CN112352908A - 甲基营养型芽孢杆菌bmf 04的解毒用途 - Google Patents

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彭云
董霆
许建和
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Abstract

本发明是一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，所述的解毒用途是甲基营养型芽孢杆菌BMF 04降解玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素的用途。将BMF04菌株接种到ZEN毒素终浓度为15µg/mL的DF培养液中，培养48 h，毒素去除率达98.95±1.27%。BMF 04菌株活菌、无菌发酵液、细胞壁悬浮液和胞内液对ZEN毒素均具有较强的去除作用，含毒素浓度为15µg/ml溶液中作用48h，去除率分别为98.92±0.07%、98.70±0.19%、97.85±0.07%和98.54±0.10%。本发明通过研究发现了BMF04菌株新的用途，扩展了BMF04菌株的应用范围，且其解毒效果好。在含毒饲料中加入BMF04菌体，冷藏60d后毒素去除率达70%左右，为生物去除污染粮食、饲料中的ZEN毒素提供新的菌种资源。

Description

甲基营养型芽孢杆菌BMF 04的解毒用途
技术领域
本发明涉及一种海洋细菌的用途，特别是一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04降解ZEN毒素的用途。
背景技术
ZEN毒素是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌毒素，在世界各地的谷物以及农副产品中检出率达90%。已有研究者对全国的真菌毒素调查研究表明，我国粮食原料及饲料中霉菌毒素污染十分普遍且严重。不同地区和不同季节的原料及饲料产品均受到霉菌毒素不同程度的污染，检出率为70%~100%。被毒素污染的粮食原料，其营养性和安全性将会大大降低对我国养殖业造成了巨大经济损失。传统的降解霉菌毒素方法主要有物理降解法和化学降解法，易造成营养物质破坏和二次污染等，存在着不可避免的局限性。生物降解法主要由微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的胞内、胞外酶分解毒素，产生的降解产物无毒，并对原料中的其他成分没有破坏作用，不会降低营养价值，生物降解法是解决霉菌毒素污染的发展方向和趋势。
目前，国内外分离到能高效降解ZEN毒素的菌株相对较少，主要有红球菌（Rhodococcus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、链霉菌（Streptomyces）、假单胞菌（Pseudomonas）、酵母菌等，不同菌株对ZEN毒素的降解能力不同。Cho等（2010）从土壤分离出一株降解ZEN毒素的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），对液体培养基中1 mg/kg ZEN毒素的降解率为99%，对固体培养基中0.25 mg/kg ZEN毒素的降解率为95%；Yi等（2011）从土壤中分离得到一株能降解ZEN毒素的地衣芽孢杆菌CK1，在添加了2 mg/kg的ZEN毒素的LB培养基中对ZEN毒素的降解率围95.8%；谭辉（2014）从牛瘤胃中分离纯化出一株能够高效降解ZEN的菌株TH-N 1，对培养基中2 µg/mL ZEN毒素的降解率围59%；Samuel等（2014）分离出一株假单胞菌（Pseudomonas），该菌株对培养基中0.2 μg/mL ZEN毒素的降解率为90% 以上，且其降解产物无毒。
