CN109423460A - 具有益生菌活性的枯草芽孢杆菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对猪和家禽相关的病原体具有强抑制作用的新的枯草芽孢杆菌菌株及其作为益生菌的用途。
Description
本发明涉及对猪和家禽相关的病原体具有强抑制作用的新的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株及其作为益生菌的用途。
本领域此前已经公开了将枯草芽孢杆菌菌株作为益生菌组分用于饲料工业。益生菌(也称为“直接饲喂微生物(direct-fed microbials)”或“DFM”)的功能是通过支持有益菌的生长和/或抑制致病菌的生长而积极地影响肠道菌群。理想地，通过使用益生菌，可不再需要使用抗生素生长促进剂(antibiotic growth promotor，AGP)。但除此之外，还希望益生菌实现其他功能，例如帮助消化特定的饲料组分。
因此，鉴于本领域的情况，需要积极地影响肠道菌群且除此之外希望其实现至少一种其他功能的益生菌。
令人惊奇的是，发现本发明的细菌具有很多优势特征。其除了能够抑制产气荚膜梭菌(C.perfringens)、难辨梭菌(C.difficile)、鹑鸡链球菌(S.gallinaceus)、猪链球菌(S.suis)、结肠弯曲杆菌(C.coli)、空肠弯曲菌(C.jejuni)和耐久肠球菌(E.cecorum)这些与猪和家禽养殖业相关的主要病原体之外，还特别在存在胆汁的条件下显示出极高的增殖速度，并以非常高效的方式帮助消化纤维素。
通过对天然存在的分离株进行定向筛选鉴定到了枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DSM 32592，其已经依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定以赢创德固赛有限公司的名义于2017年8月16日保藏于DSMZ(Leibniz研究所-德国微生物菌种保藏中心，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Germany)，保藏号如上所述。
因此，本发明的第一个主题是枯草芽孢杆菌菌株和/或所述枯草芽孢杆菌菌株的制备物，其选自以下一组：
a)以保藏号DSM 32592保藏于DSMZ的枯草芽孢杆菌菌株；
b)保藏号为DSM 32592的枯草芽孢杆菌菌株的突变株，其具有菌株DSM 32592的全部识别特征，其中，所述突变株优选地与菌株DSM 32592具有至少95％、优选地至少96、97或98％、更优选地至少99或99.5％的DNA序列相同性和/或其中该突变株优选地与菌株DSM32592具有至少95％、优选地至少96、97或98％、更优选地至少99、99.5或99.8％、特别是100％的基因组DNA序列相同性；
c)(a)或(b)的制备物；
d)含有(a)、(b)或(c)中所含代谢物的有效混合物的制备物。
以保藏号DSM 32592保藏于DSMZ的枯草芽孢杆菌菌株具有以下特征性序列：
a)16S rDNA序列，其与SEQ ID NO：1的多核苷酸序列具有至少99或99.5％、特别是100％的序列相同性；
b)yqfD序列，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有至少99或99.5％、特别是100％的序列相同性；
c)gyrB序列，其与SEQ ID NO：3的多核苷酸序列具有至少99或99.5％、特别是100％的序列相同性；
d)rpoB序列，其与SEQ ID NO：4的多核苷酸序列具有至少99或99.5％、特别是100％的序列相同性；
e)groEL序列，其与SEQ ID NO：5的多核苷酸序列具有至少99或99.5％、特别是100％的序列相同性。
因此，本发明的另一主题是枯草芽孢杆菌菌株、特别是具有前述特征的枯草芽孢杆菌菌株，或其制备物，其中所述枯草芽孢杆菌菌株具有至少一种以下特征，优选地具有全部以下特征：
a)16S rDNA序列，其与SEQ ID NO：1的多核苷酸序列具有至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
b)yqfD序列，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
c)gyrB序列，其与SEQ ID NO：3的多核苷酸序列具有至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
d)rpoB序列，其与SEQ ID NO：4的多核苷酸序列具有至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
e)groEL序列，其与SEQ ID NO：5的多核苷酸序列具有至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
因此，本发明的另一主题是枯草芽孢杆菌菌株或其制备物、特别是具有前述特征的枯草芽孢杆菌菌株，其具有两个、三个或四个，更优选地具有全部以下特征：
a)16S rDNA序列，其与SEQ ID NO：1的多核苷酸序列具有至少99％、优选地至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
b)yqfD序列，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有至少99％、优选地至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
c)gyrB序列，其与SEQ ID NO：3的多核苷酸序列具有至少99％、优选地至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
d)rpoB序列，其与SEQ ID NO：4的多核苷酸序列具有至少99％、优选地至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性；
e)groEL序列，其与SEQ ID NO：5的多核苷酸序列具有至少99％、优选地至少99.5％、更优选地至少99.8或99.9％、首选100％的序列相同性。
因此，本发明的一个具体主题是枯草芽孢杆菌菌株，其具有以下特征：
a)16S rDNA序列，其序列为SEQ ID NO：1；
b)yqfD序列，其序列为SEQ ID NO：2；
c)gyrB序列，其序列为SEQ ID NO：3。
优选地，该枯草芽孢杆菌菌株具有以下进一步的特征：
d)rpoB序列，其序列为SEQ ID NO：4；
e)groEL序列，其序列为SEQ ID NO：5。
本发明的菌株优选地具有至少一种、更优选地全部以下特征：
本发明的菌株优选地能够在厌氧条件下生长。进一步，其优选地能够在厌氧条件下降解不溶于水的纤维素以及蛋白质。
进一步，本发明的菌株优选地还能够在有氧条件下降解不溶于水的纤维素以及蛋白质，特别是在2mM胆汁的存在下进行所述降解。
本发明的菌株优选地非常有效地抑制感染性细菌，特别是抑制选自以下一组中的至少一种菌株、优选地全部菌株：产气荚膜梭菌BB-081_Cpe、产气荚膜梭菌BB_031_Cpe、难辨梭菌DSM 1296、鹑鸡链球菌DSM 15349、猪链球菌DSM 9682、结肠弯曲杆菌DSM4689、空肠弯曲菌DSM 24219和耐久肠球菌DSM 20683。
具体而言，在LBKelly琼脂平板上进行的孔扩散拮抗作用测定中，本发明的菌株优选地表征为，分别对产气荚膜梭菌菌株BB-081_Cpe和BB_031_Cpe产生至少15mm、优选地至少20mm的病原体清除空隙。
本发明的菌株优选地具有至少一种以下酶活性、优选地具有全部以下酶活性：纤维素酶活性、木聚糖酶活性、蛋白酶活性、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶活性。
具体而言，优选地，本发明的菌株表征为木聚糖酶活性为至少15mU/mL、更优选地至少20mU/mL、特别是大约26mU/mL，和/或蛋白酶活性为至少12mU/mL、更优选地至少16mU/mL、特别是大约19mU/mL，和/或纤维素酶活性为至少500mU/mL、更优选地至少700mU/mL、尤其是大约900mU/mL。
本发明的菌株优选地还产生乳酸盐，且优选地还能够降解真菌毒素。
本发明的枯草芽孢杆菌菌株优选地还表征为能够在存在2mM的胆汁、更优选地在存在4mM的胆汁，和/或在存在0.3wt.-％的猪胆汁和/或在存在0.3wt.-％的鸡胆汁的情况下生长。具体而言，本发明的菌株优选地表征为能够在如此高的胆汁浓度下快速增殖。
此外，这些菌株优选地能够在高盐条件下、特别是在存在5wt.-％的NaCl的情况下生长至少一天。
此外，本发明的菌株(即分别的样品的显著部分，特别是至少80％)优选地可在动物饲料造粒所需的高温下存活、特别是优选地可在80℃、更优选地95℃或99℃的温度存活至少20分钟。
