CN117866854B - 修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌bn01及其后生元 - Google Patents

修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌bn01及其后生元 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌BN01及其后生元，所述罗伊氏粘液乳杆菌为罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01于2023年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29132。本发明所提供的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元利用罗伊氏粘液乳杆菌BN01对组合物进行共生发酵、分级发酵制作而成，所得的后生元具有修复胃肠黏膜损伤的作用。

Description

修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌BN01及其后生元
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌BN01及其后生元。
背景技术
胃肠道是人体最大的免疫器官，也是人体最大的排毒器官，其中，胃肠黏膜是胃肠道的重要组织，既能阻隔外来物质对胃肠道的影响，又能为食物消化吸收、微生物生长繁殖、物质代谢/运输提供适宜的场所，在人体内既充当坚韧的屏障，但又十分脆弱容易受损。当人体食用辛辣、温度过高、温度过低等刺激性食品时，容易对胃肠粘膜造成损伤。胃肠黏膜损伤时初期不易察觉，容易被人们忽视，但是随着每日损伤的积累，就容易产生胃肠道不适症状，如：腹痛、腹泻、消化不良、便秘、便出血等。因此，时刻修复胃肠黏膜损伤显得十分重要。
市面上修复胃肠黏膜的产品主要为西药，虽然有治疗效果，但是长期采用这种治疗方式，人体容易出现耐药性，同时也会带来其他副作用影响人体健康，如：呕吐、腹痛、腹泻、口干、内分泌紊乱等。其他具有辅助修复胃肠黏膜的食品如米糊、米稀，虽然有辅助作用，但是起效慢，需要长期坚持食用，容易导致胃肠道消化能力减弱。
因此，需要研发能够高效修复胃肠黏膜损伤、安全、温和且无副作用的产品。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌，所述罗伊氏粘液乳杆菌为罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillusreuteri）BN01。
本发明的目的之二在于提供所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillusreuteri）BN01的应用。
本发明的目的之三在于提供修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一株修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌，所述罗伊氏粘液乳杆菌为罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01，所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01于2023年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29132。
本发明所提供的罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01可以降低胃肠黏膜的通透性。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种修复胃肠黏膜损伤的产品，所述产品的活性成分包括罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01的活菌体和/或灭活型菌体。
作为本发明的一个优选方案，所述产品包括所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01和马克斯克鲁维酵母菌。
本发明所提供的罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01不仅能够与马克斯克鲁维酵母共生发酵，还可以降低胃肠黏膜的通透性。
作为本发明的一个优选方案，所述产品由所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01和马克斯克鲁维酵母菌共同发酵而成。
一种修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元，由罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01对组合物进行发酵而成，所述组合物包括按照重量份计的以下组分：南瓜30-50份，陈皮20-30份，青稞25-40份，马克斯克鲁维酵母菌3-7份。
在本发明中，所述组合物中各原料均为天然的食品原料。
