JP4362603B2 - 微生物、それを得るための方法、及び飼料添加剤 - Google Patents
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Description
本発明は、純粋培養物又は混合培養物においてトリコテセンの無毒化に適しているオウバクテリウム(Eubacterium)属の微生物に関し、それらの単離、製造、及び処方のための方法、並びにその使用、並びに微生物を含む飼料添加剤に関する。
【0002】
マイコトキシン・クラスに属するトリコテセンは、多数の動物飼料に含まれており、通常穀物又は草上に見出される糸状菌を介して飼料に導入される。マイコトキシン、特にトリコテセンの動物への望ましくない投与の結果として、動物の生産性及び例えば成長の両方が阻害され、動物の健康障害に加え、飼料消費の増加と同時に飼料利用効率の低下が起こる。マイコトキシンの有害な効果を排除するため、これらの毒素を結合又は吸着するための多数の方法が既に開示されている。
【0003】
このように、例えば国際特許公開第91/13555号には、マイコトキシンを不活化するためにフィロケイ酸塩鉱物の粒子が飼料に添加される、マイコトキシンの不活化のための飼料添加剤及び方法が記載されている。これらのフィロケイ酸塩の効果を増加させるため、効果を加速するための金属イオン封鎖剤で粒子がコーティングされる。さらに、例えば国際特許公開第92/05706号からは、モンモリロナイト粘土が飼料添加剤として含まれている飼料が既知である。大きな内表面積を有するこれらの天然粘土鉱物は、多孔性であるため、表面にマイコトキシンを結合させ、このようにしてそれらを固定化する。
【0004】
さらに、エポキシダーゼ及びラクトナーゼを形成し、飼料及び動物の胃腸管の両方において化学的にマイコトキシンを分解することができる酵素調製物が用いられている飼料添加剤が、オーストリア実用新案(Austrian Utility Model)AT−U504において開示されている。AT−U504によると、この酵素調製物の作用は、ゼオライトなどの添加により増加されうる。
【0005】
そこで、本発明は、生化学的分解により、マイコトキシン、特にトリコテセンを、生理学的に無害であり特に動物飼育において無害である物質へと制御された様式で変換することが可能な、天然の環境から単離された特定の微生物又は定義された混合培養物を利用可能にすることを目的とする。
【0006】
この目的を解決するため、純粋培養物DSM11798中、又はエンテロコッカス・カッセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)の菌株との混合培養物DSM11799中、もしくはその他の嫌気性微生物との混合培養物中の、トリコテセンの無毒化に適しているオウバクテリウム(Eubacterium)属の微生物が単離された。本発明の新規な改良によると、微生物は、特にエンテロコッカス(Enterococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、バチルス(Bacillus)属、又はラクトバチルス(Lacrobacillus)属由来の、その他の嫌気性微生物との混合培養物において、トリコテセンの無毒化に適している。
【0007】
オウバクテリウム属との関連のためオウバクテリウム種とも呼ばれる、コレクション・オブ・ジャーマン・マイクロオーガニズムズ(Collection of German Microorganisms)にDSM11798の番号で純粋培養物中に寄託された、又はコレクション・オブ・ジャーマン・マイクロオーガニズムズにDSM11799の番号で寄託されたエンテロコッカス・カッセリフラバスの菌株との混合培養物中のオウバクテリウム属の微生物は、本発明により、特にデオキシニバレノール(deoxynivalenol)(DON)、T−2毒素、HT−2毒素、ニバレノール(nivalenol)、モノアセトキシサーペノール(monoacetoxyscirpenol)、ジアセトキシサーペノール(diacetoxyscirpenol)、トリコダーモル(trichodermol)、ベルカリン(verrucarin)、ロロジン(rorodin)、アセチルデオキシニバレノール(acetyldeoxynivalenol)、イソトリコダーミン(isotrichodermin)、ヒドロキシイソトリコダーミン(hydroxyisotrichodermin)、カロネクトリン(calonectrin)、T−2テトラオール(T−2 tetraol)、T−2トリオール(T−2 triol)、デアセチルネオソラニオール(deacetylneosolaniol)、ネオソラニオール(neosolaniol)、アセチルネオソラニオール(acetylneosolaniol)、スポロトリキオール(sporotrichiol)、トリコトリオール(trichotriol)、サンブシノール(sambucinol)、及びカルモリン(culmorin)の無毒化に特に適している。本発明に係る微生物は、マイコトキシン、特にトリコテセンの毒性を担っている、分子内に含まれるエポキシド基の還元的生物学的転換によりトリコテセンを無毒化する。下記式に相当するトリコテセンにおいて、エポキシド基の分解は、毒性を有する12,13−エポキシ環の還元的開裂により実施される。