关于ZEN毒素的微生物降解机理研究也有相关报道，不同降解ZEN毒素的菌株降解方式、活性物质种类和降解能力等也不同。王国兵（2015）和Xu等（2016）在研究中发现解淀粉芽抱杆菌ZDS-1和香茅醇假单胞ASAG16对ZEN毒素的去除是降解作用，而不是通过简单的结合或吸收作用去除ZEN，且在ZEN的降解过程中，没有产生ZEN的类似物。耿海荣等（2019）研究表明枯草芽孢杆菌（B. subtilis）Y-33的菌液对2µg/mL和20 µg/mL ZEN毒素的降解率分别为93.79%和82.40%，发酵上清液对ZEN毒素降解率为62.02%。谭辉（2014）对菌株TH-N 1的降解机理研究发现活菌体细胞和细胞内含物对ZEN的降解率分别为59%和38%，无菌的上清液和菌被灭活后的菌液对ZEN毒素无降解能力，说明其降解能力可能是由于细胞内存在的胞内酶起到了作用。唐彧等（2019）研究谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamate）406降解玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素B（AFB1）的降解特性时，结果表明该菌株降解ZEN和AFB1活性成分存在于发酵上清液中（降解率分别为 50%和 58%），并初步确定其降解活性物质为一种胞外酶。
甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BMF 04是发明人筛选得到的菌株。BMF 04菌株已由申请人于2017年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M2017375。保藏单位地址为：中国武汉市武汉大学，邮编430072，电话027－68754052。
因此，对海洋甲基营养型芽孢杆菌BMF 04菌株进行解毒研究具有重要的意义和良好的开发应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04菌株的新用途，该新用途是对ZEN毒素的降解用途。
本发明中涉及的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04，其保藏号为CCTCC NO：2017375。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其特点是，所述的用途是甲基营养型芽孢杆菌BMF 04降解ZEN毒素的用途。
以上所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其进一步优选的技术方案是：降解ZEN毒素的BMF 04菌株为BMF 04活菌或者BMF 04菌株的无菌发酵液或者细胞壁悬浮液或者胞内液。
以上所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其进一步优选的技术方案是：BMF 04菌株的无菌发酵液制备方法如下：将活化的BMF04菌株斜面用 PD洗下制成菌悬液，倒入装有种子液培养基的培养器中，28 ℃、180 r/min振荡培养24h，得BMF04种子液。以7%的接种量将种子液接入发酵培养中，28 ℃、180 r/min振荡培养48h，发酵液于4℃、8000 r/min离心15min，分别收集发酵上清液和菌体沉淀，上清液过滤除菌得到无菌发酵液。
以上所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其进一步优选的技术方案是：BMF 04菌株的细胞壁悬浮液和胞内液的制备方法如下：将权利要求3中所述的菌体沉淀用DF培养基洗涤2-3次，用等体积DF培养基重悬菌体得到活菌悬浮液；活菌悬浮液用超声细胞破碎仪处理，至菌体充分破碎，冰浴功率比20%，工作时间为3s，间隙时间5s，循环工作至活菌悬浮液呈透明状，4 ℃，8000 r/min，离心15 min，分别收集上清液和沉淀，上清液用0.45µm滤膜过滤，滤液为胞内液；沉淀为细胞壁组分，用等量DF培养基重悬，得到细胞壁悬浮液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究发现了BMF04菌株新的用途，BMF04菌株可以用来对ZEN毒素进行降解，扩展了BMF04菌株的应用范围，且其解毒效果好。为生物去除污染粮食、饲料中的ZEN毒素提供新的菌种资源。
说明书附图
图1为不同菌株在含ZEN毒素平板上的生长状态图，图1中：
注：A：BMF04菌株；B：大肠杆菌（E. coli）；C：GM-1-2菌株；
图2为 ZEN标准品HPLC检测图谱；
图3为 ZEN毒素的标准曲线；
图4为 BMF04菌株不同处理对ZEN毒素的去除率测定结果图，图中：（1）1活菌悬液；2灭活菌悬液；3无菌发酵液；4灭活无菌发酵液；5细胞壁；6胞内液；
图5为不同蛋白酶处理BMF04菌株无菌发酵液后对ZEN毒素降解率的影响图，图中：不同字母A、B、C表示差异显著（p<0.05）。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophics）BMF 04用途实验：