南瓜被誉为“瓜中之宝”，含有20余种营养成分，特别是类胡萝卜素（以β-胡萝卜素为主）、多糖、果胶、葫芦巴碱等成分含量较高，果胶可以保护黏膜免受粗糙食物刺激，促进溃疡愈合，β-胡萝卜素具有良好的维生素 A 原的活性，能够促进上皮细胞的正常生长与分化，有利于受损伤的胃肠黏膜修复。
陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，含有多种活性成分，如：橙皮苷、川陈皮素等黄酮类物质、挥发油、多糖、生物碱和多种人体必需的微量元素等，具有消炎、理气、健脾胃的功效。
青稞富含淀粉、β-葡聚糖、尿囊素、超氧化物歧化酶多种维生素和矿物质，能够通过调节氧化应激、炎症因子，改善中性粒细胞浸润来改善胃肠道损伤水平，促进黏膜细胞生长，加快伤口愈合。
本发明的发酵底物精选天然的食品原料，富含多种营养素和功效因子，不含毒素，在人体内不产生副作用，配方设计巧妙，无论是从底物组成还是组合物配方（不包括有益菌）来说，都非常具有创新性，其虽作为食品配方，但是经过新技术制成后生元后，能极大地提高其作用速度和生物利用度，在高效修复胃肠黏膜损伤、促进黏膜细胞生长、降低胃肠黏膜的通透性的同时不产生毒副作用，保护胃肠黏膜屏障完整。
作为本发明的一个优选方案，所述组合物包括按照重量份计的以下组分：南瓜40份，陈皮25份，青稞30份，马克斯克鲁维酵母菌5份。
作为本发明的一个优选方案，所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillusreuteri）BN01与所述马克斯克鲁维酵母菌的重量比为（8-12）：（3-7）。
作为本发明的一个优选方案，所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillusreuteri）BN01与所述马克斯克鲁维酵母菌的重量比为2：1。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法，包括以下步骤：
发芽：将青稞进行发芽，得基料B；
破壁：将南瓜、陈皮置于破壁机中，破壁，得基料C；将基料B置于破壁机中，破壁，得基料D；
灭菌：将基料C灭菌冷却，得基料E；将基料D灭菌冷却，得基料F；
菌种活化：称取马克斯克鲁维酵母，加入水和基料F溶解，搅拌均匀后离心，取沉淀，得基料G；将罗伊氏粘液乳杆菌BN01活化，获取活化菌种H；
一级发酵：将基料G和部分活化菌种H接种至基料F中，发酵，得基料I；
二级发酵：将部分活化菌种H接种至基料E中，发酵，得基料J；
萃取：将基料I与基料J混合均匀，离心，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，离心，分离沉淀和上清液，重复2次，将上清液并合并，即为基料M；
浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，减压浓缩，得基料N；
喷雾干燥：将基料N置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥，干燥结束后收集粉体，即得罗伊氏粘液乳杆菌BN01后生元。
作为本发明的一个优选方案，所述修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法，包括以下步骤：
原料选择：选择新鲜、无腐败的南瓜和青稞，选择无腐败的4~8年陈皮，备用；
预处理：将南瓜用水洗净，切块及去籽后，按照配放量称取；将陈皮和青稞用水洗净后，分别称取配放量的陈皮和青稞，备用；
发芽：用Na2CO3、NaOH、KOH和水配制获得浸渍水；用赤霉酸和水配制得发芽水；将青稞用浸渍水浸渍，沥干水分，得基料A；将基料A置于发芽机中发芽，得基料B；
破壁：
（1）将南瓜、陈皮置于破壁机中，加入水，破壁，调节pH至6~7，得基料C；
（2）将基料B置于破壁机中，加入水，破壁，调节pH至6~7，得基料D；
灭菌：将基料C灭菌，冷却，得基料E；将基料D灭菌及冷却，得基料F；
菌种活化：
（1）称取配方量的马克斯克鲁维酵母，加入20~40份、30~45℃的纯化水和8~12份基料F溶解，搅拌均匀后静置活化，在7500~8500r/min的条件下离心8~12min，取沉淀，即为基料G；
（2）将冻存保藏的罗伊氏粘液乳杆菌BN01活化两代，在7500~8500r/min的条件下离心8~12min，取沉淀，即为活化菌种H；
一级发酵：将基料G和3~8份活化菌种H接种至基料F中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在250~350r/min、30~35℃的条件下厌氧发酵65~75h，得基料I；
二级发酵：将3~8份活化菌种H接种至基料E中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在30~35℃的条件下厌氧发酵20~26h，得基料J；
萃取：将基料I与基料J混合均匀，调节超声功率为250~350W，避光超声18~25min，超声温度为30~38℃，8500~11000r/min离心8~12min，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，料液比 1:（12~15），提取液为乙醇，超声温度 35~42℃，超声时间12~18 min，趁热离心8~12min，转速为8500~11000r/min，分离沉淀和上清液，重复2~3次，将上清液并合并，即为基料M；
浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，置于旋转蒸发仪中，在35~42℃、真空度为-0.12~-0.2MPa、转速为20~25r/min的条件下，减压浓缩10~13h，得基料N；
喷雾干燥：将基料N置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥，条件为进风温度180~210℃、出风温度 75~85 ℃，入料流量45~55 mL/min，干燥结束后收集粉体，即得罗伊氏粘液乳杆菌BN01后生元。
本发明所提供的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法，是一种共生发酵技术，运用罗伊氏粘液乳杆菌BN01与马克斯克鲁维酵母的共生与互补效应进行发酵，在厌氧条件下，乳酸菌发酵产生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机酸、蛋白质及脂肪，产生易于吸收的单糖、游离氧基酸和挥发性脂肪酸，以及多种维生素（叶酸等）物质，不仅为酵母菌的生长提供了丰富的营养来源，而且也营造了良好的生长环境。酵母菌发酵生成氨基酸、B族维生素、丙酮酸盐和酒精等，为乳酸菌提供营养物质，促进乳酸菌生长和繁殖。同时，乳酸及脂肪酸可与酒精作用形成醛类，此外，还大量生成酮类、酯类等化合物，极大地提高了发酵制品的营养价值。共生发酵不仅促进了罗伊氏粘液乳杆菌BN01与马克斯克鲁维酵母的增殖，而且能分解发酵底物产生了丰富的营养物质，如：有机酸、氨基酸、维生素、细菌素、矿物质等，具有抑制致病菌生长，提高食物消化利用率、促进受损伤的胃肠黏膜细胞修复等生理功效。
本发明所提供的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法，是一种分级发酵技术，创新采用一级发酵（共生发酵）、二级发酵（乳酸菌单菌发酵）联合进行，一级发酵为罗伊氏粘液乳杆菌BN01与马克斯克鲁维酵母共生发酵，所得的发酵物不仅含有尿囊素，同时也能更好地萃取二轮发酵底物的类胡萝卜素，二级发酵为罗伊氏粘液乳杆菌BN01单菌发酵，经过二轮发酵，不仅能使南瓜、陈皮的水溶性果胶、类胡萝卜素、橙皮苷、酚类等功能性成分释放，而且还富含短链脂肪酸、黏多糖、氨基酸、维生素等营养成分。组合物经过分级发酵，发酵产出的功效因子数量更多且种类更丰富，底物发酵更充分，所得的发酵制品功能更具有靶向性，能高效修复胃肠黏膜损伤。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明所提供的罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01，可以降低胃肠黏膜的通透性，具有修复胃肠黏膜损伤的作用。
（2）本发明所提供的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元，利用罗伊氏粘液乳杆菌BN01对组合物进行共生发酵、分级发酵制作而成，所得的后生元具有修复胃肠黏膜损伤的作用。
生物材料保藏信息：罗伊氏粘液乳杆菌BN01，保藏编号为CGMCC No.29132，分类命名为：罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri，已于2023年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏单位的缩写为CGMCC。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过商业渠道购买获得。
体系一：与马克斯克鲁维酵母进行共生发酵效果较好的菌种筛选
1、实验菌株：
（1）乳酸菌：两歧双歧杆菌、副干酪乳酪杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌、乳酸乳球菌乳亚种、乳酸片球菌，分别编号A～E。
（2）酵母菌：马克斯克鲁维酵母。
2、培养基制备：
（1）培养基A：称取蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值6.7，于121℃下灭菌20 min；
（2）培养基B：称取蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，琼脂20g，吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值6.7，于121℃下灭菌20 min。
3、菌种活化：
（1）称取马克斯克鲁维酵母5份，加入30份、35℃的纯化水和10份培养基A溶解，搅拌均匀后静置活化30min，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为活化菌种。
（2）将冻存于-80℃甘油保藏的乳酸菌在培养基B上进行划线，35℃恒温培养箱培养24 h，挑取单菌落接种于培养基A中，35℃静置培养24 h。再以2%的接种量接种于培养基A中，活化两代，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为活化菌种。
4、实验方法：
将乳酸菌（A～E）分别与酵母菌按质量比1:1(总接种量为4%)接入培养基A，搅拌均匀，在300r/min、35℃的条件下厌氧发酵72h，即得发酵液，记为A～E组，在发酵结束时，测定发酵液中的活菌数，结果如表1所示。