【0008】
【化2】
本発明に係る微生物の形態学は、好ましくは、それがいずれも個別に、対で、又は特に最大約150μmの長鎖で発生する、0.1から3μm長の嫌気性グラム陽性桿様非胞子形成性細菌であることを示す。本発明に係る微生物の系統発生学的分析は、特に16S RNA配列、即ち
【0009】
【化3】
を示した。
【0010】
細菌のドメインの一部である代表的な微生物の既知の16S RNA遺伝子配列と比較されている微生物の配列データ。この比較分析は、オウバクテリウム属の細菌に対して最も大きい一致性を示した。しかし、既知の微生物に十分に一致する遺伝子配列を見出すことはできず、従って、本発明に係る微生物は、現在までのところ未だ単離及び分類がなされていないオウバクテリウム属に属する微生物である。例えば発酵スペクトル、硝酸塩の亜硝酸塩へ還元のような生理学的調査も、オウバクテリウム属との関連を示した。
【0011】
本発明のさらなる目的は、微生物の純粋培養物DSM11798、並びにそのエンテロコッカス・カッセリフラバスの菌株との混合培養物DSM11799、及びその他の嫌気性微生物との混合培養物の両方を得るための方法を可能にすることであり、経済的にも量的にも収量を最適化することを特に目的とする。
【0012】
この目的を達成するため、本発明に係る方法は、希釈系列及び嫌気的培養条件において少なくとも2回培養又は発酵を行うことにより、ウシ第一胃由来の微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスの菌株とから混合培養物DSM11799が得られるように実施される。本発明に係る微生物の混合培養物及び純粋培養物の両方を得るためには、そのようにすることで所望の生成物の確実な純粋性、特に干渉副生成物又は不要な微生物を含む混入物の除去が達成されうるので、少なくとも2回希釈系列において培養及び/又は発酵を行うことが好適であることが証明された。嫌気的条件を維持するため、本発明に係る培養及び/又は発酵は、好ましくはH2及びCO2の気体雰囲気において実施され、10:90から90:10、特に約80:20のH2:CO2比を有する気体雰囲気が、特に好ましくは選択される。本発明に係る微生物の増殖にとっては、低い酸化還元電位を有する嫌気的条件が重要であり、驚くべきことに、H2の存在下でのみ充分に迅速な増殖を達成することが可能である。
【0013】
本発明に係る微生物のさらに迅速な増殖は、0.2から3バール、特に約0.5から1バールの過剰圧力において培養及び/又は発酵を実施することにより達成されうるが、これはさらに好ましい実施態様に相当する。好ましくは35から42℃、特に37℃の温度において培養及び/又は発酵を実施することにより、本発明に係る微生物DSM11798のさらに改良された増殖を達成することが可能であった。本発明に係る方法における培養又は発酵にとって最適なpHは、好ましくは6と8の間、特に7と7.5の間であった。これらの条件下で、可能な限り短時間で、比較的少ない希釈系列を用いて、前記の微生物の純粋培養物DSM11798及びその混合培養物(DSM11799)の両方を得ることが可能である。最適な結果は、好ましくはアルギニン、シトルリン、ペプトン、酵母抽出物、(一つ又は複数の)脂肪酸混合物、(一つ又は複数の)鉱物溶液、グルコース、ヘミン(haemin)溶液、メナジオン、ビタミン溶液、微量元素、及び還元剤から選択される成分を含む培地調製物において培養及び/又は発酵を実施することにより、本発明に係る方法を用いて達成されうる。
【0014】
培地調製物に含まれる成分は、この場合、部分的に交換可能であり、例えばグルコースの添加により、混合培養物中の平衡を、エンテロコッカス・カッセリフラバス又は対応するその他の嫌気性微生物の方向へシフトさせることが可能であり、添加されたグルコースの量に特異的に依存して方法を調節することが可能である。特に好ましい本発明の態様によると、培養及び/又は発酵の開始時に、0.1から0.5重量%、特に0.2重量%のグルコースが添加される。0.1から0.5重量%のグルコースの添加により、培養及び/又は発酵の開始時にエンテロコッカス・カッセリフラバスの増殖が促進され、それにより酸化還元電位の低下がもたらされる。酸化還元電位を低下させることにより、本発明に係る微生物にとって最適な増殖条件が作出されるため、グルコースの調節された添加により、例えば培地調製物中のシステインのような化学物質を省くことが可能になる。
【0015】
マイコトキシン、特にトリコテセンの無毒化を達成するため、本発明に係る微生物及び/又は混合培養物によるその他の有利な効果に、好ましくは、活性のあるトリコテセン無毒化微生物及び/又はその他の嫌気性微生物の酵素調製物を、本発明により追加することも可能である。
【0016】
微生物の純粋培養物DSM11798を得るため、好ましくは、微生物の純粋培養物DSM11798が、特に増殖刺激因子としてL−アルギニンが添加された培地調製物における少なくとも2回のさらなる希釈系列により、培養溶液又は発酵溶液から得られるように、本発明に係る方法は実施される。培養溶液又は発酵溶液から培地調製物におけるさらに2回の希釈系列を実施することにより、エンテロコッカス・カッセリフラバスを含む混合培養物から完全に純粋に微生物DSM11798を得ることができ、増殖刺激因子L−アルギニンの添加は平衡を微生物の純粋培養物の方向へと有利にシフトさせる。これに関して、本発明に係る細菌の増殖は、L−アルギニンの濃度が高くなるほど促進される。