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 供试菌株
海洋甲基营养型芽孢杆菌BMF04菌株（Bacillus methylotrophicus），由本实验室从连云港海域分离并保存。
1.1.2 供试培养基
BMF04菌株、解淀粉芽孢杆菌GM-1-2（Bacillus amyloliquefaciens）活化培养基：PDA培养基。
BMF04菌株种子液培养基和发酵培养基：PD 培养基。
大肠杆菌（Escherichia coli）活化培养基：LB培养基
BMF04菌株去除ZEN毒素测定培养基（DF培养基）：2.44 g/L Na2HPO4，1.52 g/L KH2PO4，0.5 g/L (NH4)2SO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L CaCl2。
1.1.3 主要试剂及其配制
玉米赤霉烯酮毒素（ZEN）：由江苏省农科院粮食安全与加工研究所制备提供；
将ZEN 标准品溶于甲醇，制成浓度为1 mg/mL ZEN母液。
胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K：分别购于Biosharp公司、Bio Basic Inc公司和德国MERCK公司。
分别用0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液将胰蛋白酶（pH 7.6）、胃蛋白酶（pH 2.0）和蛋白酶K（pH 8.7）配制成质量浓度为20 mg/mL母液待用。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪1260、C18色谱柱美国安捷伦公司；实验室级超纯水器Biosafer-20TC赛飞（中国）有限公司；高速冷冻离心机MIKIO 200 R 德国Hettich 科学仪器有限公司；超声波细胞粉碎机隔音箱JY92-IIDN 上海净信实业发展有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用测定
1.3.1.1 定性测定
挑取BMF04菌株接种在浓度为4µg/mL含ZEN毒素平板上，28 ℃培养3 d，观察BMF04菌株的生长情况，若BMF04菌株能生长，说明该菌株具有去除ZEN毒素作用。以不具有毒素去除作用的大肠杆菌（Escherichia coli）为阴性对照，以具有解毒作用的Bacillus amyloliquefaciens的GM-1-2菌株为阳性对照。
1.3.2.2 定量测定
（1）ZEN毒素标准曲线的制作
分别配制2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mLZEN毒素溶液，采用HPLC法测定不同浓度毒素溶液的色谱峰面积，每个浓度测定3次取平均值。以ZEN浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制ZEN标准曲线。
（2）BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用测定
挑取BMF04菌株接种于PDA培养基斜面，28 ℃培养18 h，用无菌DF培养基洗下菌体，并调节其菌悬液浓度为3.6×107个细胞/mL，菌悬液中加入浓度为 1 mg/mL的 ZEN毒素母液，使毒素的终浓度为4 μg/mL，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，4℃，12000 r/min离心15min，上清液用孔径为0.45µm细菌过滤器过滤，利用HPLC检测上清液中的峰面积， 3次重复，以不加菌悬液的含等量毒素的DF培养基为对照（CK），将峰面积代入所建立的ZEN毒素标准曲线，计算溶液中毒素浓度和去除率，如去除率达到100%，再增加菌悬液中毒素含量。
去除率=（CK毒素浓度－样品中毒素浓度）/CK毒素浓度×100%
HPLC检测ZEN毒素的条件：
色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪；色谱柱为安捷伦反相C18柱，孔径4 µm，长×宽250×4.6 mm；流动相为甲醇:水=80:20（V/V）；紫外检测波长为236 nm；柱温25 ℃；进样量20 µL；流速1 mL/min。