根据《GB 4789.35食品安全国家标准》对发酵液中的乳酸菌进行计数。
根据《GB 4789.15食品安全国家标准》对发酵液中的酵母菌进行计数。
5、结果与分析：
表1 发酵液中的活菌数（×108CFU/mL）
由表1可得，不同的乳酸菌与酵母菌的共生能力不同，例如：有些组别的酵母菌增殖效果比较好，有些组别的乳酸菌增殖效果比较好。其中，C组的乳酸菌数和酵母菌数最高，说明C组的乳酸菌与酵母菌共生效果最好，即乳酸菌生长所分泌的代谢物能促进促进酵母菌增殖，酵母菌在生长过程中所分泌的代谢物也能促进乳酸菌增殖，两种菌在生长过程中所生成及消耗的营养素可以互为补充，营造适宜的生长环境。因此，选择C组的乳酸菌，即罗伊氏粘液乳杆菌，作为与马克斯克鲁维酵母进行共生发酵效果较好的菌种。
体系二：筛选能够通过发酵底物来提高功能性成分含量的菌株
1、实验菌株：罗伊氏粘液乳杆菌BN01、罗伊氏粘液乳杆菌CICC 6119（保藏号：CICC6119）、罗伊氏粘液乳杆菌CICC 6126（保藏号：CICC 6126），分别编号A～C。
罗伊氏粘液乳杆菌CICC 6119和罗伊氏粘液乳杆菌CICC 6126购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
2、实验组样品制备
（1）原料选择及预处理：选择新鲜、无腐败的南瓜和青稞，选择无腐败的5年陈皮，用纯化水洗净，备用；
（2）预处理：将南瓜用纯化水洗净，切块及去籽后，称取40份；将陈皮和青稞用纯化水洗净，分别称取陈皮25份，青稞30份，备用；
（3）发芽：称取Na2CO3、NaOH、KOH各0.5份，加入500mL纯化水中，搅拌溶解，得浸渍水；称取赤霉酸2份，加入500mL纯化水中，得发芽水。将青稞用60mL浸渍水浸渍12h，沥干水分，得基料A。将基料A置于18摄氏度恒温发芽机中，每隔4h喷洒发芽水3min，通风供氧，培养5d，洗净，沥干水分，得基料B；
（4）破壁：
1）将南瓜、陈皮置于破壁机中，加入85份蒸馏水，在18000r/min的转速下，破壁2min，调节pH至6.7，得基料C；
2）将基料B置于破壁机中，加入50份蒸馏水，在18000r/min的转速下，破壁2min，在60℃的条件下保持60min，调节pH至6.7，得基料D；
（5）培养基制备：
1）培养基A：称取蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值6.7，于121℃下灭菌20 min； 2）培养基B：称取蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05 g，琼脂20g，吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值6.7，于121℃下灭菌20 min。
（6）灭菌：将基料C置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃的条件下灭菌20min，冷却至35℃，得基料E。同理，将基料D以同样方式灭菌及冷却，得基料F。
（7）菌种活化：
1）称取马克斯克鲁维酵母5份，加入30份、35℃的纯化水和10份基料F溶解，搅拌均匀后静置活化30min，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为基料G。
2）将冻存于-80℃甘油保藏的实验菌株在培养基B上进行划线，35℃恒温培养箱培养24 h，挑取单菌落接种于培养基A中，35℃静置培养24 h。再以2%的接种量接种于培养基A中，活化两代，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为活化菌种H。
（8）一级发酵：将基料G和5份活化菌种H接种至基料F中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在300r/min、35℃的条件下厌氧发酵72h，得基料I。
（9）二级发酵：将5份活化菌种H接种至基料E中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在35℃的条件下厌氧发酵24h，得基料J。
（10）萃取：将基料I与基料J混合均匀，调节超声功率为300W，避光超声20min，超声温度为35℃，10000r/min离心10min，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，料液比 1:15，提取液为60%的乙醇，超声温度 40 ℃，超声时间15min，趁热离心10min，转速为10000r/min，分离沉淀和上清液，重复2次，将上清液并合并，即为基料M；（11）浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，置于旋转蒸发仪中，在40℃、真空度为-0.1MPa、转速为21r/min的条件下，减压浓缩12h，得发酵浓缩液，分别记为A组、B组、C组。
3、空白组样品制备：
（1）原料选择及预处理：选择新鲜、无腐败的南瓜和青稞，选择无腐败的5年陈皮，用纯化水洗净，备用。
（2）预处理：将南瓜用纯化水洗净，切块及去籽后，称取40份；将陈皮和青稞用纯化水洗净，分别称取陈皮25份，青稞30份，备用。
