CN116478859A - 耐受次氯酸水的乳酸菌和微生物制剂及其应用 - Google Patents

耐受次氯酸水的乳酸菌和微生物制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及耐受次氯酸水的乳酸菌和微生物制剂及其应用。所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括保藏编号为CCTCC NO：M 2023072的发酵乳酸杆菌MBH1‑1、保藏编号为CCTCC NO：M 2023074的副干酪乳杆菌MBH3‑2、保藏编号为CCTCCNO：M 2023075的副干酪乳杆菌MBH3‑3、保藏编号为CCTCC NO：M 2023073的植物乳杆菌MBH2‑1和保藏编号为CCTCC NO：M 2023076的植物乳杆菌MBH5‑1的至少一种。本发明菌株具有良好次氯酸耐受性，较好的耐酸与耐胆盐、疏水性及自凝聚能力，能够在生理酸性胁迫和胆盐胁迫下存活且实现在肠道定植和繁殖，发挥益生功能。

Description

耐受次氯酸水的乳酸菌和微生物制剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及耐受次氯酸水的乳酸菌和微生物制剂及其应用。
背景技术
随着畜禽养殖业提倡绿色、健康、无污染的发展理念，开始大规模推广应用具备无残留、无毒害、无耐药性的生物发酵饲料。生物发酵饲料是一种取代或平衡或调解动物生态系统的一种或多种菌系的微生物制品，益生菌作为抗生素的替代品，在生物发酵饲料中应用广泛。已经被证明是益生菌的菌株中，大部分属于乳酸菌。大量研究表明，乳酸菌自然定植于动物体的消化道中，是动物肠道中的正常菌群，其在肠粘膜表面定植占位，可调控畜禽机体胃肠道菌群结构及生物屏障的构建；还能产生多种抑菌因子，抑制肠道内病原体恶性竞争，减少腐败衰退产物，进而调整微生态环境平衡；同时对机体的应激反应、毒性反应、免疫应答等作出反馈。
微酸性次氯酸水是指pH值控制在6.20-6.80之间的一种具有瞬时、广谱、高效、廉价、安全无污染无残留特性的新型消毒剂，日本厚生劳动省于2002年将其认定为食品添加剂。微酸性次氯酸水的有效成分为次氯酸(HClO)，1976年，首次证实人体天然免疫中可以产生次氯酸，在生物学系统中，中性粒细胞来源的髓过氧化物酶与过氧化氢共同作用下，使氯离子发生氧化反应产生次氯酸。与普通酸性环境不同的是，次氯酸不仅可以破坏微生物的细胞壁，而且由于分子小，不带电荷，很容易侵入微生物细菌的体内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶，使糖代谢失调而死亡，因此，次氯酸对细菌、病毒、真菌甚至芽孢具有广谱的杀灭作用，其杀菌性与浓度大小呈正相关。
微酸性次氯酸水广泛应用在医疗、食品加工、蔬果清洗、畜牧养殖等领域，达到杀菌消毒、改善消化道环境、增强免疫力的作用，具有安全、高效、经济的特点，而且由于低浓度微酸性次氯酸水温和的氧化还原特性，可代替粉状饲料饲用前拌入的普通水，也可直接作为饮用水饮用。然而因其具有杀菌性，在杀灭机体肠道内有害菌的同时，在一定程度上也会对肠道内的有益菌造成负面影响。目前，鲜有研究表明乳酸菌具有次氯酸水耐受性，因而现有的乳酸菌益生菌较难应用于微酸性次氯酸水拌和饲料或者采用微酸性次氯酸水杀菌的场景，限制了特定场景下其益生功能的发挥。因此，筛选出能够耐受次氯酸水的益生性乳酸菌，将其作为饲用添加剂与次氯酸水协同应用于畜禽产业中，能够更好的发挥二者的特性，对改善畜禽的胃肠道健康及畜禽产品品质，实现畜禽产业绿色、无公害、健康生产具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中乳杆菌不耐受微酸性次氯酸水、难以应用于微酸性次氯酸水存在场景下的问题，本发明提供了多株耐受次氯酸水的乳酸菌，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面提供了一种耐受次氯酸水的乳酸菌，包括发酵乳酸杆菌MBH1-1、副干酪乳杆菌MBH3-2、副干酪乳杆菌MBH3-3、植物乳杆菌MBH2-1和植物乳杆菌MBH5-1的至少一种；所述发酵乳酸杆菌MBH1-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023072，所述副干酪乳杆菌MBH3-2的保藏编号为CCTCC NO：M 2023074，所述副干酪乳杆菌MBH3-3的保藏编号为CCTCC NO：M 2023075，所述植物乳杆菌MBH2-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023073，所述植物乳杆菌MBH5-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023076。