1.3.3 BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用机理测定
1.3.3.1 BMF04菌株去除ZEN毒素方式研究
将活化18 h的BMF04菌株斜面用5 mL PD洗下制成菌悬液，倒入装有55 mL 种子液培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振荡培养24h，得BMF04种子液。以7%的接种量将种子液接入发酵培养中，28 ℃、180 r/min振荡培养48h，发酵液于4℃、8000 r/min离心15min，分别收集发酵上清液和菌体沉淀。
上清液过滤除菌得到无菌发酵液；将菌体沉淀用DF培养基洗涤3次，用等体积DF培养基重悬菌体得到活菌悬浮液，菌体密度为3.6×107个细胞/ mL。
无菌发酵液和活菌悬浮液121 ℃灭菌30 min，得到灭活无菌发酵液和灭活菌悬浮液；
活菌悬浮液用超声细胞破碎仪处理，至菌体充分破碎，冰浴功率比20%，工作时间为3s，间隙时间5s，循环工作至活菌悬浮液呈透明状， 4 ℃，8000 r/min，离心15 min，分别收集上清液和沉淀，上清液用0.45µm滤膜过滤，滤液为胞内液；沉淀为细胞壁组分，用等量DF培养基重悬，得到细胞壁悬浮液。
取BMF04菌株活菌悬浮液、灭活菌悬浮液、无菌发酵液、灭活无菌发酵液、胞内液和细胞壁悬浮液，分别加入ZEN 毒素母液，使ZEN毒素终浓度为15 μg/mL，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，测定不同处理的峰面积，计算不同样品中ZEN毒素浓度和去除率。
1.3.3.2 蛋白酶对BMF04菌株去除ZEN毒素作用的影响
BMF04菌株的无菌发酵液中，分别加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K，使酶的终浓度为1 mg/mL，用2mol/ LHCl和NaOH溶液调节胰蛋白酶反应体系pH为 7.6、胃蛋白酶为pH 2.0、蛋白酶K为pH 8.7，37℃水浴2 h，调回初始pH。
取不同蛋白酶酶解后的样品，加入ZEN毒素母液，ZEN毒素的终浓度为4 μg/mL，28℃静置12 h，采用HPLC的方法检测样品中ZEN毒素峰面积，计算不同蛋白酶处理的无菌发酵液对ZEN毒素的降解率。以未加蛋白酶的无菌发酵液为对照（CK1），未加无菌发酵液的为空白对照（CK2），每种蛋白酶为1处理，每个处理3次重复。
1.3.4甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophics）BMF 04菌株对渔用饲料中ZEN毒素的降解作用测定实验：
1.3.4.1方法：
取鱼粉、豆粕、花生粕和棉粕等原料按比例配制的饲料原料充分混匀加入豆油，加入ZEN毒素母液配制成浓度为1µg/g的含毒饲料，加入BMF04菌株菌泥，使含毒饲料中BMF04菌株浓度为106个细胞/g，搅拌至粘合度适中制成3 mm*0.5 mm大小的含毒颗粒饲料，60℃的烘箱中烘干至水分10%～12%，装袋密封冷藏60d，分别取1 g料样品加入9 mL 80%甲醇溶液中，磁力搅拌器充分浸提4h，12000 r/min离心15 min，上清液用孔径为0.45 µm细菌过滤器过滤，采用HPLC法检测饲料中毒素含量，以不加BMF04菌株菌泥的含毒饲料为对照，计算BMF04菌株对饲料这ZEN毒素的降解率。
结果与分析
2.1 BMF04菌株对ZEN毒素去除作用的定性测定
BMF04菌株和阳性对照GM-1-2菌株在含ZEN毒素平板上生长良好（图1），说明BMF04菌株和GM-1-2菌株能够在以ZEN毒素为唯一碳源的DF培养基上生长，阴性对照大肠杆菌（E. coli）不生长，表明BMF04菌株具有去除ZEN毒素的作用。
2.2 BMF04菌株对ZEN毒素降解的定量测定
2.2.1 ZEN毒素标准品的检测
由图2可知，ZEN标准品的出峰时间约为2.689 min，峰型清晰无拖尾，与其他的峰没有重合，能够清晰地测量出相应的峰面积。
2.2.2 ZEN毒素标准曲线的建立
配制不同浓度ZEN毒素溶液，HPLC测定不同ZEN浓度毒素的峰面积，以ZEN浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制ZEN标准曲线。如图3所示，在0-16µg/mL浓度范围内，随着ZEN浓度的增加，峰面积逐渐增大，呈正相关，标准曲线方程为y=82.727x+1.2333，R²为0.9996，线性相关性较好。