（3）发芽：称取Na2CO3、NaOH、KOH各0.5份，加入500mL纯化水中，搅拌溶解，得浸渍水；称取赤霉酸2份，加入500mL纯化水中，得发芽水。将青稞用60mL浸渍水浸渍12h，沥干水分，得基料A。将基料A置于18摄氏度恒温发芽机中，每隔4h喷洒发芽水3min，通风供氧，培养5d，洗净，沥干水分，得基料B。
（4）破壁：
1）将南瓜、陈皮置于破壁机中，加入85份蒸馏水，在18000r/min的转速下，破壁2min，调节pH至6.7，得基料C。
2）将基料B置于破壁机中，加入50份蒸馏水，在18000r/min的转速下，破壁2min，在60℃的条件下保持60min，调节pH至6.7，得基料D。
（5）灭菌：将基料C置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃的条件下灭菌20min，冷却至35℃，得基料E。同理，将基料D以同样方式灭菌及冷却，得基料F。
（6）菌种活化：称取马克斯克鲁维酵母5份，加入30份、35℃的纯化水和10份基料F溶解，搅拌均匀后静置活化30min，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为基料G。
（7）一级发酵：将基料G接种至基料F中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在300r/min、35℃的条件下厌氧发酵72h，得基料I。
（8）二级发酵：将基料E搅拌均匀，置于发酵罐中，在35℃的条件下厌氧发酵24h，得基料J。
（9）萃取：将基料I与基料J混合均匀，调节超声功率为300W，避光超声20min，超声温度为35℃，10000r/min离心10min，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，料液比 1:15，提取液为60%的乙醇，超声温度 40 ℃，超声时间15min，趁热离心10min，转速为10000r/min，分离沉淀和上清液，重复2次，将上清液并合并，即为基料M。
（10）浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，置于旋转蒸发仪中，在40℃、真空度为-0.1MPa、转速为21r/min的条件下，减压浓缩12h，得发酵浓缩液，记为D组。
3、指标检测：
（1）根据《GB 5009.83 食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定》检测发酵浓缩液中的β-胡萝卜素含量，结果如表2所示。
（2）根据《NY/T 2016 水果及其制品中果胶含量的测定分光光度法》检测发酵浓缩液中的果胶含量，结果如表2所示。
（3）根据《尿囊素含量测定方法》检测发酵浓缩液中的尿囊素含量，结果如表2所示。
尿囊素含量测定方法：
（1）空白溶液制备：将200mL无水乙醇加入到1000mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，即得20%乙醇溶液，作为空白溶液。
（2）对照品溶液制备：精密称取尿囊素对照品（真空干燥箱 P2O5减压干燥12h以上）适量，加20%乙醇溶液，制成浓度为 87.480μg/mL 尿囊素对照品溶液。
（3）供试品溶液制备：取发酵浓缩液约0.55 g，精密称定，置于25mL容量瓶中，用20%乙醇溶液定容至刻度线，称重，摇匀，将摇匀好的溶液倒入100 mL具塞锥形瓶中，放置在有冰袋的超声仪中超声处理30 min，放冷，震荡10 min, 再称重，用溶剂补重，摇匀，倾入50mL具塞离心管中离心10min（4000 r/min），静置，上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。
（4）色谱条件：色谱柱为YMC HPLC Column C18（250mm×4.6 mm，5μm）；检测波长为224 nm；柱温35℃ ；流速0.4 mL/min ；流动相为甲醇—磷酸二氢钾缓冲溶液（取超纯化水约1800 mL，加磷酸二氢钾6.8 g搅拌使溶解，用磷酸调节pH为4.0，倾入2000mL容量瓶中，加超纯化水至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤）=1：99；进样量为10 µL。
（5）进样：按上述色谱条件，依次取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液进样进行测定，记录峰面积，按照下列公式计算尿囊素含量（%）。
式中：w为尿囊素含量，%；A1为对照品溶液的峰面积；A2为供试品溶液的峰面积。
4、结果与分析：
表2 发酵浓缩液中各指标含量
由表2可得不同组别的发酵浓缩液中β-胡萝卜素、果胶、尿囊素等指标含量不同，与D组相比，有些组别的指标含量降低，有些组别的指标含量增加，且增加的幅度也有所差异。其中A组的各指标含量增加最多，即β-胡萝卜素、果胶、尿囊素等成分含量最高。因此，选择A组的菌株作为能够通过发酵底物来提高功能性成分含量的最佳菌株，即罗伊氏粘液乳杆菌BN01。
体系三：共生发酵的菌株组方筛选
1、样品制备：
表3 共生发酵菌株组方重量份数
（1）原料选择及预处理：选择新鲜、无腐败的南瓜和青稞，选择无腐败的5年陈皮，用纯化水洗净，备用；
（2）预处理：将南瓜用纯化水洗净，切块及去籽后，称取40份；将陈皮和青稞用纯化水洗净，分别称取陈皮25份，青稞30份，备用；
