖生产中，可以作为作为益生素菌种或饲用微生物添加剂研究、开发与应用。

新种芽孢杆菌X901株对蛋鸡生产性能的影响

一、材料和方法

1.试验材料

试验用新种芽孢杆菌X901株制剂由佛山市南海东方澳龙制药有限公司提供。由实验室小型发酵设备发酵，加入载体混合均匀干燥粉碎而成，新种芽孢杆菌X901株制剂活菌数≥2.3×10⁹cfu/g。

2.试验设计

试验选用海蓝褐蛋鸡，选取体质健康、体重相近的40周龄产蛋鸡180只，随机分为3组，每组10个重复，每个重复6只。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加新种芽孢杆菌X901株制剂1000g。各组间在试验期间统一饲喂基础日粮，预饲期10d，试验期30d。

3.饲养管理

试验蛋鸡饲养于同一鸡舍中，各笼之间环境相似，自由饮水和采食，自动给集蛋，连续光照16小时，正常通风，保证鸡舍卫生，每天检查蛋鸡的健康状况并做好记录。

4.测定指标及方法

在正试期内每天记录各组中蛋鸡的采食量、产蛋数、蛋重、不合格蛋数。试验结束后统计计算全期的产蛋率、料蛋比、平均蛋重、不合格蛋数。

产蛋率＝产蛋总数/总饲养只数×100％

料蛋比＝总采食量/总蛋重

平均蛋重＝总蛋重/产蛋总数

不合格蛋率＝不合格蛋数/产蛋总数×100％

5.数据统计及分析

试验数据用SPSS软件处理，用t检验进行统计分析。结果采用平均值+标准差表示，用 P＜0.05表示差异显著。

二、结果分析及讨论

表3芽孢杆菌X901株制剂对蛋鸡生产性能的影响

注：不同组别间字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)

从表1可知，试验结束后，与对照组相比，试验组的产蛋率显著提高了2.47％(P＜0.05)；料蛋比显著降低了8.48％(P＜0.05)；平均蛋重显著提高了5.44％(P＜0.05)；不合格蛋率显著降低了33.76％(P＜0.05)。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株新种芽孢杆菌X901，其保藏在广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCCNo：61472。

2.一种微生物制剂，其特征在于：其添加有权利要求1所述的芽孢杆菌X901株或其发酵物。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于：还添加有载体。

4.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于：所述芽孢杆菌X901株的活菌数≥2.3×10⁹cfu/g。

5.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于：所述载体选自淀粉、羧甲基淀粉钠、农作物副产物、葡萄糖、麦芽糊精、脱脂奶粉、海藻糖、二氧化硅、碳酸钙。

6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于：

所述农作物副产物选自米糠、中草药粉、大豆粉、玉米粉、麸皮；

所述淀粉为可溶性淀粉。

7.一种饲料，其特征在于：其添加有权利要求1所述的芽孢杆菌X901株或添加有权利要求2所述的微生物制剂。

8.根据权利要求7所述的饲料，其特征在于：以制剂的活菌数为100亿/克计，所述微生物制剂的添加量为：

饲料加工：0.2%～0.6%；

拌料饲喂：0.04%～0.06%；

饮水饲喂：0.02%～0.03%。

9.权利要求1所述新种芽孢杆菌X901株的应用，其特征在于：所述应用包括：制备抑菌剂中、制备饲料添加剂、环境净化剂、水体净化剂、免疫促进剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抑菌剂用于抑制大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、维氏气单胞菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、枯草杆菌、沙门氏菌及弧菌。