【0017】
培地調製物の酸化還元電位をさらに低下させるため、培地調製物の純粋培養物の発酵のため、1から4重量%の還元剤、特にシステイン/硫化ナトリウム/炭酸ナトリウムの混合物が添加された方法が、本発明により好ましくは用いられる。特に経済的理由により、本発明により、還元剤の添加は可能な限り少なく維持され、比較実験の過程で、4重量%を超える還元剤の濃度の増加は微生物の増殖をそれ以上加速させないことが示された。
【0018】
保存可能な最終生成物を得るため、本発明に係る方法は、好ましくは、濃縮、特に遠心分離もしくは濾過、及び/又は安定化、特に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥もしくはカプセル化により、培養溶液又は発酵溶液を製剤化するまで継続される。これに関して、例えば、培養溶液又は発酵溶液は、第一工程において、遠心分離もしくは濾過による液体の除去、並びに/又は好ましくはケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、及びPVPPのような充填剤もしくは担体材料が添加された発酵溶液からの直接的な安定化の実施により濃縮される。これらの担体又は充填剤の添加により、以後の安定化工程、特に凍結乾燥、噴霧乾燥、ペレット化工程のカプセル化において、トリコテセンの無毒化に適した、微生物の純粋培養物DSM11798又はそのエンテロコッカス・カッセリフラバス株との混合培養物DSM1179、もしくは特にエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、又はラクトバチルス属由来のその他の嫌気性微生物との混合培養物の固体生成物が担体上に直接沈積した固体生成物を得ることが可能であり、その結果として、特に容易に管理可能かつ保存可能で、さらに代謝的に好適な生成物が得られる。粘土質の土、ケイ酸アルミニウム、ゼオライトなどのような大きな内表面積を有する物質上に、微生物又はその混合培養物を沈積させることにより、本発明により意図されたトリコテセンの分解がさらに助長される。なぜなら、これらは大きな内表面積を有する物質に物理的に結合し、そこで、本発明に係る微生物による生化学的攻撃が明確に助長されるためである。
【0019】
本発明によると、微生物は、飼料添加剤の製造のため、純粋培養物及び/又は混合培養物(DSM11798、DSM11799)においてさらに用いられる。特に好ましい本発明に係る使用においては、本質的に、純粋培養物及び/又は混合培養物(DSM11798及びDSM11799)が、適宜担体材料が添加された、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥及び/又はカプセル化もしくはペレット化された固定化物として使用される。本発明に係る微生物の純粋培養物及び/又は混合培養物、並びに噴霧乾燥された固定化物はいずれも、飼料添加剤として直接的に用いられうるが、飼料添加剤を、調製中に飼料に直接混合すること、及び/又は動物への給餌中に固体又は液体のいずれかの形態で飼料に混合することも可能である。
【0020】
可能な限り完全なトリコテセンの生理学的に許容される物質への分解又は化学的変換を達成するため、飼料又は動物の消化管におけるトリコテセンの不活化のための本発明に係る飼料添加剤は、本発明に係る微生物の、もしくは本発明により調製された微生物の純粋培養物及び/又は混合培養物を、飼料1000kg当たり105から1012細胞/kg、特に107から109細胞/kgの量で含むことを本質的に特徴とする。105から1012細胞/kg、特に107から109細胞/kgの、トリコテセンの無毒化に適した、本発明に係る微生物、又は微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバス、もしくは特にエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、又はラクトバチルス属のその他の嫌気性微生物との本発明に係る混合培養物の使用により、飼料中の高濃度のトリコテセン、特にデオキシニバレノール、T−2毒素、HT−2毒素、ニバレノール、モノアセトキシサーペノール、ジアセトキシサーペノール、トリコダーモル、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコダーミン、ヒドロキシイソトリコダーミン、カロネクトリン、T−2テトラオール、T−2トリオール、デアセチルネオソラニオール、ネオソラニオール、アセチルネオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サンブシノール、及びカルモリンを、デオキシニバレノールのデエポキシ代謝物(DOM−1)のような化学的に無害な物質に変換することが可能であり、従って本発明に係る飼料添加剤を用いて、動物の生産性の増加、及び毒性の減少のための飼料変換率の改良の両方が達成されうる。
【0021】