（3）发芽：称取Na2CO3、NaOH、KOH各0.5份，加入500mL纯化水中，搅拌溶解，得浸渍水；称取赤霉酸2份，加入500mL纯化水中，得发芽水。将青稞用60mL浸渍水浸渍12h，沥干水分，得基料A。将基料A置于18摄氏度恒温发芽机中，每隔4h喷洒发芽水3min，通风供氧，培养5d，洗净，沥干水分，得基料B。
（4）破壁：
1）将南瓜、陈皮置于破壁机中，加入85份蒸馏水，在18000r/min的转速下，破壁2min，调节pH至6.7，得基料C；
2）将基料B置于破壁机中，加入50份蒸馏水，在18000r/min的转速下，破壁2min，在60℃的条件下保持60min，调节pH至6.7，得基料D；
（5）培养基制备：
1）培养基A：称取蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值6.7，于121℃下灭菌20 min；
2）培养基B：称取蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，琼脂20g，吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH值6.7，于121℃下灭菌20 min；
（6）灭菌：将基料C置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃的条件下灭菌20min，冷却至35℃，得基料E。同理，将基料D以同样方式灭菌及冷却，得基料F；
（7）菌种活化：
1）按表3重量份数称取马克斯克鲁维酵母，加入30份、35℃的纯化水和10份基料F溶解，搅拌均匀后静置活化30min，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为基料G；
2）将冻存于-80℃甘油保藏的罗伊氏粘液乳杆菌BN01在培养基B上进行划线，35℃恒温培养箱培养24 h，挑取单菌落接种于培养基A中，35℃静置培养24 h。再以2%的接种量接种于培养基A中，活化两代，在8000r/min的条件下离心10min，取沉淀，即为活化菌种H；
（8）一级发酵：按表3重量份数称取活化菌种H，将基料G和活化菌种H接种至基料F中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在300r/min、35℃的条件下厌氧发酵72h，得基料I；
（9）二级发酵：将5份活化菌种H接种至基料E中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在35℃的条件下厌氧发酵24h，得基料J；
（10）萃取：将基料I与基料J混合均匀，调节超声功率为300W，避光超声20min，超声温度为35℃，10000r/min离心10min，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，料液比 1:15，提取液为60%的乙醇，超声温度 40 ℃，超声时间15min，趁热离心10min，转速为10000r/min，分离沉淀和上清液，重复2次，将上清液并合并，即为基料M；
（11）浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，置于旋转蒸发仪中，在40℃、真空度为-0.1MPa、转速为21r/min的条件下，减压浓缩12h，得基料N；
（12）喷雾干燥：将基料N置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥，条件为进风温度200℃、出风温度 80 ℃，入料流量50 mL/min，干燥结束后收集粉体，即得罗伊氏粘液乳杆菌BN01后生元。
2、人群测试：
（1）受试人群：36名成年人，男女比例1：1，年龄20～50岁，受试者均为肠道黏膜损伤评分=6分的人群。随机分组，分组情况见表4，每组6人。
胃肠黏膜损伤评分标准：内镜检查结果正常计0分；仅出现充血水肿计1分；肠壁出血点不超过1处计2分；肠壁出血点在2到5处之间计3分；出现糜烂病灶但不超过2处计4分；肠壁出血点超过6处计6分；糜烂病灶超过3个计8分；出现溃疡计10分。
表4 受试人群分组
3、试验方法：
受试者按照分组情况，每日餐后半小时食用罗伊氏粘液乳杆菌BN01后生元，每日3次，每次食用2g，用150mL温水冲调饮用，连续15天，第16天时进行内镜检查结果，对检查结果进行胃肠黏膜损伤评分，结果如表5所示。
4、结果与分析：
表5 胃肠黏膜损伤评分
由表5可得不同组别的受试者的胃肠黏膜损伤评分不同，说明食用的产品对受损伤的胃肠黏膜的修复程度不同。A组受试者食用实施例1的后生元，胃肠黏膜损伤评分为5.53分，与食用前6分相比，没有显著性改善，说明实施例1的后生元效果较差，即没有经过共生发酵菌株进行发酵处理，所得的后生元不能起到很好的效果。其他实施例虽有一定效果，但是胃肠黏膜还是处于受损状态。F组的受试者的胃肠黏膜损伤评分为0分，说明实施例6的后生元对人体的胃肠黏膜损伤恢复情况较好，效果显著，即将菌株按照一定比例进行共生发酵，能非常好地发挥菌株之间的协同增效作用，极大地提高后生元的效果。因此，选择实施例6的组方作为共生发酵菌株的最佳组方。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元，其特征在于，由罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01对组合物进行发酵而成，所述组合物包括按照重量份计的以下组分：南瓜30-50份、陈皮20-30份、青稞25-40份和马克斯克鲁维酵母菌3-7份；所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01与所述马克斯克鲁维酵母菌的重量比为（8-12）：（3-7）；所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01于2023年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29132。