无意于受到任何理论的约束，本发明的枯草芽孢杆菌菌株被认为通过多层面的作用方式，包括产生具有选择性功效的抗菌代谢物并通过更好地消耗可利用的营养物质与致病菌竞争，由此抑制致病菌在肠道内有效建群，从而增强动物的健康、特别是肠道健康。为此，所述枯草芽孢杆菌产生的酶可通过提供预消化的营养物质而有助于建立平衡的肠道微生物群。
相比于抗生素，益生菌的巨大优势在于其既不会无差别地杀伤细菌，也不会导致致病菌产生抗生素抗性。益生菌通常能够通过产生具有特异性功效的抗微生物物质而选择性地与致病菌竞争，且理想地能够同时增强有益肠道菌群的生长和活力。进一步，其优选地能够刺激被处理的动物的全身免疫应答。
本发明的DSM 32592的突变株优选地是自发突变株。术语“自发突变株”指的是未经刻意使用诱变剂而从DSM 32592产生的突变株。此类自发突变株可通过常规方法获得，例如使枯草芽孢杆菌菌株在UV光中生长和/或施加高温或原生质体形成(protoplastformation)和/或生长在存在母本菌株对其具有敏感性的特定抗生素的条件下，并筛选具有提高的生物学活性或具有提高的增强一或多种反映动物健康、特别是肠道健康的指标的能力的抗性突变株。鉴定自发突变株的其他方法是本领域普通技术人员已知的。但是除了这些优选的自发突变株之外，所有其他类型的DSM 32592突变株，例如通过遗传工程学方法获得的突变株，也属于本发明的范围。
本发明的一种具体实施方式是菌株DSM 32592的非天然存在的突变株、特别是如前所定义的自发突变株，其通过如上所述的特征进行表征。
在本发明优选的实施方式中，本发明的菌株和制备物优选地通过口服施用于动物或人。
因此，本发明的另一主题是含有本发明的枯草芽孢杆菌菌株和/或制备物的组合物，例如饲料、食品、饮用水和饲养用水，以及治疗用组合物。
本发明的另一主题是本发明的枯草芽孢杆菌菌株和/或制备物作为饲料或食品中的益生菌组分(DFM)的用途。
本发明的优选的食品是乳制品，特别是酸奶、奶酪、乳、黄油和奶豆腐(quark)。
本发明的菌株的细胞，特别是本发明的组合物中的本发明的菌株的细胞，可以是芽孢(休眠状态的)、营养细胞(生长状态的)、过渡态细胞(处于从生长期到芽孢形成期的过渡阶段)或这些细胞类型的至少两种、特别是全部的组合。在优选的实施方式中，本发明的组合物主要包含或仅包含芽孢。
此外，或者作为替代，可以使用非存活的灭活形式的所述菌株的细胞，因为也预期这些非存活形式的细胞仍具有益生菌作用。灭活这些细胞的方法是本领域人员已知的。
当给动物施用时，本发明的枯草芽孢杆菌菌株和含有所述菌株的组合物优选地增强所述动物的健康和/或改善所述动物的一般身体状况和/或改善所述动物的饲料转化率和/或降低所述动物的死亡率和/或提高所述动物的存活率和/或改善所述动物的增重和/或提高所述动物的生产能力(productivity)和/或提高所述动物的疾病抵抗力和/或提高所述动物的免疫应答和/或给所述动物建立或维持健康肠道菌群和/或减少病原体通过所述动物的粪便散布。具体而言，在因治疗目的施用抗生素后，可使用本发明的菌株和组合物来帮助重建健康平衡的肠道菌群。
因此，本发明的另一主题是增强动物健康和/或改善动物的一般身体状况和/或改善动物的饲料转化率和/或降低动物死亡率和/或提高动物存活率和/或改善动物增重和/或提高所述动物的生产能力和/或提高动物疾病抵抗力和/或提高动物免疫应答和/或给动物建立或维持健康肠道菌群和/或减少病原体通过动物粪便散布的方法，其中给动物施用本发明的菌株和/或制备物或本发明的组合物，其包含此类菌株。
因此，本发明的另一主题是本发明的菌株和/或制备物和/或组合物在增强动物健康和/或改善动物的一般身体状况和/或改善动物的饲料转化率和/或降低动物死亡率和/或提高动物存活率和/或改善动物增重和/或提高所述动物的生产能力和/或提高动物疾病抵抗力和/或提高动物免疫应答和/或给动物建立或维持健康肠道菌群和/或减少病原体通过动物粪便散布中的用途，其中给动物施用本发明的菌株和/或制备物或本发明的组合物，其包含此类菌株。
因此，本发明的另一主题是如前所述的本发明的菌株和制备物和含有所述菌株的本发明的组合物，其用于增强动物健康和/或用于改善动物的一般身体状况和/或用于改善动物的饲料转化率和/或用于降低动物死亡率和/或用于提高动物存活率和/或用于改善动物增重和/或用于提高所述动物的生产能力和/或用于提高动物疾病抵抗力和/或用于提高动物免疫应答和/或用于给动物建立或维持健康肠道菌群和/或用于减少病原体通过动物粪便散布。
“提高动物的生产能力”具体是指任何以下情况：产生更多或更高质量的蛋、乳或肉，或增加断奶仔畜的产出。
所述方法和本发明的菌株、制备物和组合物的用途可以是治疗或非治疗目的的。在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述方法和用途是非药用的，具体而言是饲喂用途。
未经处理的动物粪肥因其中的致病菌和其他成分而可能对环境具有有害影响，特别是对于动物自身和/或与此类粪肥发生接触的人具有有害影响，可以通过给所述动物饲喂本发明的菌株、组合物或制备物或用其直接处理所述动物的粪肥或草垫(bedding)而避免此类有害影响。因此，本发明的另一主题是控制和/或避免粪肥或污染液体对环境的有害影响的方法，所述方法包括对粪肥、污染液体、排泄物(litter)、坑或贮粪池施用至少一种本发明的菌株和/或一种本发明的制备物和/或一种本发明的组合物的步骤。优选地，所述组合物以液体或粉末的形式施用，例如喷或撒。
有害细菌会对排泄物的稠度产生不利影响，特别是会产生具有相当流动性或高度液体性的排泄物，这会导致家禽发生足爪垫疾病，可以通过给所述动物饲喂本发明的菌株、组合物或制备物而避免此问题。因此，本发明的另一主题是控制和/或改善排泄物稠度的方法、特别是保证排泄物的固相稠度的方法和/或避免足爪垫疾病的方法，所述方法包括给动物、特别是家禽饲喂至少一种本发明的菌株和/或一种本发明的制备物和/或一种本发明的组合物的步骤。
本发明的菌株和制备物还可用来改善水质。因此，本发明的另一主题是控制和/或改善水或水溶液、特别是饮用水和/或饲养用水的质量的方法，包括对水或水溶液施用至少一种本发明的菌株和/或一种本发明的制备物和/或一种本发明的组合物的步骤。
进一步，本发明的菌株和制备物还可用于治疗植物的微生物疾病。因此，本发明的另一主题是治疗和/或预防植物、特别是栽培植物的微生物疾病的方法，包括给所述植物施用至少一种本发明的菌株和/或一种本发明的制备物和/或一种本发明的组合物的步骤。施用可以液体形式进行，例如喷洒，或者以固体的形式、特别是以粉末的形式进行，优选地作为配制好的粉末。
通过使用本发明的菌株、制备物和组合物优选地使得至少一种前述特征的改善得以实现，其中所述特征的实现优选地是指与合适的阴性对照相比，改善至少1％、更优选地至少3％或至少5％。可以使用畜牧业领域已知的阴性对照的平均值，但优选地，阴性对照动物是那些与测试动物进行相同处理，但未施用本发明的菌株和/或制备物的动物。
具体而言，可给动物施用或饲喂有效量的本发明的菌株、制备物和组合物以抑制和/或降低致病菌在动物肠道内的生长。此类致病菌包括梭状芽孢杆菌属(Clostridia)、李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、气单胞菌属(Aeromonas)、链球菌属(Streptococci)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺菌属(Shigella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、短螺菌属(Brachyspira)和弧菌属(Vibrio)。与此相关的是，本发明的方法可用于降低动物粪便散布的致病菌、病毒和原虫的量。本发明的方法还可用于维持或增加动物肠道内有益菌例如乳酸细菌的生长。通过降低致病菌和/或增加或维持有益菌，本发明的组合物能够维持总体健康的肠道菌群。
因此，本发明的另一主题是本发明的菌株、制备物和组合物，其用于抑制和/或降低动物肠道内致病菌的生长和/或用于维持和/或增加动物肠道内有益菌的生长，其中致病菌优选地选自梭状芽孢杆菌属、特别是选自产气荚膜梭菌、难辨梭菌、诺维梭菌(C.novyi)、败血梭菌(C.septicum)和大肠芽胞梭菌(C.colinum)；选自李斯特氏菌属、特别选自单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)、斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)和威氏李斯特氏菌(L.welshimeri)；选自沙门氏菌属、特别是肠炎沙门菌亚属(S.enterica)，包括其肠炎亚种(enterica)、亚利桑那亚种(arizonae)、邦戈亚种(bongori)且特别是以下血清型，鸡沙门氏菌(S.gallinarum)、鸡瘟沙门氏菌(S.pullorum)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、肠炎寒沙门氏菌(S.enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(S.cholerasuis)、海德堡沙门氏菌(S.heidelberg)和婴儿沙门氏菌(S.infantis)；选自肠球菌属、特别是粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)和耐久肠球菌；选自葡萄球菌属、特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；选自气单胞菌属；选自链球菌属、特别是猪链球菌和鹑鸡链球菌；选自弯曲杆菌属、特别是空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌；选自大肠杆菌；选自嗜血杆菌属、特别是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)；选自短螺菌属、特别是Brachyspira hyodysenteriae；以及选自弧菌属、特别是副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)和哈氏弧菌(V.harveyi)，有益菌优选地选自乳酸细菌、特别是选自乳酸杆菌和双歧杆菌。