本発明によりマイコトキシン、特にトリコテセンの生化学的分解をさらに助長するため、好ましくは、飼料1000kg当たり0.5から8kg、特に0.7から4kgの量で、担体材料及び/又は充填剤が、飼料添加剤にさらに含まれていてもよい。担体材料及び/又は充填剤の添加により、所望により、飼料中に含まれているかもしれない分解すべきマイコトキシンとさらにその他の有害な物質を物理的に物質に結合させ、その結果としてそれがもはや代謝に利用され得なくすることが可能である。
【0022】
この場合、毒素、特にトリコテセンの結合に特に有利であることが証明されているケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、及び/又はPVPPが、担体材料及び/又は充填剤として特に使用される。
【0023】
特に好ましい飼料添加剤は、1から65重量%、特に5から50重量%の噴霧乾燥又は凍結乾燥された微生物の固定化物と、99から35重量%、特に95から50重量%の担体材料及び/又は充填剤との混合物からなることを特徴とする。この型の飼料添加剤は、飼料及び動物の消化管の両方における、デオキシニバレノール(DON)、T−2毒素、HT−2毒素、ニバレノール、モノアセトキシサーペノール、ジアセトキシサーペノール、トリコダーモル、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコダーミン、ヒドロキシイソトリコダーミン、カロネクトリン、T−2テトラオール、T−2トリオール、デアセチルネオソラニオール、ネオソラニオール、アセチルネオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サンブシノール、及びカルモリンの不活化に特に適している。
【0024】
本発明に係る微生物の特徴決定、その増殖及び活性の条件、並びに本発明に係る微生物の補助によるトリコテセンの代謝生成物の形成により、そして給餌試験の実施例により、以下に本発明をさらに説明する。
【0025】
本発明に係る微生物は、活性のあるトリコテセン転換株、特にデオキシニバレノール転換株であり、嫌気的培養条件、即ちCO2:H2(20/80v/v)気体雰囲気及び0.5から1.5バールの過剰圧力における、最適化された栄養培地における反復培養により、ウシ第一胃から得られる。本明細書においては、それぞれの場合において、異なる濃度の2つの異なる鉱物溶液、メナジオン・ストック溶液、ヘミン溶液からなるPYG及びPY培地を培地調製物として用いた。PYG培地には酵母抽出物、ペプトン、グルコースが付加的に添加されていた。酸化還元電子を低下させるため、システイン/Na2S/Na2CO3溶液からなる2から4重量%の還元溶液を、PYG培地及びPY培地の両方に添加し、CO2通気によりpHを7から7.5の値に調整した。この培地調製物の補助により、いくつかの希釈系列を実施することにより微生物の純粋培養物DSM11798を得ることも可能であるし、特にPYG培地を用いて、微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物(DSM11799)を得ることも可能である。微生物の増殖は、充分に低い酸化還元電位を有する絶対嫌気的条件下で、かつH2の存在下でのみ達成される。35℃と38℃の間で微生物の適度な増殖を達成することも可能であるが、微生物の最適な増殖は、約37℃で達成されうる。微生物の純粋培養物DSM11798を培養するためには、液体培地中のL−アルギニンが刺激効果を有する。
【0026】
本発明に係る微生物を用いて、トリコテセンにおいて、毒性12,13−エポキシ環の還元的開裂によりこれらを無毒化することが可能である。
【0027】
ここでは一般的なトリコテセン及び特定のトリコテセン、デオキシニバレノールの補助により、以下に反応図式を示す。
【0028】
【化4】
本発明に係る微生物DSM11798、及びその他の通性嫌気性微生物との共培養物、及びエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物(DSM11799)の発酵を例にとり、発酵条件及び使用可能な発酵法の両方を以下に例示する。
【0029】
発酵条件:
35と42℃の間、特に約37℃の発酵温度;
6と8の間、特に7.0〜7.5の発酵のためのpH範囲;
酸化還元電位:方法が実施される態様に応じて0〜−350mV;
気体雰囲気:10:90から90:10、特に80:20のH2/CO2;
発酵圧力:0.2〜3バール、特に0.5から1バール。
【0030】
必須の培地構成成分:アルギニン、シトルリン、酵母抽出物、ペプトン、ヘミン、及びヘミン含有物質、低級脂肪酸、鉱物溶液、炭酸塩緩衝液(炭酸ナトリウム+CO2)、場合によりグルコース、微量元素溶液、ビタミン溶液、及び還元剤。
【0031】
発酵法を実施するための様々な様式が、本明細書において選択されうる。
【0032】
1)純粋培養物DSM11798の回分発酵:
手順:121℃かつ1.5バール、又は滅菌濾過における培地の滅菌。滅菌されたCO2の通気、並びに炭酸ナトリウム及び還元剤の添加を行いながら、35〜42℃、特に37℃の発酵温度へ培地を冷却。6〜8、特に7〜7.5のpHが達成されるまで通気を継続する。その後、24〜48時間予備培養された1〜10%、特に5%の接種物を添加。定常期の開始まで、基質濃度に応じて約20〜50時間、又は1013〜1016の範囲の微生物数が達成されるまで発酵。