2.2.3 BMF04菌株对ZEN毒素去除作用的测定
HPLC检测的初始浓度为4 µg/mL、10 µg/mL和15 µg/mL的对照峰面积分别为323.28±5.69、818.29±4.74和1234.68±24.83，代入标准曲线计算得到的ZEN浓度依次为3.89±0.07 µg/mL、9.88±0.06 µg/mL和14.91±0.30 µg/mL，与加入的ZEN标准品初始浓度拟合程度较高，说明仪器灵敏度好，检测结果准确。
将BMF04菌株接种到ZEN毒素终浓度为4 µg/mL和10 µg/mL的DF培养液中，28℃培养48 h，HPLC检测未出现吸收峰，去除率均为100%；当增加ZEN毒素浓度为15 µg/mL，检测到峰面积为12.96±0.14，浓度为0.14±0.01µg/mL，去除率为98.95 ±1.27%（表1）。说明BMF04菌株对ZEN毒素具有较强的去除能力。
表1 BMF04菌株对不同浓度ZEN毒素的去除率
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
2.3 BMF04菌株的降解ZEN毒素机理研究
2.3.1 BMF04菌株活菌悬液和灭活菌悬液对ZEN毒素的去除作用
BMF04菌株活菌悬液在含15µg/mL ZEN毒素的培养基中培养48h，HPLC检测峰面积为14.29±0.77，浓度为0.16±0.01µg/mL，去除率为98.92±0.07%；灭活菌悬液峰面积和毒素浓度明显下降，分别488.92±2.38和5.90±0.03µg/mL（表2），去除率为60.32±0.21%（图4），说明去除ZEN毒素作用是活菌生长过程中产生了具有去除ZEN毒素作用的活性物质，高温处理后活性物质失活，导致去除率降低，高温灭活后细胞壁依然存在，灭活后活性物质的去除作用消失，细胞壁的吸附作用受温度影响较小，因而灭活后仍然具有一定的去除率，表明BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用是菌株产生活性物质和细胞壁吸附的共同作用。
2.3.2 BMF04菌株无菌发酵液和灭活无菌发酵液对ZEN毒素的去除作用
无菌发酵液经121℃高温处理后对ZEN毒素的去除作用明显降低（图4）。无菌发酵液与ZEN毒素浓度为15µg/mL溶液混合培养48h， HPLC检测峰面积为17.3±2.22，根据标准曲线计算ZEN毒素浓度仅为0.19±0.03µg/mL，去除率达98.70±0.19%；发酵液高温处理后再与毒素溶液混合培养48h，HPLC检测峰面积为1204.75±36.29，ZEN毒素浓度为14.55±0.44µg/mL（表2），去除率仅为2.09±1.15%，去除作率显著下降。说明BMF04菌株胞外物质对ZEN毒素具有降解作用，且高温处理影响其降解作用。
2.3.3 BMF04菌株细胞壁悬浮液和胞内液对ZEN毒素的去除作用
细胞壁悬浮液和胞内液在含15µg/mLZEN毒素的培养基中培养48h，测定对ZEN毒素的去除作用。结果表明，细胞壁悬浮液和胞内液处理的样品峰面积分别为27.91±0.98和19.12±1.06，浓度分别为0.32±0.01 µg/mL和0.22±0.02 µg/mL（表2），去除率分别为97.85±0.07%和98.54±0.10%，说明该菌株的细胞壁和胞内液对ZEN毒素均具有较好的去除作用。
表2 BMF04菌株不同处理中ZEN毒素的峰面积和浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
（2）不同字母A、B、C表示差异显著（p<0.05）。
2.3.4 蛋白酶处理对无菌发酵液去除解ZEN毒素作用的的影响
无菌发酵液胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后，对ZEN毒素的去除作用显著降低，反应体系中毒素浓度分别为3.83±0.03 µg/mL、3.95±0.02 µg/mL、3.96±0.00 µg/mL（表3），去除率分别为3.52±0.77%、0.50±0.39% 和0.18±0.12%，未处理的无菌发酵液对照中ZEN毒素的峰面积为45.44±2.37，浓度为0.53±0.03 µg/mL，去除率为86.54±0.72%（图5），3种酶处理后对毒素的去除作用与对照差异显著，胃蛋白酶和蛋白酶K之间差异不显著。表明胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K可以降低BMF04菌株无菌发酵液对ZEN毒素的降解作用，进一步说明BMF04菌株去除ZEN毒素的胞外活性物质为蛋白类物质。