在本发明的一个优选的实施方式中，至少一种致病菌的量、特别是产气荚膜梭菌的量，降低至少0.5个对数(log)、更优选地降低至少1个对数、2个对数或3个对数。
因此，本发明的另一主题是本发明的菌株、制备物和组合物，其用于抑制和/或降低动物肠道内致病菌的生长和/或用于维持和/或增加动物肠道内有益菌的生长，其中致病菌优选地选自梭状芽孢杆菌属、特别是选自产气荚膜梭菌、难辨梭菌、诺维梭菌、败血梭菌和大肠芽胞梭菌；选自李斯特氏菌属、特别选自单核细胞增多性李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌和威氏李斯特氏菌；选自沙门氏菌属、特别是肠炎沙门菌亚属，包括其肠炎亚种、亚利桑那亚种、邦戈亚种且特别是以下血清型，鸡沙门氏菌、鸡瘟沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、海德堡沙门氏菌和婴儿沙门氏菌；选自肠球菌属、特别是粪肠球菌、屎肠球菌和耐久肠球菌；选自葡萄球菌属、特别是金黄色葡萄球菌；选自气单胞菌属；选自链球菌属、特别是猪链球菌和鹑鸡链球菌；选自弯曲杆菌属、特别是空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌；选自大肠杆菌；选自嗜血杆菌属、特别是副猪嗜血杆菌；选自短螺菌属、特别是Brachyspira hyodysenteriae；以及选自弧菌属、特别是副溶血性弧菌和哈氏弧菌，有益菌优选地选自乳酸细菌、特别是选自乳酸杆菌和双歧杆菌。
致病菌的存在和/或生长增加引起或可能引发某些疾病。例如，产气荚膜梭菌的存在和/或生长增加可在猪和家禽引发肠道疾病、特别是坏死性肠炎。产气荚膜梭菌的存在和/或生长增加还可引发其他疾病，例如细菌性肠炎、坏疽性皮炎和胆管肝炎。即便最轻型的产气荚膜梭菌感染也会伴有腹泻，这导致稀水样排泄物并由此导致继发性疾病例如足爪垫皮炎。通常认为C型产气荚膜梭菌是引起小猪坏死性肠炎和出血坏死性肠炎的主要原因，但已经发现A型与具有轻度坏死性小肠结肠炎和绒毛萎缩的未断奶的猪和喂养的猪的肠道疾病有关。
难辨梭菌是一种重要的新病原体，主要导致新生猪腹泻。受影响的小猪可能出现呼吸困难、腹胀和阴囊水肿。
耐久肠球菌已知引起鸡的跛行、关节炎和骨髓炎，这通常是由关节和/或骨组织炎症所致。此外，耐久肠球菌可引起心包炎症。
鹑鸡链球菌可引起家禽的败血症。大体病变包括脾肿大、肝肿大、肾肿大和充血。同时也观察到在肝脾内的多处坏死和/或梗死灶并伴有瓣膜心内膜炎。
结肠弯曲杆菌是通过食物传播的细菌，多数人通常通过食用含有该细菌的猪肉而感染。其在人类引起胃肠炎和急性小肠结肠炎，也引起急性腹泻疾病。其主要宿主是猪，但也可感染人、鸟类以及许多其他动物。
空肠弯曲杆菌感染是全球胃肠炎最常见原因之一[Acheson等2001]。感染是由摄入被污染的食物或水所致。空肠弯曲杆菌通常与家禽相关，其天然在许多鸟类[Colles等2009](20-100％的零售鸡是被污染的)以及牛特别是小牛犊的消化道建群。一些空肠弯曲杆菌菌株已被报道在新孵化的小鸡和幼禽中导致肠炎和死亡。
猪链球菌是猪的重要病原体，并且在断奶后的猪仔中是最重要的细菌感染死亡原因之一，其导致败血症、脑膜炎和多种其他感染。
病原体可引起其他疾病，例如多关节炎、纤维性多浆膜炎、断奶后肠道疾病如断奶后腹泻、水肿和猪痢疾。
本发明的另一主题因此还涉及治疗组合物，其包含前述本发明的菌株和/或组合物。
就此而言，本发明的优选的主题是治疗组合物，其用于治疗和/或预防动物的坏死性肠炎和出血坏死性肠炎、特别是亚临床型坏死性肠炎和出血坏死性肠炎，所述动物优选地是家禽或猪，所述治疗组合物包含前述本发明的菌株和/或组合物。
就此而言，本发明另一优选的主题因此是治疗性组合物，其用于治疗和/或预防动物、优选地用于治疗和/或预防家禽或猪的细菌性肠炎、坏疽性皮炎、胆管肝炎、梭菌病、腹泻、呼吸困难、腹胀、阴囊水肿、禽掌炎、足爪垫皮炎、链球菌性乳腺炎、跛足、关节炎、多关节炎、纤维性多浆膜炎、断奶后肠病如断奶后腹泻和水肿病、痢疾、骨髓炎、关节和/或骨组织炎症、心包炎、脾肿大、肝肿大、肾肿大、肝或脾的充血、坏死、梗死、瓣膜性心内膜炎、败血症和/或脑膜炎，所述治疗性组合物包含前述本发明的菌株和/或组合物。
因此，本发明的另一主题是治疗和/或预防家禽或猪的疾病、特别是肠道疾病、优选地为坏死性肠炎或出血坏死性肠炎、特别是亚临床型坏死性肠炎或亚临床型出血坏死性肠炎，其中给有需要的动物施用本发明的菌株和/或组合物和/或制备物。
因此，本发明的另一主题是治疗和/或预防疾病、优选地为家禽或猪的疾病，所述疾病选自细菌性肠炎、坏疽性皮炎、胆管肝炎、梭菌病、腹泻、呼吸困难、腹胀、阴囊水肿、禽掌炎、足爪垫皮炎、链球菌性乳腺炎、跛足、关节炎、多关节炎、纤维性多浆膜炎、断奶后肠病如断奶后腹泻和水肿病、痢疾、骨髓炎、关节和/或骨组织炎症、心包炎、脾肿大、肝肿大、肾肿大、肝或脾的充血、坏死、梗死、瓣膜性心内膜炎、败血症和/或脑膜炎，其中给有需要的动物施用本发明的菌株和/或组合物和/或制备物。
在整个动物的生命中或者在动物生命的特定阶段或部分期间，可在多天内将本发明的菌株和/或制备物和/或组合物加入饲料和/或饮用水中施用于动物。例如，可仅在农场动物的首餐或末餐中施用所述菌株和/或组合物。
本发明的一个具体主题是增强人的健康和/或改善人的一般状况和/或提高人的疾病抵抗力和/或提高人的免疫应答和/或建立或维持人的健康肠道菌群的方法，其中给人施用本发明的菌株和/或制备物或本发明的组合物，所述组合物包含此类菌株。
因此，本发明的另一主题是本发明的菌株和/或制备物和/或组合物用于增强人的健康和/或改善人的一般状况和/或提高人的疾病抵抗力和/或提高人的免疫应答和/或建立或维持人的健康肠道菌群的用途，其中给人施用本发明的菌株和/或制备物或本发明的组合物，所述组合物包含此类菌株。
本发明的组合物、特别是所述饲料、食品和药物组合物以及饮用水或饲养用水，优选地包含本发明的菌株，其施用于动物的比例为大约1x103至大约2x1012CFU/g饲料或ml水、特别是大约1x103或大约1x104或大约1x105或大约1x106或大约1x107或大约1x108或大约1x109或大约1x1010或大约1x1011或大约1x1012CFU/g饲料或ml水，优选地施用的量为大约1x104至大约1x1010CFU/g饲料或ml水、更优选地施用的量为1x104至1x107CFU/g饲料或ml水。
相应地，本发明的菌株和/或制备物在本发明的饲料、食品和水组合物中优选的量的范围优选地为0.1重量％至10重量％、更优选地为0.2重量％至5重量％、特别是0.3重量％至3重量％。
本发明的方法可用于所有的动物、特别是所有非人和非昆虫动物、更优选地为所有脊椎动物，例如哺乳动物、水生动物和鸟类。
可从本发明中受益的动物包括但不限于农场动物、宠物、野生动物、动物园动物、水生动物、用于运动、娱乐或工作的动物。
宠物优选地选自狗、猫、家鸟和家养的野生动物。
水生动物优选地选自有鳍鱼类和甲壳类动物，它们优选地是用于人类的营养的动物。这些包括，具体而言，鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳟鱼、尖吻鲈、鲷鱼、鲈鱼、鳕鱼、虾、龙虾、螃蟹、大虾和小龙虾。就此而言，鲑鱼的优选品种是大西洋鲑鱼，红鲑鱼，马苏鲑鱼，大鳞大麻哈鱼，大马哈鱼，银鲑，多瑙河鲑鱼，太平洋鲑鱼和粉红鲑鱼。
其他优选的水生动物是养殖鱼，这些鱼后续被加工成鱼粉或鱼油。就此而言，鱼优选地是鲱、雪鱼类、鲱鱼、凤尾鱼、毛鳞鱼或鳕鱼。
在进一步优选的实施方式中，这些动物是农场动物，它们被饲养用于消费或作为食品生产者，如家禽、猪和反刍动物。
家禽可选自生产用家禽或家禽，但也可以选自观赏型家禽或野禽。
就此而言，优选的生产用家禽是鸡、火鸡、鸭和鹅。就此而言，优选的生产用家畜优选地是优化用于生产幼畜的家禽或优化用于产肉的家禽。
优选的观赏型家禽或野禽是孔雀、雉、鹧鸪、石鸡、珍珠鸡、鹌鹑、北欧雷鸟、松鸡、鸽子和天鹅，特别优选鹌鹑。
进一步优选的家禽是平胸类鸟，特别是鸵鸟和鸸鹋，还有鹦鹉。
根据本发明，反刍动物优选地选自牛、山羊和绵羊。在一个具体的实施方式中，可给年幼的反刍动物(preruminants)饲喂本发明的组合物以增强它们的健康，特别是减少这些动物的腹泻发病率。年幼的反刍动物是从出生到12周龄不等的反刍动物，包括小牛犊。
