KR101617596B1

KR101617596B1 - 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 미생물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101617596B1
Application number: KR1020150132234A
Authority: KR
Inventors: 이상석; 김선호
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2016-05-02
Also published as: KR20150115697A

Abstract

본 발명은 푸마르산 환원균으로서 푸마르산 환원균으로서, 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD(KCCM 11098P) 및 이를 이용하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD(KCCM 11098P)은 재래산양의 반추위에서 분리한 것이므로, 화학적인 방법을 사용하여 메탄 생성을 억제시키는 것이 비하여 인체나 동물에 부작용이 적고 안전하며, 반추위 내 메탄을 생성하는 원인을 근본적으로 감소시켜 메탄 생성을 억제하는 효과를 나타낸다. 아울러, 상기 미생물을 이용하여 미생물 제제 및 축산용 사료 등을 제조하여 반추동물에 제공하는 경우 반추동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하고, 사료 이용 효율을 증가시켜 부가적인 경제적 이득을 취할 수 있다.

Description

반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 미생물 및 이의 이용{Microorganism capable for reducing methane produced by rumen of ruminant animals}

본 발명은 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 미생물 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 메탄 생성 억제능을 가지는 미생물, 이를 포함하는 미생물 제제, 상기 미생물 제제를 포함하는 반추동물의 메탄 생성 저감용 사료 및 상기 미생물 제제 및/또는 축산용 사료를 이용하여 메탄을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

최근 전 세계적으로 온실가스에 의한 지구온난화 문제에 국제적인 관심이 증가하고 있는 추세이다. 우리 정부도 2010년 저탄소 녹색성장이라는 기본법을 제정하여 온실가스 배출을 줄이기 위해 체계적인 기후변화 예측 적응 및 대응 역량 강화, 신성장동력으로서의 친환경 산업 육성 등 다양한 정책을 추진하고 있다.

지구온난화를 일으키는 주요 온실가스로는 국제연합 기후변화협약(UNFCC)에서 지정한 6대 온실 가스인 이산화탄소(CO₂), 메탄가스(NH₄), 아산화질소(N₂O), 과불화탄소(PFCS), 수소불화탄소(HFCS), 불화유황(SF₆)이며, 이들 온실가스가 증가함에 따라 지구의 평균 기온과 해수면이 상승하였으며, 사막화, 가뭄, 홍수, 태풍 등 기상 이변이 발생하고 있다. 이 중 메탄가스는 이산화탄소 다음으로 지구온난화에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로서, 전세계적으로 연간 5억톤 이상이 대기로 방출되고 있으며 전체 지구온난화에 15~17% 정도 기여하고 있다. 또한 메탄가스는 이산화탄소보다 적외선을 흡수하는 능력이 21배 높기 때문에 지구온난화에 미치는 영향이 매우 크다고 보고되고 있으며, 반추 동물의 장내 발효에 의한 소화과정에서 발생하는 메탄 생성이 전 세계 메탄 배출량 중 15%를 차지하는 것으로 알려져 있다(Crutzen, 1995). 또한 국내의 경우 동물이 생산하는 총 메탄 배출량 중 반추 동물인 소가 차지하는 비율은 약 75%에 육박하고 있으며, 육류소비 증가 식습관에 따라 가축사육두수 또한 매년 증가하고 있는 추세로 그에 따른 축산분야의 온실가스 발생량의 증가도 불가피할 전망이다(에너지경제연구원, 2007).

한편, 반추동물이 섭취한 사료는 반추위에서 반추 미생물에 의해 분해되어 최종 분해산물로써 이산화탄소, 암모니아, 수소, 휘발성 지방산 등이 생산된다. 이와 같은 발효산물들 중 휘발성 지방산이나 암모니아 등은 반추가축이나 반추 미생물에 의해 이용되어 결국 가축의 생산성에 중요하게 작용하지만, 이산화탄소와 수소는 발효의 가장 마지막 단계에서 메탄 생성 박테리아에 의해 메탄으로 생성되거나 경쟁적으로 푸마르산 환원 미생물에 의해 숙신산을 생성하게 되며, 특히 메탄이 생성되는 경우에는 반추동물의 체내에서 흡수되지 못하고 1시간에 15 내지 20회 정도로 대기로 방출되기 때문에 문제가 되고 있다.

이와 같이, 반추 동물의 반추위 내에서 메탄이 생성되는 경우 지구 온난화로 인한 환경 문제가 발생하고 사료 이용 효율이 감소되기 때문에 이의 생성을 억제하기 위한 여러 가지 방안이 연구되고 있다(Ha et al., 2009; Kin et al., 2011; Itabashi et al., 1994; Whitelaw, 1984; Oh et al. 1998; Kongmun et al., 2011).

반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하기 위한 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 메탄 생성의 전구물질인 수소의 발생량을 제어하기 위하여 수소를 이용할 수 있는 질산염이나 아질산염과 같은 화합물을 사용하는 것인데, 이 경우 세포에 필요한 산소의 공급이 부족하게 될 염려가 있다. 두 번째 방법은 메탄 생성 미생물에 독성을 주는 화합물인 이오노포어나 항생 물질 등을 사용하는 것인데, 장기간 투여하는 경우 메탄 생성 미생물이 적응을 하여 메탄 생성 억제 효과가 감소한다는 문제점이 있다. 또한, 상기의 방법들은 화합물을 이용하는 것이므로 이러한 물질이 축산물에 잔류하는 경우 안전성에 문제가 될 수 있으며 반추위 내의 유용한 미생물의 성장을 함께 저하시키므로 사료 이용 효율이 저하되고 생산성이 약화되는 문제점이 있어 천연물질에서의 첨가제 및 사료개발 연구가 이루어지고 있지만 대부분이 in vitro에 의한 실험실적 방법이고, 실제로 가축에 급여하여 지속적인 효과를 보이는 메탄 저감방법은 개발되지 않고 있다.