2.如权利要求1所述的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元，其特征在于，所述组合物包括按照重量份计的以下组分：南瓜40份、陈皮25份、青稞30份和马克斯克鲁维酵母菌5份。
3.如权利要求1所述的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）BN01与所述马克斯克鲁维酵母菌的重量比为2：1。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
发芽：将青稞进行发芽，得基料B；
破壁：将南瓜、陈皮置于破壁机中，破壁，得基料C；将基料B置于破壁机中，破壁，得基料D；
灭菌：将基料C灭菌冷却，得基料E；将基料D灭菌冷却，得基料F；
菌种活化：称取马克斯克鲁维酵母，加入水和基料F溶解，搅拌均匀后离心，取沉淀，得基料G；将罗伊氏粘液乳杆菌BN01活化，获取活化菌种H；
一级发酵：将基料G和部分活化菌种H接种至基料F中，发酵，得基料I；
二级发酵：将部分活化菌种H接种至基料E中，发酵，得基料J；
萃取：将基料I与基料J混合均匀，离心，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，提取液为乙醇，离心，分离沉淀和上清液，重复2次，将上清液并合并，即为基料M；
浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，减压浓缩，得基料N；
喷雾干燥：将基料N置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥，干燥结束后收集粉体，即得罗伊氏粘液乳杆菌BN01后生元。
5.如权利要求4所述的修复胃肠黏膜损伤的罗伊氏粘液乳杆菌后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
原料选择：选择新鲜、无腐败的南瓜和青稞，选择无腐败的4~8年陈皮，备用；
预处理：将南瓜用水洗净，切块及去籽后，按照配放量称取；将陈皮和青稞用水洗净后，分别称取配放量的陈皮和青稞，备用；
发芽：用Na2CO3、NaOH、KOH和水配制获得浸渍水；用赤霉酸和水配制得发芽水；将青稞用浸渍水浸渍，沥干水分，得基料A；将基料A置于发芽机中发芽，得基料B；
破壁：
（1）将南瓜、陈皮置于破壁机中，加入水，破壁，调节pH至6~7，得基料C；
（2）将基料B置于破壁机中，加入水，破壁，调节pH至6~7，得基料D；
灭菌：将基料C灭菌，冷却，得基料E；将基料D灭菌及冷却，得基料F；
菌种活化：
（1）称取配方量的马克斯克鲁维酵母，加入20~40份、30~45℃的纯化水和8~12份基料F溶解，搅拌均匀后静置活化，在7500~8500r/min的条件下离心8~12min，取沉淀，即为基料G；
（2）将冻存保藏的罗伊氏粘液乳杆菌BN01活化两代，在7500~8500r/min的条件下离心8~12min，取沉淀，即为活化菌种H；
一级发酵：将基料G和3~8份活化菌种H接种至基料F中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在250~350r/min、30~35℃的条件下厌氧发酵65~75h，得基料I；
二级发酵：将3~8份活化菌种H接种至基料E中，搅拌均匀，置于发酵罐中，在30~35℃的条件下厌氧发酵20~26h，得基料J；
萃取：将基料I与基料J混合均匀，调节超声功率为250~350W，避光超声18~25min，超声温度为30~38℃，8500~11000r/min离心8~12min，分离沉淀及上清液，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入提取液，料液比1:（12~15），提取液为乙醇，超声温度35~42℃，超声时间12~18 min，趁热离心8~12min，转速为8500~11000r/min，分离沉淀和上清液，重复2~3次，将上清液并合并，即为基料M；
浓缩：将基料K和基料M混合均匀后，置于旋转蒸发仪中，在35~42℃、真空度为-0.12~-0.2MPa、转速为20~25r/min的条件下，减压浓缩10~13h，得基料N；
喷雾干燥：将基料N置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥，条件为进风温度180~210℃、出风温度75~85℃，入料流量45~55 mL/min，干燥结束后收集粉体，即得罗伊氏粘液乳杆菌BN01后生元。
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