本发明的组合物可包含至少一种载体或常规饲料组分或其组合。
合适的载体是添加的惰性制剂组分，以改善回收、功效或物理特性，和/或有助于包装和施用。此类载体可以单独或者联合添加。这些载体可以选自抗结块剂、抗氧化剂、膨胀剂和/或保护剂。有用的载体的例子包括多糖(特别是淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、树胶、壳聚糖和/或菊粉)、蛋白质来源(特别是脱脂奶粉和/或甜乳清粉)、肽、糖(特别是乳糖、海藻糖、蔗糖和/或葡萄糖)、脂质(特别是卵磷脂、植物油和/或矿物油)、盐(特别是氯化钠、碳酸钠、碳酸钙、白垩、石灰岩、碳酸镁、磷酸钠、磷酸钙、磷酸镁和/或柠檬酸钠)、和硅酸盐(特别是粘土、特别是Beolite粘土、非晶硅、煅制二氧化硅/沉淀二氧化硅、沸石、漂白土、Clintpolite、胶岭石、硅藻土、滑石、膨润土、和/或硅酸盐例如硅酸铝、硅酸镁和/或硅酸钙)。American Feed Control Officials公司每年出版的官方出版物给出了用于动物饲料添加剂的合适载体。参见，例如，American Feed Control Officials官方出版物，Sharon Krebs，编辑，2006年版，ISBN 1-878341-18-9。可以在将发酵肉汤浓缩之后和/或在干燥过程中和/或干燥之后添加这些载体。本发明的优选的载体选自碳酸钙、硅藻土和植物油。
本发明的一个优选实施方式是浓缩组合物、特别是饲料添加物组合物，即适合用来制备饲料组合物的组合物，其包含本发明的至少一种菌株和至少一种前述的载体，其中所述至少一种菌株优选地量为0.1至10重量％、更优选地量为0.2至5重量％、特别是量为0.3至3重量％、首选量为0.4至2.2重量％，且所述至少一种载体优选地量为至少90重量％、优选地量为90至99.9重量％、更优选地量为95至99.8重量％、特别是量为97至99.7重量％、首选量为97.8至99.6重量％，且其中所述载体优选地基本上由石灰岩、特别是含有少部分硅藻土的石灰岩和/或植物油组成。
本发明的这些优选的组合物含有稳定化的菌株，可用于制备饲料和药物组合物以及饮用水和饲养用水，它们优选地包含本发明的菌株，其中菌株的量如前文所述。在优选的实施方式中，每吨饲料、饮用水或饲养用水中使用50至1000克的此类浓缩组合物、特别是50、100、250、500或1000克的此类浓缩组合物，以提供可用于饲养动物的组合物。这些浓缩组合物优选地包含本发明的至少一种菌株，菌株的量为每克所述浓缩组合物中1x109至2x1011CFU、特别是2x109至1x1011CFU。
以这些浓缩组合物作为起始物，通过将所述浓缩组合物与典型的饲料或食品组分混合，可分别制备饲料组合物和食品组合物。
本发明的组合物中可以含有的合适的典型动物饲料组分和/或可用于以本发明的浓缩组合物作为起始物来制备饲料组合物的合适的典型动物饲料组分包括以下一或多种：蛋白质、糖类、脂肪、其他益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节物、代乳品、矿物质、氨基酸、抗球虫药、基于酸的产品和/或药物，例如抗生素。
可以根据本发明使用的含糖类成分为，例如，草料、粗粮、粗麦粉、葵子饼粉或豆粕，以及它们的混合物。
可以根据本发明使用的含蛋白质成分为，例如，大豆蛋白、豌豆蛋白、面筋或玉米麸质，以及它们的混合物。
可以根据本发明使用的含脂肪成分具体为动物和植物来源的油，如植物油，例如大豆油、菜籽油、葵花籽油、亚麻籽油或棕榈油，以及鱼油，以及它们的混合物。
可以根据本发明使用的额外含有脂肪的含蛋白质成分为，例如，鱼粉、磷虾粉、双壳类动物粉、鱿鱼粉或虾壳，以及它们的组合。
可与本发明的菌株和制备物组合使用的可用于本发明的其他益生菌(DFM)优选地为选自以下菌种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus alevi、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis)、屎肠球菌和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。优选的实例是短小芽孢杆菌DSM 32539和枯草芽孢杆菌DSM32540(两者均依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定于2017年6月14日保藏于DSMZ)及其衍生菌、地衣芽孢杆菌DSM32314和枯草芽孢杆菌DSM 32315(两者均依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定于2016年5月12日保藏于DSMZ)及其衍生菌、枯草芽孢杆菌PB6(美国专利7,247,299已公开并保藏于ATCC，保藏号为PTA-6737，由Kemin出售，商标名为)、枯草芽孢杆菌C-3102(美国专利4,919,936已公开并以保藏号FERM BP-1096保藏于日本工业科学技术厅发酵研究院(Fermentation Research Institute，Agency of IndustrialScience and Technology，Japan)，由Calpis出售，商标名为)、枯草芽孢杆菌DSM 17299(由Chr.Hansen出售，商标名为)、地衣芽孢杆菌DSM 17236(由Chr.Hansen出售，商标名为)、地衣芽孢杆菌DSMZ 5749和枯草芽孢杆菌DSMZ5750的芽孢的混合物(由Chr.Hansen出售，商标名为YC)、枯草芽孢杆菌DSM 29784(由Adisseo/Novozymes出售，商标名为)、由Chr.Hansen出售的商标名为的枯草芽孢杆菌或美国专利6,849,256中公开的凝结芽孢杆菌菌株。可用于本发明组合物中的其他的非芽孢杆菌益生菌例如为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或汉逊酵母属(Hansenula)。特别是在食品组合物中可以使用的已知有益于人类健康的其他益生菌例如为产乳酸细菌、特别是乳酸杆菌，或双歧杆菌。如果所述其他益生菌不配制在本发明的组合物中，它们也可与本发明的组合物一起施用(同时或在不同的时间)。
可用于本发明的益生元优选地是寡糖、特别是选自低聚半乳糖、唾液酸寡糖、乳果糖、乳糖基蔗糖(lactosucrose)、低聚果糖、异麦芽酮糖或异麦芽糖寡糖、葡基蔗糖(glycosyl sucrose)、麦芽低聚糖、低聚异麦芽糖、环糊精、龙胆寡糖(gentiooligosaccharides)、大豆低聚糖、低聚木糖、葡聚糖、果胶、聚半乳糖醛酸多糖(polygalacturonan)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、甘露聚糖、半纤维素、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、抗性淀粉、蜜二糖、壳聚糖、琼脂糖、菊粉、塔格糖、葡聚糖和海藻酸。
可用于本发明的饲料组合物中且有助于消化饲料的酶优选地选自植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；半乳糖苷酶特别是α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶特别是磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、A2(EC 3.1.1.4)、C(EC 3.1.4.3)和D(EC 3.1.4.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；淀粉酶特别是α淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)；葡聚糖酶特别是β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC3.2.1.6)；葡糖淀粉酶；纤维素酶；果胶酶；或其任意组合。
商品化的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM Phytase(Novozymes)、P和HiPhosTM(DSM Nutritional Products)、NatuphosTM(BASF)、和Blue(ABEnzymes)、XP(Verenium/DuPont)和PHY(DuPont)。其他优选的植酸酶包括例如WO 98/28408、WO 00/43503和WO 03/066847中所公开的那些。
商品化的木聚糖酶的实例包括WX和G2(DSM Nutritional Products)、XT和Barley(AB Vista)、(Verenium)和XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，DuPont)。商品化的蛋白酶的实例包括ProAct(DSM NutritionalProducts)。