【0033】
このプロセスは、基質濃度により本質的に調節される。
【0034】
2)純粋培養物DSM11798の流加発酵:
手順:1と同様の培地の滅菌、緩衝、還元、及び接種。基質、例えばアルギニン、シトルリンの回分的又は連続的な添加による生物量の増加。培養物は、比較的高いレベルに基質濃度を維持することにより、対数増殖期に維持される。この方法の実施法を用いて、最大60時間の発酵時間が可能である。
【0035】
方法は、基質添加及び発酵時間(最終代謝生成物の蓄積)により本質的に調節される。
【0036】
3)純粋培養物DSM11798の連続発酵:
手順:1と同様の培地の滅菌、緩衝、還元、及び接種。定常期の開始まで回分発酵を行った後、無菌栄養溶液の添加により連続発酵に変換。流出物を貯蔵槽に回収し、回分的又は連続的に噴霧乾燥して製剤化する。
【0037】
4)その他の通性嫌気性微生物及び絶対嫌気性微生物との共培養における純粋培養物DSM11798の連続発酵、又は共培養物DSM11799の発酵。
【0038】
使用されうる共培養物の例:
H2生成体 DSM11798+ブチルビブリオ(Butyrvibrio)種
DSM11798+ルミノコッカス(Ruminococcus)種
プロバイオティクス(probiotics) DSM11798+エンテロコッカス・カッセリフラバス=DSM11799
DSM11798+ストレプトコッカス種(エンテロコッキ(enterococci)
乳酸ストレプトコッキ(lactic acid streptococci)
嫌気性ストレプトコッキ(anaerobic streptococci))
DSM11798+ロイコノストック(Leuconostoc)種.
DSM11798+ヘ゜ディオコッカス(Pediococcus)種
DSM11798+ラクトバチルス種
DSM11798+ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)種
DSM11798+バチルス種
DSM11798+メガスフェラ(Megasphera)種
酵母 DSM11798+サッカロミセス(Saccharomyces)種
DSM11798+クリベロミセス(Klyveromyces)種
DSM11798+カンジダ(Candida)種
発酵における共存生物の使用は、一方では、発酵における酸化還元電位を減少させ、DSM11798のための水素を生成し、かつ製剤化及び安定化における防御的生物として機能する。DSM11798の微生物数減少の最少化がここで起こり、それらは、いくつかの場合においては、動物生産における付加的な生産性促進因子として機能する。
【0039】
4a)共培養における回分発酵:
I)炭酸塩含有培地における共存生物の予備培養。還元剤は含まないが、この目的のため炭酸塩を付加的に含む前記の培地が、酸化還元電位を減少させるために用いられる。その後、共存生物の不活化及びDSM11798の接種。
【0040】
II)共存生物及びDSM11798の同時接種、並びに0.1〜1%炭酸塩の培地への添加。還元剤は含まないが、この目的のため炭酸塩を付加的に含む前記の培地が用いられる。共存生物の増殖は促進され、酸化還元電位が急速に減少し、理想的な増殖条件のためDSM11798が増殖を開始する。
【0041】
III)I+IIとの組み合わせ:発酵の最後に、共存生物の再発酵のための炭酸塩を添加。これにより、増加した生物収量のため、製剤化及び安定化における防御効果(酸素)がもたらされる。
【0042】
4b)共培養における流加発酵:
*)4aIに相当する回分期、その後、2に相当する基質(アルギニン、シトルリン)の連続的/回分的添加。
【0043】
**)4aIに相当する回分期、その後、基質組み合わせ(アルギニン/炭酸塩又はシトルリン/炭酸塩)の連続的/回分的添加。
【0044】
4c)共培養物の連続発酵:
4aIに相当する回分期、その後、アルギニン/炭酸塩又はシトルリン/炭酸塩を含有する栄養溶液の添加による連続的発酵への変換。3と同様の製剤化。
【0045】
発酵生成物の製剤化:
1)膜濾過法(限外濾過、微量濾過)又は遠心分離による濃縮。その後、有機及び/もしくは無機担体材料を用いた、又は用いない、噴霧乾燥又は凍結乾燥。
2)有機及び/もしくは無機担体材料を用いた、又は用いない、直接的な噴霧乾燥又は凍結乾燥。
3)有機及び/もしくは無機担体材料を用いた、又は用いない、連続的な発酵液の噴霧乾燥。
4)1、2、又は3と組み合わせられたカプセル化又はペレット化。
【0046】
腸内培地におけるDON生物学的転換株(DSM11798)の活性を確認するため、ブタの腸を用いたインビトロ・モデルを開発した。
【0047】
これに関して、第一の実験において、腸内容物を含む、凍結乾燥物が添加された緩衝液を用いたインビトロ・モデルを開発した。
【0048】
新たに屠殺されたブタの小腸及び大腸を、CO2雰囲気下で維持した。CO2雰囲気下で、腹側、中央、及び背側の小腸及び大腸の切片の内容物を個別の容器に空けた。
【0049】
20mlの嫌気的緩衝液+1gの腸内容物(CO2通気)+DONを、CO2又はH2/CO2雰囲気下で37℃でインキュベートした。
【0050】