以上五株乳酸菌的生物学特性如下：
形态特征：五株菌在固体培养基上的形态具体见图1和表1，均呈现乳酸菌各种属细菌的典型培养特征。
表1菌落培养特征
菌种编号 边缘整齐度 光滑度 黏稠度 菌落颜色 透明度 表面凸起
MBH1-1 整齐 光滑 粘稠 乳白色 不透明 凸起
MBH2-1 整齐 光滑 不粘稠 乳白色 不透明 凸起
MBH3-2 整齐 不光滑 不粘稠 白色 微透明 凸起
MBH3-3 不规则 不光滑 不粘稠 白色 微透明 凸起
MBH5-1 整齐 光滑 不粘稠 乳白色 不透明 凸起
生理生化特征：菌株革兰氏染色阳性(见图2)，无芽孢，接触酶阴性。
16S rDNA基因序列测序：对16s rDNA基因序列进行同源比对分析，选取不同的模式菌株，采用MEGA 11.0构建系统发育树(见图4)，确定菌株MBH1-1与发酵乳酸杆菌聚集在同一分支，菌株MBH2-1和MBH5-1与植物乳杆菌聚集在同一分支；菌株MBH3-2和MBH3-3与副干酪乳杆菌聚集在同一分支。
本发明从自然传统发酵制品中分离出乳酸菌，通过对分离株的次氯酸水耐受性试验，获得具有良好次氯酸耐受性的五株菌，其中发酵乳酸杆菌MBH1-1和副干酪乳杆菌MBH3-2能够耐受的次氯酸水质量浓度最高为20mg/L，植物乳杆菌MBH2-1、植物乳杆菌MBH5-1和副干酪乳杆菌MBH3-3能够耐受的质量浓度最高为10mg/L，而且，通过模拟畜禽胃肠道的环境实验，五株菌还具有较好的耐酸与耐胆盐能力，可在胃肠道的恶劣环境下生存，且具有优良的疏水性与自聚合能力，对肠道有很好的粘附能力，有利于实现在肠道定植和繁殖，进而发挥乳杆菌的益生功能，因而可作为潜在的益生菌制剂如饲料添加剂与次氯酸水协同应用于畜禽产业。
进一步地，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括发酵乳酸杆菌MBH1-1。
进一步地，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括副干酪乳杆菌MBH3-2。
进一步地，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括副干酪乳杆菌MBH3-3。
进一步地，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括植物乳杆菌MBH2-1。
进一步地，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括植物乳杆菌MBH5-1。
本发明的第二方面提供了一种微生物制剂，包括如上所述的耐受次氯酸水的乳酸菌和可接受的辅料。
可接受的辅料是指不干扰活性成分—乳酸菌的生物活性的效力并在其施用的浓度下对机体(包括人体或动物体)不具有明显毒性的组分，包括溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、赋形剂、调味剂、保护剂等中的任意一种或至少两种的组合。将上述组分用于微生物制剂是本领域所熟知的。如溶剂或分散剂可包括无菌水、生理盐水、常用培养基如LB培养基和MRS培养基，也包括由这些溶剂或分散剂组成的混合物。保护剂可包括甘油、海藻酸钠、聚乙烯醇等冻干或冻存保护剂。通过前述可接受的辅料可将本发明的乳杆菌制备成固体制剂或者液体制剂。
所述微生物制剂相对于现有技术的优势与如上所述的耐受次氯酸水的乳酸菌相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
进一步地，所述微生物制剂为液体制剂，耐受次氯酸水的乳酸菌的菌悬液浓度为109CFU/mL。
本发明的第三方面提供了如上所述的耐受次氯酸水的乳酸菌或者如上所述的微生物制剂在食品添加剂、饲料添加剂或调节肠道菌群保健品中的应用。