可用于本发明的维生素例如为维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K例如维生素K3、维生素B12、生物素、胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐例如D-泛酸钙，或其组合物。
可使用的免疫调节物例如为抗体、细胞因子、喷雾干燥血浆、白介素或干扰素，或其组合。
可用于本发明的矿物质例如为硼，钴，氯，铬，铜，氟，碘，铁，锰，钼，硒，锌，钙，镁，钾，或钠，或其组合。
可用于本发明的氨基酸例如为赖氨酸，丙氨酸，苏氨酸，蛋氨酸或色氨酸，或它们的组合。
因此，本发明的另一实施方式是制备动物饲料组合物的方法，包括将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制备物和/或至少一种浓缩组合物、特别是以有效增强动物健康、特别是肠道健康的量与饲料组分例如蛋白质、脂质和/或糖类相混合，且任选地与其他有益物质，优选地前述有益物质相混合，以提供饲料产品。该方法还可包含例如制粒步骤。
可以使用本领域人员已知的标准的制粒工艺，包括干燥或半湿润饲料的挤压加工。优选的制粒温度在大约65℃至大约120℃之间。
可按照本领域熟知的方法通过培养本发明的菌株而获得本发明的菌株和组合物，包括使用例如US 6,060,051、EP0287699或US2014/0010792中所描述的培养基和其他方法。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液面培养。发酵接近结束时，随着营养物质耗竭，菌株的细胞开始从生长期向芽孢形成期过渡，因此发酵终产物主要是芽孢、代谢物以及残余的发酵培养基。芽孢形成是这些菌株的天然生命周期的一部分，通常因细胞应答于营养缺乏而启动。发酵的设置是要获得高水平菌落形成单位的枯草芽孢杆菌细胞并促进芽孢形成。细菌细胞、芽孢和培养基中因发酵产生的代谢物可直接使用或通过常规的工业方法浓缩，例如离心、正切流动过滤、深层过滤和蒸发。浓缩的发酵肉汤进行洗涤，例如通过透析过滤法，以去除残余的发酵肉汤和代谢物。
可采用常规的干燥工艺或方法对添加或未添加载体的发酵肉汤或肉汤浓缩物进行干燥，例如喷雾干燥，冷冻干燥，托盘干燥，流化床干燥，桶干燥，或蒸发。由此产生的干性产品可被进一步加工，如制粉或造粒，以达到特定的颗粒尺寸或物理形式。如上所述，载体也可以在干燥后添加。
本发明的菌株的制备物可以是无细胞制备物或含有细胞碎片的制备物或含有完好细胞与细胞碎片混合物的制备物。可通过例如对发酵肉汤进行离心和/或过滤而获得本发明的无细胞的菌株制备物。取决于所使用的技术，这些无细胞制备物不一定完全弃除细胞，而是可以包含少量的细胞。鉴于细胞将化合物例如代谢物、酶和/或肽分泌至周围培养基中，因此细胞上清液包含所述细胞所分泌的此类化合物、特别是代谢物、酶和/或肽的混合物。因此，在本发明的优选的实施方式中，菌株的制备物是发酵肉汤的上清液。
可通过利用本领域人员已知的技术对细胞进行破坏，例如通过机械手段或施加高压的方式，获得包含菌株的细胞碎片的组合物。根据所施加的力的程度，得到只包含破裂的细胞的组合物或包含细胞碎片和完整细胞的混合物的组合物。可以实现细胞的均质化，例如利用一个弗氏细胞压碎器、超音波样品震碎机、匀化器、微流化器、球磨机、棒磨机、砾磨机、珠磨机、高压粉碎辊、垂直轴冲击器、工业搅拌机、高剪切混合器、搅拌桨混合机和/或均质机。合适的替代方法为对细胞进行酶和/或化学处理。
本发明的无细胞制备物也包含如下获得的制备物，首先通过应用之前提到的技术破碎细胞，然后移除细胞碎片和残留的完整细胞。特别是可以通过离心和/或过滤来移除细胞碎片和残留的完整细胞。
本发明的菌株的制备物可包含作为活性化合物的至少一种代谢物、特别是如下详述的代谢物的混合物，和/或选自蛋白酶、特别是枯草杆菌蛋白酶、木聚糖酶和/或纤维素酶的至少一种酶，和/或至少一种肽，和/或它们的组合。
可根据例如美国专利6,060,051中的方法获得含有本发明的菌株中所含的和/或前述细胞制备物中所含的有效代谢物混合物的制备物。具体而言，可以先使用有机溶剂例如乙酸乙酯使得前述制备物中所含的代谢物沉淀，随后在适当的溶剂中再溶解沉淀后的代谢物，来获得所述制备物。后续可采用分子筛过滤，基于分子量筛截将代谢物分成不同的级份，从而将代谢物纯化。
含有本发明的代谢物的有效混合物的制备物优选地包含本发明菌株的至少5种、更优选地至少6、7、8、9、10或12种、特别是所有的代谢物。菌株DSM 32592的代谢物的含量见表3.1。代谢物的分子量优选在500和4000Dalton之间、更优选地在800和3500Dalton之间。
优选地，根据本发明，在本发明的各种实施方式中总是使用有效量的本发明的菌株和/或制备物和/或组合物。术语“有效量”指的是相比于没有施用本发明的菌株和/或制备物和/或组合物，但除此之外施用相同饮食(包括饲料和其他化合物)的动物，该量给动物和/或给环境带来至少一种有益的效果、特别是在如前所述的那些方面。
就治疗用途而言，优选地使用治疗量的本发明的菌株和/或制备物和/或组合物。术语″治疗量″指的是足以在动物中减轻、逆转或预防疾病状态的量。通过评估，例如，不同剂量的组合物在(i)抑制或减少肠道内的致病菌、(ii)提高或保持有益菌的水平和/或(iii)增强动物健康、特别是肠道健康的能力，本领域人员能够容易地为不同动物确定优化的剂量水平。
实施例
实施例1：与在胃肠道中生存相关的菌株特征
筛选来自各种环境样品中的枯草芽孢杆菌菌株以便获得作为可直接饲喂给动物的微生物/益生菌的优越菌株。由于这种菌株的目的是在目标动物的肠道中充分发挥其潜力，因此，这种菌株被预先筛选，以抵抗各种环境和肠道相关的条件。产生菌株芽孢(Nicholson和Setlow 1990)，经洗涤后在80℃温浴20分钟(巴氏杀菌)，然后使用小牛肉浸液肉汤琼脂(VI，DifcoTM，no.234420，Becton Dickinson GmbH，Heidelberg，Germany)按1/10稀释度倒数的对数进行滴定。将无生长之前的次最高稀释物储存在-80℃并且作为标准化的起始点用于芽孢状态的所有进一步评估。为了模拟胃内通过情况(Argenzio 2004a；Trampel和Duke 2004)，基于Larsen等的文献(2014)评估了暴露于酸之后的存活情况。还测定了在低pH条件下的营养细胞的生长，其代表在胃/前胃和砂囊内条件下的生长情况，以及测定了在存在高达4mM的胆汁(B8631，CAS 8008-63-8，Sigma-Aldrich)且pH为7的条件下的营养细胞的生长，以便确认胃或砂囊排空之后的小肠近端部分处的菌株生长情况(Argenzio 2004b；Trampel和Duke 2004)。通过在厌氧条件下(AnaeroPakTM，Thermo FisherScientific)在补充有2.5mM KNO3的VI培养基(Glaser等1995)中接种标准化的芽孢溶液测定在厌氧菌小肠内的菌株适应性(Argenzio 2004b；Trampel和Duke 2004)。此外，在补充有1％脱脂奶粉(70166，Sigma-Aldrich)或0.1％不溶于水的AZCL-HE纤维素(I-AZCEL，Megazyme International，Bray，Ireland)的VI琼脂平板上测定了菌株的厌氧菌蛋白水解活性和纤维素水解活性。此外，在补充有0.1％不溶于水的AZCL-HE纤维素(I-AZCEL，Megazyme International，Bray，Ireland)的VI琼脂上测定了菌株的需氧菌纤维素水解活性。在有氧条件下24小时后琼脂出现蓝色代表纤维素酶活性。
通过在添加有10重量％NaCl(den Besten等2009)的VI琼脂上确定生长情况评估了肠道内存在的渗透压应激(osmotic stress)(Argenzio 2004b；Trampel和Duke 2004)。最后，通过将芽孢在99℃暴露20分钟(Palop等1996)随后接种于VI琼脂评估了芽孢的热稳定性，以确定其制粒稳定性。
枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592经受模拟的胃内通过存活了下来，观察到从pH 6开始该菌株可生长。在有氧条件下，菌株DSM 32592在存在2mM胆汁的情况下能够降解蛋白质和不溶于水的纤维素。DSM32592在厌氧条件下生长并且能够在厌氧条件下降解不溶于水的纤维素和蛋白质。菌株DSM 32592能够在存在2mM和4mM胆汁的情况下、在存在0.3重量％的猪胆汁的情况下和在存在0.3重量％的鸡胆汁的情况下、以及在存在5重量％NaCl的情况下生长。菌株DSM 32592的平均芽孢数达到了8.9x108CFU/mL，且菌株DSM 32592的芽孢在99℃暴露20分钟后是存活的。
参考文献：
Argenzio，R.A.(2004a).Secretion of the Stomach and Accessory Glands，p.405-418.In：Reece，W.O.(ed.)，Duke’s Physiology of Domestic Animals；TwelfthEdition，Chapter 25；Cornell University Press，Ithaca，New York，USA.