ここで、小腸の腹側切片には、活性のある凍結乾燥物を添加した場合、著しい陽性の効果が認められることが見出された。純粋なCO2通気下においても著しい活性が検出されうるという事実は、ここで特に重要であった。
【0051】
第二のインビトロ実験は、活性のある懸濁液が添加されたブタの腸の完全な切片を用いて実施された。
【0052】
嫌気的な還元された予備インキュベートされた緩衝液(30ml)中で、37℃で、ブタの腸の切片(腹側、中央、背側、大腸、各々6〜8cm)を、200ppmのDONと共に24時間インキュベートした。
【0053】
この改変されたインビトロ試験変法は、屠殺直後に完全な腸が実験室に輸送され、そこで所望の長さの切片に血行が止められるため、腸の生理学的条件がほとんど影響を受けないという利点を有する。その後、切片は分離され、DON及び活性のある培養物を含む緩衝溶液中でインキュベートされる。
【0054】
結果は、明白である。DONのDOM−1への脱エポキシ化は、活性のある培養物により達成されうる。この活性が腸の全ての切片において示され、最も高い活性が腹側腸において見出されるということは重要である。これは、食物吸収の主要な部分である限りにおいて重要であり、従ってマイコトキシンの放出も同様にそこで起こる。
【0055】
ニワトリ細胞培養物に関する実験プロトコルの補助により、ブタ及びニワトリにおける給餌例において、純粋培養物(DSM11798)、並びに微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物(DSM11799)、及び特にエンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、バチルス属、又はラクトバチルス属のその他の嫌気性微生物との混合培養物の両方における本発明に係る微生物の作用を以下に証明する。
【0056】
ニワトリ細胞培養物を用いた実験プロトコルの補助により、微生物がマイコトキシン、特にトリコテセン、特にデオキシニバレノール及びT−2毒素を化学的に分解することができ、特に還元し生理学的に許容される物質、デオキシニバレノールの場合であればその脱エポキシ代謝物、即ちDOM−1へと変換することができることが示された。
【0057】
ニワトリ・リンパ球を培養するため、以下の条件が付加された。
【0058】
用いられた細胞数:2×106細胞/ml
刺激:ConA 5μg/ml
マイコトキシン:DON、DOM−1、及びT2毒素
濃度範囲:DON:10〜0.08μg/ml
DOM−1:232〜1.81μg/ml
T2毒素:30〜0.234ng/ml
総インキュベート時間:44時間。そのうち16時間はインキュベーター中での培養中の標識時間:40℃、5%CO2、飽和水蒸気雰囲気。
【0059】
ニワトリ・リンパ球細胞培養物を用いた実験プロトコルの補助により、活性のある培養物がマイコトキシン、特にトリコテセンを生化学的に分解することができ、特に還元し生理学的に許容される物質へと変換することができることが示された。DON及びその脱エポキシ代謝物DOM−1を例として、これを以下に示す。
【0060】
細胞培養物の顕微鏡による確認:
ニワトリ・リンパ球を含む細胞培養物を、培養中、継続的に顕微鏡により確認した。
【0061】
20時間後の確認:
未刺激細胞は、厚く、不均一に分布しており、ConAを用いた確認は、強力な刺激及び明白な増殖フォーカスを示す。
【0062】
DON:全ての濃度段階において増殖フォーカスが見られるが、10μg/ml〜0.625μg/mlの濃度範囲において、毒素濃度が増加するにつれ、増殖フォーカスの著しい減少が観察される。
【0063】
DOM:58μg/mlという最も高い濃度段階まで、対照と比較して明白な変化がない、全ての濃度段階における増殖フォーカス。
【0064】
これは、20時間後ですら、0.625μg/mlの濃度から、毒素バッチにおける細胞活性に対する著しい有害効果が存在し、脱エポキシ代謝物自体には、細胞培養物に対する負の効果が、58μg/mlの濃度ですら見られないことを意味している。
【0065】
28時間後及び44時間後の確認:
対照バッチ(未刺激及びConA)は不変である。
【0066】
細胞培養物に対するDONの作用はさらに増加した。20時間後ですら変化が見出されたこれらの系列において、細胞に対する著しい損傷が見られた。
【0067】
これらのインキュベーション時間の後ですら、58μg/mlの脱エポキシ代謝物濃度ですら、細胞活性に対する有害な効果は見出すことができなかった。
【0068】
第二の実験において、離乳子豚に給餌された、マイコトキシン、デオキシニバレノールを450ppbの量で含む飼料における、本発明に係る飼料添加剤の作用を調査した。
【0069】
動物:「ラージホワイト(Large White)」及び「ランドラッセ(Landrasse)」という品種の子豚を、陰性比較群、陽性比較群、及び被検群に分割した。離乳(子豚の20から22日齢)の直後に開始された実験;動物の生産性パラメータを14日後に決定した。
【0070】
給餌:離乳の7日後に商業的に入手可能な子豚スターターをブタに給餌し、その後、商業的に入手可能な子豚成長飼料を与えた。マイコトキシン、デオキシニバレノールを、陽性比較群及び被検群の飼料に導入するため、450ppbの濃度で(エタノールに溶解して)飼料の少量の一部と混合した。飼料は無制限に与えた。
【0071】