所述耐受次氯酸水的乳酸菌或者微生物制剂在食品添加剂、饲料添加剂或调节肠道菌群保健品中的应用相对于现有技术的优势与如上所述的耐受次氯酸水的乳酸菌相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的五株菌具有良好次氯酸耐受性，其中，发酵乳酸杆菌MBH1-1和副干酪乳杆菌MBH3-2能够耐受的次氯酸水质量浓度最高为20mg/L，植物乳杆菌MBH2-1、植物乳杆菌MBH5-1和副干酪乳杆菌MBH3-3能够耐受的质量浓度最高为10mg/L，而且，通过模拟畜禽胃肠道的环境实验，五株菌还具有较好的耐酸与耐胆盐能力、疏水性及自凝聚能力，能够在正常生理酸性胁迫和胆盐浓度胁迫后在肠道中存活且实现在肠道定植和繁殖，进而发挥其益生功能，本发明为与次氯酸水协同应用于畜禽产业提供了优良菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的耐受次氯酸水的乳酸菌菌株的菌落形态图；
图2为本发明实施例1的耐受次氯酸水的乳酸菌菌株的革兰氏染色图；
图3为本发明实施例1的耐受次氯酸水的乳酸菌菌株对次氯酸的耐受结果图；
图4为本发明实施例1的耐受次氯酸水的乳酸菌菌株的系统发育树图；
图5为本发明实施例2的耐受次氯酸水的乳酸菌菌株的疏水性测试图；
图6为本发明实施例2的耐受次氯酸水的乳酸菌菌株的自凝聚能力随时间变化曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
本发明以下实施例使用的相关培养基和主要试剂配方如下：
(1)MRS固体培养基：称取牛肉浸粉10g、蛋白胨10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、磷酸氢二钾2g、吐温-80 1mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.1895g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，调节pH值6.4，121℃灭菌15min，备用。
(2)MRS液体培养基与上述MRS固体培养基的区别在于不加入琼脂。
(3)次氯酸水的制备：采用WLY-210非电解微酸性次氯酸水发生器，用质量分数6％的次氯酸钠和质量分数6％的盐酸分别制备10、20、30mg/L的次氯酸水，设备设置参数为如下：
表2次氯酸水的制备参数
次氯酸质量浓度(mg/L) pH值 NaClO设定值 HCl设定值
10 6.42 66 38
20 6.44 42 29
30 6.43 30 28
(4)供试菌液的配制：将第三代活化的菌株5000r/min离心8min，之后用灭菌生理盐水清洗菌体3次，调至菌悬液浓度为109CFU/mL，备用。
(5)中和剂的配制：十二水磷酸氢二钠7.14g、磷酸二氢钾1.36g、硫代硫酸钠1.56g、蒸馏水1000mL，调节pH值7.0，121℃灭菌15min，备用。
(6)模拟酸环境的配制：在MRS液体培养基中加入1mol/L的HCl，使其pH值分别为2.0、2.5和3.0，121℃灭菌15min，冷却备用。
(7)模拟胆盐的配制：在MRS液体培养基中加入牛胆盐，使其质量浓度为0.3g/100mL，121灭菌15min，冷却备用。
(8)无菌PBS的配制：氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.4，121℃灭菌15min，备用。
实施例1耐受次氯酸水的乳酸菌的筛选鉴定
采用传统涂布平板分离法从自然传统发酵制品采集的样品中分离乳酸菌，在体外试验将菌株采用次氯酸水进行初筛处理，筛选出具有耐受能力的菌株，之后通过模拟畜禽胃肠道的环境来筛选具有耐酸耐胆盐能力的菌株，通过对菌株疏水性和自凝聚能力的试验，筛选出具有高肠道粘附力的菌株。具体通过以下步骤获得：
S1、样品采集：将内蒙古自治区不同地区的自然传统发酵制品存放于灭菌的采样瓶中，置于4℃条件下保存，具体样品采集信息见表3。
表3样品采集信息
S2、乳酸菌的分离纯化：将采集到的样品置于无菌超净工作台中，使用生理盐水，将样品十倍梯度稀释，取稀释液0.1mL均匀涂布在含有2％碳酸钙的MRS固体培养基上，于37℃培养箱中培养48h。培养完成后，挑取培养基中有明显溶钙圈的不同形态的黄色单一菌落接种在相应的MRS液体培养基中增菌培养24h，再次划线接种在MRS固体培养基上培养48h，直至分离纯化3次，共分离出八株疑似乳酸菌菌株。将分离获得的菌株与50％甘油按照7：3的比例混匀置于2mL冻存管中，保存于-80℃的冷冻冰箱中备用。
S3、乳酸菌生理生化鉴定：将八株菌进行革兰氏染色，结果为紫色，呈革兰氏染色阳性反应(见图2)，之后对八株菌进行乳酸菌典型生理生化反应—过氧化氢酶触试验，结果表4。
表4过氧化氢酶触试验产气结果