Argenzio，R.A.(2004b).Digestive and Absorptive Functions of theIntestines，p.419-437.In：Reece，W.O.(ed.)，Duke’s Physiology of DomesticAnimals；Twelfth Edition，Chapter 26；Cornell University Press，Ithaca，New York，USA.
Dawson，R.M.C.；Elliot，D.C.；Elliot，W.H.；Jones，K.M.(1986).Data forBiochemical Research；3rd edition，Oxford Science Publishing，United Kingdom.
Den Besten HMW，Mols M，Moezelaar R，Zwietering MH，Abee T.(2009).Phenotypic and transcriptomic analyses of mildly and severely salt-stressedBacillus cereus ATCC 14579cells.Appl Environ Microbiol.75：4111-9.
Glaser，P.，A.Danchin，F.Kunst，P.Zuber，and M.M.Nakano.(1995).Identification and isolation of a gene required for nitrate assimilation andanaerobic growth of Bacillus subtilis.J.Bacteriol.177：1112-1115
Nicholson W.L.，Setlow P.Sporulation，germination and outgrowth.In：Harwood C R，Cutting S M，editors.Molecular biological methods forBacillus.Chichester，England：John Wiley&Sons Ltd.；1990.pp.27-74.
Palop，A.，Raso，J.，Pagan，R.，Condon，S.and Sala，F.J.(1996).Influence ofpH on heat resistance of Bacillus licheniformis in buffer and homogenizedfoods.International Journal of Food Microbiology 29，1-10.
Trampel，D.W.and Duke，G.E.(2004).Avian Digestion，p.488-500.In：Reece，W.O.(ed.)，Duke’s Physiology of Domestic Animals；Twelfth Edition，Chapter 29；Cornell University Press，Ithaca，New York，USA.
实施例2：相对于现有动物营养用直接饲喂微生物(DFM)/益生菌的菌株性能比较——定量评估酶活性
比较菌株DSM32592、DSM17236和DSM17299以分别评价有氧条件下纤维素水解、木聚糖水解(xylanolytic)、蛋白质水解活性。纤维素水解和木聚糖水解活性通过如在Larsen等(2014)中描述的确定。对于蛋白质水解活性分析，如前所述，使菌株的起始和主培养物在VIB中37℃下生长。向含有20μL包含150mM氯化钠的20mM磷酸钠(dibasic，anhydrous)(所有成分来自Sigma-Aldrich)缓冲液的20μL 0.5％的荧光素异硫氰酸酯酪蛋白(FluoresceinIsothiocyanate Casein)(FITC；C3777，Sigma-Aldrich)溶液中加入10μL的主培养物，然后在37℃温育1小时。再加入150μL的10％(v/v)的三氯乙酸(Sigma-Aldrich)并在在37℃温育30分钟后，样品以19,000rpm离心15分钟，然后将2μL的上清转入200μL500mM的TRIS HCL溶液(Trizma Base TRIS，Sigma-Aldrich)。由于蛋白质水解释放的可溶性肽的荧光在494nm激发、518nm发射被确定(TECAN GENios Microplate Reader，Tecan Group Ltd.，Mannedorf，Switzerland)。进行三轮独立的分析，然后计算平均值，以毫单位/微升溶液表示。结果见表2.1。
表2.1.菌株DSM 32592、DSM 17299和DSM 17236的木聚糖酶、蛋白酶和纤维素酶活性
| 菌株 | 木聚糖酶活性(mU/mL) | 蛋白酶活性(mU/mL) | 纤维素酶活性(mU/mL) |
| DSM 32592 | 26.4±0.2 | 19.4±2.4 | 790±4 |
| DSM 17299 | 11.8±1.5 | 9.8±0.1 | 327±20 |
| DSM 17236 | 9.7±1.3 | 9.3±0.3 | 62±1 |
在直接比较中，与基准菌株DSM 17299和DSM 17236相比，菌株DSM 32592具有多于2倍的木聚糖酶、蛋白酶和纤维素酶活性增加。特别是与基准菌株DSM 17236相比，其具有多于10倍的纤维素酶活性增加。
参考文献：
Larsen，N.，Thorsen，L.，Kpikpi，E.N.，Stuer-Lauridsen，B.，Cantor，M.D.，Nielsen，B.，Brockmann，E.，Derkx，E.M.F.and Jespersen，L.(2014).Characterizationof Bacillus spp.strains for use as probiotic additives in pig feed.Appliedmicrobiology and biotechnology，98(3)，1105-1118.