飼料添加剤の用量:飼料添加剤を被検群の飼料に1kg/tの用量で添加した。用いられた飼料添加剤は、本発明に係る微生物とエンテロコッカス・カッセリフラバスとの混合培養物(DSM11799)であり、ケイ酸アルミニウムが担体として混合培養物に添加されていた。
【0072】
微生物数:4×108細胞/kgの最終飼料。
【0073】
結果:結果は表1に要約されている。表1は、この試験における体重増加の平均及び飼料変換率の平均を示し、陰性対照群はマイコトキシンも本発明に係る微生物も含まない飼料を給餌され、陽性対照群はマイコトキシンのみ含む飼料を給餌され、被検群はマイコトキシン及び本発明に係る微生物を含む飼料を給餌された。
【0074】
表1
【0075】
【表1】
考察:この試験より、飼料添加剤が、離乳子豚に対するデオキシニバレノール混入の有害効果を補償できること、並びにマイコトキシン及び飼料添加剤の両方を受容した子豚が、陰性対照群と本質的に同量の飼料を消費し、同等の飼料変換率(FCR)をも示したことが明らかである。これらの結果は、本発明に係る混合培養物(DSM11799)により、デオキシニバレノールの負の効果をほぼ完全に補償することが可能であることを明らかにした。
【0076】
さらなる試験において、本発明に係る飼料添加剤のトリコテセン混入に対する効果が、ニワトリ飼料において示された。用いられたパラメータは、最終体重、飼料摂取量、及び飼料変換率、並びにニワトリの損失である。臨床的な症状も記録された。
【0077】
動物:コブ(Cobb)品種のニワトリを誕生日以後調査した。10,700匹、10,900匹、及び15,700匹のニワトリを含む3つの群を用いて試験を実施した。特定のニワトリ飼料を無制限にニワトリに投与した。
【0078】
飼料添加剤の用量:飼料添加剤をニワトリ飼料1t当たり1kgの用量で含ませ、被検群のみに飼料添加剤を与えた。用いられた飼料添加剤は、微生物の純粋培養物(DSM11798)であった。
【0079】
微生物数:最終飼料1kg当たり1×109細胞。
【0080】
トリコテセンを750ppbの全量(500ppbのDON及び250ppbのT−2毒素)で含む飼料を、被検群及び陽性対照群に投与した。
【0081】
結果:以下の表は3つの群全ての生産性パラメータを示す。
【0082】
表2
【0083】
【表2】
臨床的観察:陽性対照群の多くの動物に著しい口内炎症が認められた。
【0084】
考察:この場合においても、飼料添加剤は、家禽に対するトリコテセンの有害効果を、生産性パラメータ及び臨床的症状に関して補償することができた。家禽の場合においても、マイコトキシンに加えて微生物DSM11798を受容した被検群のニワトリは、陰性対照群よりもわずかに低い平均飼料摂取量で、わずかに高い平均最終体重を有し、その結果として、幾分改良された生産性パラメータが陰性対照群との関係において生じた。本発明に係る微生物を含む本発明に係る飼料添加剤を用いた場合、マイコトキシンの有害な効果が補償されるのみならず、微生物DSM11798を受容した動物において生産性のさらなる増加を達成することが可能であることが示される。
Claims (25)
- 12,13−エポキシ環の還元的開裂によるトリコテセンの無毒化のための、純粋培養物中のオウバクテリウム(Eubacterium)属の微生物DSM11798。
- デオキシニバレノール(deoxynivalenol)(DON)、T−2毒素、HT−2毒素、ニバレノール(nivalenol)、モノアセトキシサーペノール(monoacetoxyscirpenol)、ジアセトキシサーペノール(diacetoxyscirpenol)、トリコダーモル(trichodermol)、ベルカリン(verrucarin)、ロロジン(rorodin)、アセチルデオキシニバレノール(acetyldeoxynivalenol)、イソトリコダーミン(isotrichodermin)、ヒドロキシイソトリコダーミン(hydroxyisotrichodermin)、カロネクトリン(calonectrin)、T−2テトラオール(T−2 tetraol)、T−2トリオール(T−2 triol)、デアセチルネオソラニオール(deacetylneosolaniol)、ネオソラニオール(neosolaniol)、アセチルネオソラニオール(acetylneosolaniol)、スポロトリキオール(sporotrichiol)、トリコトリオール(trichotriol)、サンブシノール(sambucinol)、及びカルモリン(culmorin)を無毒化することを特徴とする、請求項1に記載の微生物。
- 分子内に含まれるエポキシド基の還元的生物学的転換によりトリコテセンを無毒化することを特徴とする、請求項1又は2に記載の微生物。
- 個別に、対で、又は長鎖で発生する嫌気性グラム陽性桿状非胞子形成性細菌であることを特徴とする、請求項1、2又は3に記載の微生物。
- 純粋培養物DSM11798が、希釈系列及び嫌気的培養条件において少なくとも2回培養及び/又は発酵を行うことにより、微生物DSM11798から得られることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の微生物の培養物を得るための方法。