菌株编号 有无产气 菌株编号 有无产气
MBH1-1 无 MBH3-2 无
MBH1-2 无 MBH3-3 无
MBH2-1 无 MBH5-1 无
MBH3-1 无 MBH5-2 无
八株菌分别与3％过氧化氢溶液接触后，不产生气泡，由此可以判断出这8株菌过氧化氢酶触试验呈阴性，符合乳酸菌特征。
S4、对菌株的次氯酸水耐受性能进行测试：将供试菌液按体积比1：1，分别加入到2mL不同质量浓度(10、20、30mg/L)的次氯酸水中处理2h，取混合液1mL加入到9mL的中和剂中作用10min后，进行梯度稀释，之后取0.1mL涂布平板后恒温培养箱37℃培养48h，对照组为0.85％的生理盐水。以全自动菌落计数器进行计数，计算得出菌落对数值，并计算存活率。
菌落对数值＝lgA1或lgA2；
存活率＝10A2/10A1×100，致死率＝1-存活率；
其中，对照组记为A1，处理组记为A2。
八株乳酸菌对不同质量浓度的次氯酸水耐受程度如图3所示。随着次氯酸水质量浓度的增加，八株菌较对照组的菌落对数值都有所降低，尤其在质量浓度为30mg/L，所有菌株的对数值都有明显的降低，致死率达97.62％-99.98％，表明八株菌在此质量浓度下均不耐受。其中，MBH1-1、MBH3-2在20mg/L处理下依然保持较高的菌落对数值，菌落对数值较对照组下降范围控制在0.34lg(CFU/mL)以内，即存活率为45.66％以上。而菌株MBH2-1、MBH3-3、MBH5-1在10mg/L的质量浓度下，菌落对数值下降范围在0.24lg(CFU/mL)以内，即存活率为57.29％以上，表明这五株乳酸菌具备耐受次氯酸水的能力。
S4、16S rDNA基因序列鉴定：提取上述五株乳酸菌的基因组DNA做模板，选择16SrDNA基因通用引物27f和1492r进行16S rDNA基因序列的PCR扩增。扩增条件：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，90s，34个循环；72℃，5min。之后将扩增条带送往公司测序，MBH1-1的16SrDNA见SEQ ID NO：1所示，MBH2-1的16SrDNA见SEQ ID NO：2所示，MBH3-2的16SrDNA见SEQ ID NO：3所示，MBH3-3的16SrDNA见SEQ ID NO：4所示，MBH5-1的16SrDNA见SEQ ID NO：5所示。将测序结果在NCBI网站的GenBank数据库进行Blast分析，根据基因序列相似性比对，选取不同的模式菌株，采用MEGA 11.0构建系统发育树(见图4)。
基于形态特征、生理生化分析、16S rDNA基因序列等多项分析，本发明新分离的菌株MBH1-1为发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)；菌株MBH2-1和MBH5-1为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)；MBH3-2和MBH3-3为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)。
保藏说明：发酵乳酸杆菌(Limosilactobacillus fermentum)MBH1-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023072，副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)MBH3-2的保藏编号为CCTCC NO：M 2023074，副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)MBH3-3的保藏编号为CCTCC NO：M 2023075，植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)MBH2-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023073，植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)MBH5-1保藏编号为CCTCC NO：M 2023076。五株菌均保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2023年1月11日。
实施例2益生性能测试