表3不同蛋白酶处理BMF04菌株无菌发酵液后ZEN毒素的峰面积和浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
2.4 BMF 04菌株对渔用饲料中ZEN毒素的降解作用测定结果
结果见表4：
表4 BMF04菌株去除饲料中ZEN毒素效果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
从以上结果可以看出，含毒饲料中加入BMF04菌体，冷藏60d后毒素含量明显低于对照，毒素去除率达69.25%，说明BMF04菌体对饲料中的ZEN毒素具有较强的去除作用，表现出良好的开发应用前景。
讨论
ZEN毒素主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)生长过程中所产生的有毒次级代谢产物。
不同解毒微生物菌株对ZEN毒素的降解能力差异较大，且不同解毒菌株的降解机理也有差异，可能与解毒菌株的种类、菌种及其环境有关。不同降解毒素菌株中芽孢菌属降解ZEN毒素的能力较强，黄哲（2013）分离鉴定出的2株巨大芽抱杆菌和地衣芽孢杆菌的降解能力最大可达99%；张晨曦等筛选获得一株能够高效降解ZEN毒素的解淀粉芽孢杆菌 NS2，该菌株对5 μg/mL ZEN 的降解率高达95. 99%。BMF04菌株能在ZEN毒素为唯一碳源的含毒平板上生长良好，培养液中ZEN毒素浓度为4 µg/mL和10 µg/mL时，去除率可达100%，当ZEN毒素浓度为15 µg/mL时，去除率仍可达为98.95%，具有较强的降解ZEN毒素能力。
关于解毒菌株的降解能力及降解机理在已报道的研究中，芽孢菌属较多。葛婵婵等（2015）和唐彧等（2019）分别研究的2株芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌406对ZEN毒素的作用主要是由胞外活性物质发挥的降解作用，而不是基于细胞壁的吸附作用。而本发明研究BMF04菌株对ZEN毒素的去除作用既有细胞壁吸附作用又有蛋白质的参与。
结论
综合以上分析，BMF04菌株在以ZEN毒素为唯一碳源的含毒平板上生长良好，通过细胞壁的吸附、胞内物质和胞外蛋白的降解对ZEN毒素具有较强的去除作用。上述结果为生物去除污染粮食、饲料中的ZEN毒素提供新的菌种资源。

Claims (6)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其特征在于，所述的解毒用途是甲基营养型芽孢杆菌BMF 04降解ZEN毒素的用途。
2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其特征在于：降解ZEN毒素的BMF 04菌株为BMF 04活菌或者BMF 04菌株的无菌发酵液或者细胞壁悬浮液或者胞内液。
3.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其特征在于，BMF 04菌株的无菌发酵液制备方法如下：将活化的BMF04菌株斜面用 PD洗下制成菌悬液，倒入装有种子液培养基的培养器中，28 ℃、180 r/min振荡培养24h，得BMF04种子液。
4.以7%的接种量将种子液接入发酵培养中，28 ℃、180 r/min振荡培养48h。
5.发酵液于4℃、8000 r/min离心15min，分别收集发酵上清液和菌体沉淀，上清液过滤除菌得到无菌发酵液。
6.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BMF 04的解毒用途，其特征在于，BMF 04菌株的细胞壁悬浮液和胞内液的制备方法如下：将权利要求3中所述的菌体沉淀用DF培养基洗涤2-3次，用等体积DF培养基重悬菌体得到活菌悬浮液；活菌悬浮液用超声细胞破碎仪处理，至菌体充分破碎，冰浴功率比20%，工作时间为3s，间隙时间5s，循环工作至活菌悬浮液呈透明状，4 ℃，8000 r/min，离心15 min，分别收集上清液和沉淀，上清液用0.45µm滤膜过滤，滤液为胞内液；沉淀为细胞壁组分，用等量DF培养基重悬，得到细胞壁悬浮液。
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