- 培養及び/又は発酵がH2及びCO2の気体雰囲気において実施されることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 気体雰囲気が、10:90から90:10、特に約80:20のH2:CO2比で選択されることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 培養及び/又は発酵が、0.2から3バール、特に0.5から1バールの過剰圧力において実施されることを特徴とする、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
- 培養又は発酵が、35から42℃、特に37℃の温度において実施されることを特徴とする、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
- 培養及び/又は発酵が、6と8の間のpH、特に7と7.5の間のpHにおいて実施されることを特徴とする、請求項6から10のいずれか一項に記載の方法。
- 培養及び/又は発酵が、アルギニン、シトルリン、ペプトン、酵母抽出物、(一つ又は複数の)脂肪酸混合物、(一つ又は複数の)鉱物溶液、グルコース、ヘミン(haemin)溶液、メナジオン、ビタミン溶液、微量元素、還元剤の中から選択される成分を含む培地調製物において実施されることを特徴とする、請求項6から11のいずれか一項に記載の方法。
- 0.1から0.5重量%、特に0.2重量%のグルコースが、培養及び/又は発酵の開始時に添加されることを特徴とする、請求項6から12のいずれか一項に記載の方法。
- 活性のあるトリコテセン無毒化微生物及び/又はその他の嫌気性微生物の酵素調製物が添加されることを特徴とする、請求項6から13のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物の純粋培養物DSM11798が、特に増殖刺激因子としてLアルギニンが添加された培地調製物における少なくとも2回のさらなる希釈系列により、培養溶液及び/又は発酵溶液から得られることを特徴とする、請求項6から14のいずれか一項に記載の方法。
- 培地調製物の純粋培養物の発酵のため、1から4重量%の還元剤、特にシステイン/硫化ナトリウム/炭酸ナトリウムの混合物を含む溶液が添加されることを特徴とする、請求項15記載の方法。
- 培養溶液及び/又は発酵溶液を濃縮すること、特に発酵溶液を遠心分離もしくは濾過によって濃縮すること、及び/又は特に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥もしくはカプセル化により安定化することによって、培養溶液及び/又は発酵溶液を製剤化することを特徴とする、請求項6から16のいずれか一項に記載の方法。
- 安定化が、ケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、PVPPのような充填剤又は担体材料の添加により実施されることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- 飼料添加剤の調製のための純粋培養物(DSM11798)中の微生物の使用。
- 純粋培養物(DSM11798)が、凍結乾燥又は噴霧乾燥及び/又はカプセル化された、担体材料が添加されていてもよい固定化物として使用されることを特徴とする、請求項19記載の使用。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の微生物もしくは請求項6から18のいずれか一項に従い調製された微生物の純粋培養物を、飼料1000kg当たり10 8 から10 15 細胞、特に10 10 から10 12 細胞の量で含むことを特徴とする、飼料又は動物の消化管におけるトリコテセンの不活化のための飼料添加剤。
- 担体材料及び/又は充填剤を、飼料1000kg当たり0.5から8kg、特に0.7から4kgの量でさらに含むことを特徴とする、請求項21記載の飼料添加剤。
- ケイ酸アルミニウム、珪藻土、炭水化物、糖アルコール、デンプン、粉乳、乳清粉末、タンパク質加水分解物、酵母、及び/又はPVPPが担体材料又は充填剤として含まれていることを特徴とする、請求項22記載の飼料添加剤。
- 1から65重量%、特に5から50重量%の噴霧乾燥又は凍結乾燥された微生物の固定化物と、99から35重量%、特に95から50重量%の担体材料及び/又は充填剤との混合物からなることを特徴とする、請求項21、22又は23に記載の飼料添加剤。
- 飼料又は動物の消化管におけるデオキシニバレノール(DON)、T−2毒素、HT−2毒素、ニバレノール、モノアセトキシサーペノール、ジアセトキシサーペノール、トリコダーモル、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコダーミン、ヒドロキシイソトリコダーミン、カロネクトリン、T−2テトラオール、T−2トリオール、デアセチルネオソラニオール、ネオソラニオール、アセチルネオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サンブシノール、及びカルモリンの不活化のための、請求項21から24のいずれか一項に記載の飼料添加剤の使用。
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