判定益生菌制剂是否具有功能效果，关键是在胃肠道内是否能存活并发挥作用。消化道内低pH值、胆汁酸(胆盐)等均对益生菌的活性产生很大的影响，尤其是在胃的低pH值、小肠的胆汁酸(胆盐)侵蚀环境中，益生菌若被大量杀死，仅余极少量等进入肠道，将难以形成优势菌群，进而丧失其应有的益生效果，因此，益生菌能够在宿主体内有多大程度的存活量，和到达部位后的繁殖能力决定着其对宿主提供益处的力度或效果，这就要求乳酸菌能够通过上消化道以大量的存活菌到达肠道并且定植于肠粘膜，因而乳酸菌对低酸性和高胆盐的耐受性以及在肠道的定植能力是乳酸菌能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。
1、耐酸性试验
将试验菌株以2％(v/v)的接种量分别接种于pH值为2.0、2.5、3.0的无菌MRS液体培养基中，同时分别划线培养于不同pH值的无菌MRS固体培养基中，37℃恒温培养16-18h，以未接种的无菌MRS液体培养基为空白对照，测量OD595nm值，结果见表5。
表5乳酸菌耐酸性试验结果
注：(1)“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长；(2)数据以x±SD表示；(3)标有不同字母表示不同菌株同一pH间具有显著性差异，p<0.05。
细菌在经由胃部到达肠道的过程中，影响其活性的主要因素是胃液的pH值。动物胃中的pH值范围常在2-7之间，一般为3.0。乳酸菌发挥作用的前提是能够存活于畜禽胃肠道中，需要具有一定的耐酸能力。对于五株乳酸菌来说，pH值在3.0和2.5的条件下都具有较高的存活量且MRS平板上都生长有相应菌落，说明对酸具有较好的耐受性。在pH值为2.0时，乳酸菌MBH2-1、MBH3-2、MBH3-3对应的MRS平板上均长出菌落，耐酸能力优于MBH1-1和MBH5-1，说明这些菌株可在胃酸环境中保持较高的活性。
2、耐胆盐试验
将供试菌液按2％(v/v)的接种量接种于胆盐浓度为0.3％(W/V)的无菌MRS液体培养基中37℃培养16-18h，测定其在OD630nm值，同时划线培养于胆盐浓度为0.3％(W/V)的无菌MRS固体培养基，37℃培养16-18h，结果见表6。
表6乳酸菌耐胆盐能力试验结果
菌株编号 OD630nm MRS平板
MBH1-1 0.054±0.007a -
MBH2-1 0.165±0.009b +
MBH3-2 0.183±0.021b +
MBH3-3 0.159±0.007bc +
MBH5-1 0.154±0.011c +
注：(1)“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长；(2)数据以x±SD表示；(3)标有不同字母表示不同菌株同一pH间具有显著性差异，p<0.05。
胆盐的耐受性是检测乳酸菌益生作用的重要指标之一。畜禽消化道中的胆盐含量为0.03-0.3％，为筛选出性能更好的菌株，因此选定胆盐添加量为0.3％进行试验。OD630nm值大于0.05，表明菌株在0.3％胆盐的环境中长势良好。由表4数据可知，五株菌中MBH1-1耐受胆盐的能力较弱，而其它四株菌耐受能力较强，在添加0.3％胆盐的MRS固体培养基上长势良好，菌落布满平板，说明菌株在一定程度上可有效消除胆盐胁迫所带来的不利影响，在此胆盐质量浓度条件下存活下来的菌体细胞能保持较好的活性且呈现生长趋势，其中MBH3-2的OD630nm值最大，表现出最优的胆盐耐受性。
3、疏水性测定
粘附特性影响益生菌在肠道定植，是评价乳酸杆菌益生功能的重要指标之一。研究表明微生物细胞表面疏水性和自凝聚能力对菌株的粘附性起着主要的作用，疏水性和自聚能力较高的乳酸菌在肠道中也呈现较高的粘附性，即菌体表面疏水性和自聚能力与其对肠道上皮细胞的粘附力成正比。本实施例通过乳酸菌对碳氢化合物的亲和力反映菌株表面疏水性，采用微生物黏着碳氢化合物法测定乳酸菌细胞表面疏水性。
将供试菌液各10mL至离心管中，在9500r/min离心10min，弃上清液，收集菌体沉淀，再加入等量的无菌PBS缓冲溶液洗涤两次。随后，用无菌PBS缓冲溶液调整OD600nm至0.6±0.05。取4mL调整浊度后的菌液，加入0.8mL二甲苯，高速涡旋2min，静置10min分层，取下层水相在OD600nm波长处测其吸光值。按以下公式计算乳酸菌细胞表面疏水性：
表面疏水性＝(原样OD600-水相OD600)/原样OD600。