实施例3：相对于现有动物营养用直接饲喂微生物(DFM)/益生菌的菌株性能比较——表达代谢物和抑制病原体
对比评价了菌株DSM 32592和野生型菌株DSM 10在相应培养基中表达的代谢物和所抑制的病原体各自的数量。对于代谢物表达分析，生长起始培养物并按照Scholz等(2011)所述进行测试。将10mL Luria Bertami Broth(LB，Thermo Fisher Scientific)培养物置于100mL培养瓶中于37℃和160rpm条件下生长24小时，然后取100μL转移至主培养物。将主培养物置于10mL含0.2mL/L KellyT微量金属溶液的LB(LBKelly，Scholz等2011)中或置于10mL添加有0.6％酵母提取物(Y1625，CAS 8013-1-2，Sigma-Aldrich)的TrypticaseSoy Broth(Oxoid，Thermo Fisher Scientific；所得肉汤简称TSBYE)中，均于37℃和160rpm条件下生长24小时，均使用100mL培养瓶。从主培养物取4mL与2mL正丁醇在15mL试管中混合，混匀3分钟，然后超声处理15分钟。5000rpm离心1分钟后转移有机相，真空干燥，并使用高效液相色谱-电喷射离子化质谱(HPLC-ESI-MS；Chen等2006)进行分析。每一样品均以阴性和阳性两种不同模式测量，并获得质谱。所得峰与Teo和Tan(2005)的报道类似，均转换为分子量(Da)。比较的结果见表3.1。
表3.1.(a)比较菌株DSM 32592和野生型菌株DSM 10分别在LBKelly和TSBYE中表达的代谢物(n/d表示没有检测到)
| 菌株 | 855Da | 930Da | 1008Da | 1022Da | 1026Da | 1036Da | 1040Da |
| DSM 10 | n/d | 有 | 有 | 有 | n/d | 有 | n/d |
| DSM 32592 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 |
(n/d代表未检测到)
表3.1.(b)比较菌株DSM 32592和野生型菌株DSM 10分别在LBKelly和TSBYE中表达的代谢物(n/d表示没有检测到)
| 菌株 | 1050Da | 1460Da | 1462Da | 1476Da | 1504Da | 1505Da | 3401Da |
| DSM 10 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 | n/d | 有 |
| DSM 32592 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 | 有 |
此外，使用孔扩散拮抗试验(Parente等1995)评估了由枯草芽孢杆菌继发产生的代谢物的病原体抑制作用，所述代谢物是表3.1中的部分代谢物，但未详细研究。
以7种不同的病原体进行了孔扩散拮抗试验：产气荚膜梭菌、难辨梭菌DSM 1296、耐久肠球菌DSM 20683、鹑鸡链球菌(Streptococcus gallinaceus)DSM 15349、猪链球菌ATCC 43765、结肠弯曲杆菌ATCC 33559(即，DSM 4689)和空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)DSM 24129和。
测试的两种致病性产气荚膜梭菌候选株是分离自猪的两种致病性产气荚膜梭菌田间分离株，获自RIPAC-LABOR GmbH(Potsdam-Golm，Germany)。来自Ripac的C型产气荚膜梭菌菌株的详情如下：菌株BB-081_Cpe和BB-031_Cpe分离自坏死性肠炎的猪的消化道。菌株BB-081_Cpe为cpb2阳性(Songer等2005)和netB阴性，而菌株BB-031_Cpe经测试为β2-毒素阳性(Allaart等2012)。
难辨梭菌是一种重要的新病原体，主要导致新生猪腹泻(Songer等2000)。受影响的小猪可能出现呼吸困难、腹胀和阴囊水肿。受影响的猪未必都出现腹泻。DSM 1296是难辨梭菌的已知类型菌株且产生细胞毒素。
耐久肠球菌已知引起仔鸡的跛行、关节炎和骨髓炎，这通常是由关节和/或骨组织炎症所致。此外，耐久肠球菌可引起心包炎症[Kense等2011]。DSM 20683分离自鸡的盲肠。
鹑鸡链球菌可引起家禽的败血症。大体病变包括脾肿大、肝肿大、肾肿大和充血。同时也观察到在肝脾内的多处坏死和/或梗死灶并伴有瓣膜心内膜炎[Collins等2002]。
猪链球菌是猪的重要病原体，并且在断奶后的猪仔中是最重要的细菌感染死亡原因之一，其导致败血症、脑膜炎和多种其他感染[Goyette-Desjardins等2014]。ATCC 43765属于血清群R血清变型2(Serological group：R；serovar 2)，分离自猪。
结肠弯曲杆菌是通过食物传播的细菌，多数人通常通过食用含有该细菌的猪肉而感染。其在人类引起胃肠炎和急性小肠结肠炎，也引起急性腹泻疾病[Fitzgerald等2007]。其主要宿主是猪，但也可感染人、鸟类以及许多其他动物。ATCC 33559分离自猪粪便。
空肠弯曲杆菌感染是世界上肠胃炎的最重要的普遍诱因(Acheson等2001)。感染由摄入受空肠弯曲杆菌污染的食物或水导致，空肠弯曲杆菌污染通常与家禽相关，并且其天然生长在许多鸟类(Colles等2009)(20-100％的零售鸡是受污染的)还有牲畜(特别是牛)的消化道内。其通常在鸟中不致病。一些空肠弯曲杆菌的菌株被报道在新孵化的鸡和幼禽中引起肠炎和死亡。DSM 24129分离自鸡。
将芽孢杆菌菌株在10mL TSBYE(30g/l TSB+6g/l酵母提取物)或LB-Kelly(LBMedia，补充了DSMZ培养基1032的微量元素溶液)中于37℃和200rpm生长16小时，使用100mL摇瓶。将致病菌株以液体培养物的形式生长于合适的条件下，直至595nm的光密度达到至少1，然后使用无菌抹刀将100μl培养物涂覆于琼脂平板表面。鹑鸡链球菌使用BHI琼脂平板，所有其他病原体使用TSBYE琼脂平板。在干燥之后的平板上切出三个直径为9mm的孔。第一个孔用作没有培养物的无接种的培养基对照，第二个孔接种100μL的非抑制性芽孢杆菌菌株(蜡状芽孢杆菌toyoi变种(B.cereus var.toyoi)NCIMB40112)，第三个孔接种100μL的枯草芽孢杆菌DSM 32592或DSM 17299培养物。在合适条件下37℃温育24小时之后，测量从切孔的边缘到清除区的边界的距离而确定清除带(mm)。每个菌落测量两次(水平，垂直)，然后取平均值。结果见下表。
麦3.2.通过孔扩散拮抗试验比较枯草芽孢杆菌DSM 32592、DSM 17236和DSM17299对致病性荚膜梭菌菌株的抑制能力，使用LB Kelly培养基，病原体清除带的数值以mm表示
结果显示DSM 32592能够非常有效地抑制产气荚膜梭菌和难辨梭菌的生长，特别是与DSM 17299相比。
表3.3.通过孔扩散拮抗试验比较枯草芽孢杆菌DSM 32592、DSM 17236和DSM17299对致病性葡萄球菌、链球菌和弯曲杆菌菌株的抑制能力，使用LB Kelly培养基，病原体清除带的数值以mm表示
结果显示DSM 32592能够非常有效地抑制鹑鸡链球菌、猪链球菌、结肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌的生长，特别是与DSM 17299相比。
表3.4.通过孔扩散拮抗试验比较枯草芽孢杆菌DSM 32592、DSM 17236和DSM17299对致病性耐久肠球菌菌株的抑制能力，使用TSBYE培养基，病原体清除带的数值以mm表示
结果显示DSM 32592能够非常有效地抑制耐久肠球菌的生长，特别是与DSM 17299相比。
参考文献
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实施例4：定性评估抗氧化酶活性
氧化应激过程中会存在活性氧分子，这可用由应激条件例如热应激所引起(Lin等，2006)，可导致DNA、蛋白质或脂质损害。益生菌可通过增强抗氧化酶活性而支持宿主的氧化防御体系(Aluwong等，2013；Mishra等，2015)。因此，测试了菌株DSM 32592的抗氧化酶活性，特别是超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。为了评价该菌株成熟生物膜的过氧化氢酶活性，将菌株置于含有补充了葡萄糖的LB培养基的摇瓶中于37℃和200rpm生长15小时。将培养物的光密度OD600调整至1.0，取10μl培养物点状接种于TSBYE(30g/lTSB+6g/l酵母提取物)或LB-Kelly(LB-Media，补充了DSMZ培养基1032的微量元素溶液)琼脂平板，在37℃有氧条件下以及在37℃和0.2％氧气条件下培养15小时。将3％H2O2(3％过氧化氢溶液，)滴加至菌落上，并分析过氧化氢酶活性。读取参数是自H2O2产生O2和H2O，导致在菌落上形成泡沫。
表4.1.评估在LB-Kelly或TSBYE培养基上在有氧条件下以生物膜形式生长的枯草芽孢杆菌菌株DSM32592菌落的过氧化氢酶活性
| 菌株ID | TSBYE | LB-Kelly |
| DSM 32592 | 有 | 有 |
枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592在有氧条件下生长时表现出过氧化氢酶活性。
表4.2.评估在LB-Kelly或TSBYE培养基上在0.2％氧气条件下以生物膜形式生长的枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592菌落的过氧化氢酶活性
| 菌株ID | TSBYE | LB-Kelly |
| DSM 32592 | 有 | 有 |
枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592在0.2％氧气条件下生长时也表现出过氧化氢酶活性。
还分析了从生长于有氧条件下的悬浮细胞(planktonic cells)中获得的蛋白质提取物的过氧化氢酶活性。将菌株DSM 32592置于含有补充了葡萄糖的LB培养基的摇瓶中于37℃和200rpm生长15小时。将8ml细胞培养物在4℃和3000rpm离心10分钟进行收集，将沉淀物重悬于pH 7.3的PBS中。使用Ribolyser获得可溶性细胞提取物。将破碎的细胞在4℃和13000rpm离心10分钟，上清液用于后续步骤。通过Bradford法确定蛋白质提取物的蛋白质浓度，使用牛血清白蛋白作为标准品(Bradford，1976)。以pH 7.3的PBS调整蛋白质提取物的浓度，将蛋白质提取物与非变性样品上样缓冲液(2x，VWR)混合，采用非变性凝胶电泳(10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，Biorad)在4℃分离蛋白质。然后通过在1％FeCl3和1％K3Fe(CN)6染色溶液中对凝胶进行染色而检测来自悬浮细胞的细胞提取物中的过氧化氢酶活性(Woodbury等，1971)。过氧化氢酶活性为可见的明亮条带。
| 菌株ID | LB加葡萄糖 |
| DSM 32592 | 有 |
枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592在所测试的这些特定条件下也表现出过氧化氢酶活性。
还分析了来自于生长于有氧条件下的细胞的蛋白质提取物的超氧化物歧化酶活性。通过前述方法获得细胞提取物，并采用非变性凝胶电泳在4℃分离蛋白质。通过基于Beauchamp和Fridovich(1971)而改良的四唑氮蓝染色方法对凝胶进行染色而检测超氧化物歧化酶活性。
| 菌株ID | LB加葡萄糖 |
| DSM 32592 | 有 |
枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592在测试条件下表现出超氧化物歧化酶活性。
参考文献
Aluwong，T.；Kawu，M.；Raji，M.；Dzenda，T.；Govwang，F.；Sinkalu，V.and Ayo，J.(2013).Effect of Yeast Probiotic on Growth，Antioxidant Enzyme Activities andMalondialdehyde Concentration of Broiler Chickens.Antioxidants 2：326-339.
Beauchamp，C.and Fridovich，I.(1971).Superoxide dismutase：improvedassays and an assay applicable to acrylamide gels.Anal.Biochem.44：276-287.
Bradford，M.M.(1976).A rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dyebinding.Anal.Biochem.72：248-254.
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Mishra，V.；Shah，C.；Mokashe，N.；Chavan，R.；Yadav，H.and Prajapati，J.(2015).Probiotics as potential antioxidants：a systematic review.J.Agric.FoodChem 63：3615-3626
Woodbury，W.；Spencer，A.K.and Stahmann，M.A.(1971).An improved procedureusing ferricyanide for detecting catalase isozymes.Anal.Biochem.44：301-305.
实施例5：检测乳酸盐产量
体外研究已发现低分子量物质可介导对病原体复制的抑制作用(2010)，其中排在前列的是短链脂肪酸，例如乳酸(2010)。其病原体抑制作用的可能解释可以是通过产生乳酸而降低pH(Fuller 1992)。乳酸细菌(也用作动物饲料中的益生菌)已知其发酵碳水化合物产生的主要终产物为乳酸(Halasz 2009)。发现枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592在体外能够产生乳酸盐。
比较评估了枯草芽孢杆菌菌株DSM 32592和Bacillus toyonensis(一种已知产生乳酸的芽孢杆菌益生菌)的厌氧菌乳酸盐产量。如下测定乳酸盐产量：将菌株预培养物置于10mL TSBYE(30g/l TSB+6g/l酵母提取物)中于37℃有氧条件下生长过夜。将OD600为0.2的主培养物接种于补充了25g/l的蔗糖和5mM KNO3的10ml TSBYE中，置于15ml离心管(FalconTubes)中在37℃生长48小时，无摇动。使用HPLC-UV测量上清液中的乳酸盐。
| 乳酸盐产量％ | |
| Bacillus toyonensis | 100.00 |
| DSM 32592 | 159.27 |
菌株枯草芽孢杆菌DSM 32592产生的乳酸盐比Bacillus toyonensis的益生菌菌株多了将近50％。
参考文献
A Halasz(2009)Book：Food quality and standards Volume III；EOLSSPublishers Co Ltd.Chapter：Lactic acid bacteria.
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R Fuller 1992 Publisher：Springer science and business media DordrechtBook：Probiotics：The scientific basis Chapter 9.8 Antimicrobial activity.
Claims (17)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或其制备物，其选自如下一组：
a)以保藏号DSM 32592保藏于DSMZ的枯草芽孢杆菌菌株；
b)保藏号为DSM 32592的枯草芽孢杆菌菌株的突变株，其具有菌株DSM 32592的全部识别特征；
c)(a)或(b)的制备物；
d)含有(a)、(b)或(c)中所含化合物的有效混合物的制备物。
2.权利要求1(b)的DSM 32592的枯草芽孢杆菌突变株，其中所述突变株与菌株DSM32592具有至少95％的DNA序列相同性。
3.枯草芽孢杆菌菌株或其制备物，其中所述枯草芽孢杆菌菌株具有至少一种以下特征，优选地具有全部以下特征：
a)16S rDNA序列，其与SEQ ID NO：1的多核苷酸序列具有至少99.5％、优选地至少99.8％、首选100％的序列相同性；
b)yqfD序列，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有至少99.5％、优选地至少99.8％、首选100％的序列相同性；
c)gyrB序列，其与SEQ ID NO：3的多核苷酸序列具有至少99.5％、优选地至少99.8％、首选100％的序列相同性；
d)rpoB序列，其与SEQ ID NO：4的多核苷酸序列具有至少99.5％、优选地至少99.8％、首选100％的序列相同性；
e)groEL序列，其与SEQ ID NO：5的多核苷酸序列具有至少99.5％、优选地至少99.8％、首选100％的序列相同性。
4.前述权利要求中任一项的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于能够厌氧生长，特别是能够在厌氧条件下降解不溶于水的纤维素和蛋白质。
5.前述权利要求中任一项的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于能够抑制以下至少一种菌株的生长、优选地抑制以下全部菌株的生长，所述菌株选自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)BB-081_Cpe；产气荚膜梭菌BB_031_Cpe；难辨梭菌(Clostridium difficile)DSM 1296；鹑鸡链球菌(Streptococcus gallinaceus)DSM 15349；猪链球菌(Streptococcus suis)DSM 9682；结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)DSM 4689、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)DSM 24129和耐久肠球菌(Enterococcus cecorum)DSM 20683。
6.前述权利要求中任一项的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于具有至少一种以下酶活性、优选地具有全部以下酶活性：纤维素酶活性；木聚糖酶活性；过氧化氢酶活性；蛋白酶活性；过氧化氢酶活性；超氧化物歧化酶活性。
7.前述权利要求中任一项的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于能够在存在2mM的胆汁的情况下生长，优选地能够在存在4mM的胆汁的情况下生长，和/或能够在存在0.3重量％的猪胆汁和/或0.3重量％的鸡胆汁的情况下生长。
8.前述权利要求中任一项的枯草芽孢杆菌菌株或其制备物作为益生菌组分(DFM)在饲料或食品中的用途。
9.饲料或食品组合物，其含有权利要求1至7中任一项的枯草芽孢杆菌菌株或其制备物和至少一种其他饲料或食品组分，所述组分优选地选自蛋白质、糖类、脂肪、其他益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节物、代乳品、矿物质、氨基酸、抗球虫药、基于酸的产品、药物及其组合。
10.药物组合物，其含有权利要求1至7中任一项的枯草芽孢杆菌菌株或其制备物和药用可接受载体。
11.权利要求9或10的组合物，用于改善动物或人的健康状况、特别是肠道健康状况。
12.饲养动物、特别是猪或禽的方法，其特征在于给所述动物施用权利要求1至7中任一项的枯草芽孢杆菌菌株或制备物和/或权利要求9的饲料组合物和/或权利要求10的药物组合物。
13.改善动物或人的健康状况、特别是肠道健康状况的方法，包括给所述动物或人施用权利要求1至7中任一项的枯草芽孢杆菌菌株或制备物或权利要求9至11中任一项的组合物。
14.增强动物健康和/或改善动物的一般身体状况和/或改善动物的饲料转化率和/或降低动物死亡率和/或提高动物存活率和/或改善动物增重和/或提高动物疾病抵抗力和/或提高动物免疫应答和/或给动物建立或维持健康肠道菌群和/或减少病原体通过动物粪便散布的方法，其中给动物施用至少一种权利要求1至7中任一项的菌株和/或至少一种权利要求1至7中任一项的制备物或至少一种权利要求9至11中任一项的组合物。
15.控制和/或避免粪肥或污染液体对环境的有害影响的方法，所述方法包括给粪肥、污染液体、排泄物、坑或贮粪池施用至少一种权利要求1至7中任一项的菌株和/或至少一种权利要求1至7中任一项的制备物和/或至少一种权利要求9至11中任一项的组合物的步骤。
16.控制和/或改善水或水溶液、特别是饮用水或饲养用水的质量的方法，所述方法包括给水或水溶液施用至少一种权利要求1至7中任一项的菌株和/或至少一种权利要求1至7中任一项的制备物和/或至少一种权利要求9至11中任一项的组合物的步骤。
17.治疗和/或预防栽培植物的微生物病害的方法，包括给所述栽培植物施用至少一种权利要求1至7中任一项的菌株和/或至少一种权利要求1至7中任一项的制备物和/或至少一种权利要求9至11中任一项的组合物的步骤。
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