一般情况下，当疏水率大于50％时，菌株被认为是高度疏水的；当疏水率在20％-50％时，菌株被认为是中度疏水的；当疏水率小于20％时，则被认为是低疏水性的。五株乳酸菌的疏水性如图5所示。由图可知五株菌的疏水率在20.79％-62.12％之间，具有良好的疏水性。其中菌株MBH3-3对二甲苯的吸附能力较强，疏水率最高，达到62.12％，其次是MBH3-2，为54.70％，MBH5-1疏水率最低。
4、自凝聚能力测定
除了疏水性，自凝聚能力同样对于乳酸菌向肠道上皮细胞的顺利粘附和稳固定植至关重要。将供试菌液各10mL至离心管中，在9500r/min的条件下离心10min，弃上清液，收集菌体沉淀，再加入等量的无菌PBS缓冲溶液洗涤两次。随后，用无菌PBS缓冲溶液调整OD600nm至0.6±0.05(A0)。菌悬液室温下放置，在第2、4、6、12、24h时吸取培养液，于OD600nm下测定吸光值At，再进行重复试验测定，按以下公式计算乳酸菌凝聚能力：
自凝聚能力＝(A0-At)/A0。
五株乳酸菌的自凝聚能力如图6所示。从图中可以发现，五株菌的自凝聚力随着时间增加呈非线性升高的趋势。菌株MBH3-2的自凝聚力在五株菌中最强，2h就可以迅速达到平台期，约为73.51％，且在24h时达到最大，约为97.29％。其它菌株在静置的2-12h期间，自凝聚能力有所增加但差异不大，至24h则均迅速增加到40.93％以上。
以上结果说明，本发明新分离的五株乳酸菌具有较强的耐酸性和耐胆盐性，能够在正常生理酸性胁迫和胆盐浓度胁迫后在肠道中存活，经过胃酸和胆汁后达到肠道时仍然具有较高的存活率，而且均具有优异的表面疏水性和良好的自凝聚性，对肠道有很好的粘附能力，有利于定植肠道发挥功能，使其有望作为微生物益生菌与次氯酸水协同应用于畜禽产业或食品中，调节机体肠道菌群生态健康。五株菌中，菌株MBH3-2对次氯酸耐受浓度高，对抗酸性褐胆盐环境胁迫能力强，且疏水性和凝聚性好，为今后与次氯酸水协同应用于畜禽产业提供了优良菌株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种耐受次氯酸水的乳酸菌，其特征在于，包括发酵乳酸杆菌MBH1-1、副干酪乳杆菌MBH3-2、副干酪乳杆菌MBH3-3、植物乳杆菌MBH2-1和植物乳杆菌MBH5-1的至少一种；
所述发酵乳酸杆菌MBH1-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023072，所述副干酪乳杆菌MBH3-2的保藏编号为CCTCC NO：M 2023074，所述副干酪乳杆菌MBH3-3的保藏编号为CCTCCNO：M 2023075，所述植物乳杆菌MBH2-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023073，所述植物乳杆菌MBH5-1的保藏编号为CCTCC NO：M 2023076。
2.根据权利要求1所述的耐受次氯酸水的乳酸菌，其特征在于，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括发酵乳酸杆菌MBH1-1。
3.根据权利要求1所述的耐受次氯酸水的乳酸菌，其特征在于，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括副干酪乳杆菌MBH3-2。
4.根据权利要求1所述的耐受次氯酸水的乳酸菌，其特征在于，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括副干酪乳杆菌MBH3-3。
5.根据权利要求1所述的耐受次氯酸水的乳酸菌，其特征在于，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括植物乳杆菌MBH2-1。
6.根据权利要求1所述的耐受次氯酸水的乳酸菌，其特征在于，所述耐受次氯酸水的乳酸菌包括植物乳杆菌MBH5-1。
7.一种微生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1-6任一项所述的耐受次氯酸水的乳酸菌和可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的微生物制剂，所述微生物制剂为液体制剂，菌悬液浓度为109CFU/mL。
9.如权利要求1-6任一项所述的耐受次氯酸水的乳酸菌或者如如权利要求7所述的微生物制剂在食品添加剂、饲料添加剂或调节肠道菌群保健品中的应用。
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