반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하기 위한 방법과 관련하여, 대한민국 공개특허 제2006-0019062호는 생강, 부추 추출물 및 복합리놀레산 중 어느 하나 이상을 포함하는 반추 동물의 반추위 내의 프로토조아를 선택적으로 감소시키는 사료 조성물에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2011-0119370호는 농후사료 35 내지 45중량%, 티모시 35 내지 45중량% 및 볏짚 10 내지 30중량%를 포함하는 반추 동물의 온실가스 발생량을 억제시키기 위한 사료 조성물 및 반추 동물의 사육 방법에 대하여 개시하고 있다. 그리고, 대한민국 공개특허 제2011-0036470호는 마늘을 포함하는 반추 동물의 메탄가스 생성 저감용 사료에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 제2011-0039540호는 동물 기원의 모든 지방을 배제하고 포화 지방산을 함유하는 식물성 오일의 외인성 섭취를 제한하는 방법 등을 이용하여 착유용 반추 동물에 의하여 생성되는 메탄의 양을 감소시키고 조절하기 위한 방법에 대하여 개시하고 있다. 또한, 일본 등록특허 제5192108호는 유산균, 효모 및 올리고당으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 것을 특징으로 하는 반추동물용 메탄 생성 억제용 조성물에 대하여 개시하고 있으며, 중국 공개특허 제102106462호에는 감초, 자밀 또는 자밀을 분비하는 설탕으로 이루어진 반추동물용 메탄 생성 억제용 조성물에 대하여 개시하고 있다. 그러나 본 발명의 엔테로코커스(Enterococcus)속 미생물을 이용하여 반추 동물의 반추위 내에서 메탄 생성을 억제하기 위한 방법에 대해서는 개시되어 있지 않다.

이에 본 발명자들은 온실가스의 한 종류인 메탄이 반추 동물의 반추위 내에서 생성되는 것을 억제시켜 지구 온난화를 막고, 사료 이용 효율을 증대시키면서도 메탄 생성을 억제시키는 과정에서 인체나 동물에 해를 주지 않는 미생물을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 반추 동물의 반추위 내에서 분리한 미생물로부터 신규한 미생물을 발견하고, 상기 미생물이 메탄 생성 미생물과 효과적으로 기질 경쟁을 하고 숙신산을 생성함으로써 메탄 생성을 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 포함하는 메탄 생성 억제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물 또는 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 동물에게 급여하여 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 포함하는 반추동물의 반추위 내 메탄 생성 억제용 미생물 제제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 반추 동물(ruminant animals)은 포유류 소목에 속하는 동물로 소화 형태상 한번 삼킨 먹이를 다시 게워 내워 씹는 특성을 가진 동물로서 되새김 동물이라고도 불리운다. 상기 반추동물은 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과에 속하는 소, 염소, 황소, 물소, 들소, 사슴, 낙타, 양 등의 반추위가 있는 동물이라면 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소이다.

본 발명에 있어서, 상기 메탄은 이산화탄소 다음으로 지구온난화에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로, 반추동물이 탄수화물을 포함하는 사료를 섭취하는 경우 메탄 생성 미생물에 의해 반추위 내에서 생성하게 되는데, 이는 사료 이용 효율을 떨어뜨리는 원인 중 하나이므로, 반추동물의 반추위 내의 메탄 생성을 억제시키는 것이 중요하다.

본 발명에 있어서, 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)은 재래산양의 반추위에서 생장하는 세균 중 하나이며, 반추 동물이 사료를 섭취하는 경우 반추위 내 미생물에 의해 발효 및 분해하면서 최종 분해산물 중 이산화탄소 또는 수소를 이용하여 푸마르산을 환원하여 숙신산을 생성하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 재래산양의 반추위액을 수집한 후 혐기성 배지에 배양하여 우수한 생장과 푸마르산 환원효소를 가진 미생물을 분리 및 확인하고 계통수를 작성한 결과, 새로운 균주를 발견하게 되었고, 그 새로운 균주는 축사의 악취 제거능을 갖는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD으로, 2010년 8월 31일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 "KCCM 11098P"로 기탁된 균주인 것으로 확인되었다.

하나의 구체적 실시에서, 염을 포함한 혐기성 배지에 각기 다른 균주들을 접종한 후 총 가스량, pH, 휘발성 지방산 및 메탄 생성량을 측정한 결과, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD은 휘발성 지방산의 함량을 증가시키고, 메탄 발생량은 감소시켰다.

따라서 본 발명의 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD는 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시키고, 사료 이용 효율을 증가시키는데 지금까지 보고된 어떠한 다른 미생물에 비하여 효과적으로 사용 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 제제는 메탄 생성 억제 활성을 가진 미생물로 이루어진 제제를 말하며, 구체적으로 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD를 사용할 수 있다. 또한, 상기 미생물 이외에 메탄 생성 억제능이 공지된 미생물, 예를 들어, 트리코스포론( Trichosporin) 속, 칸디다(Candida) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속 등에 속하는 미생물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 미생물을 포함할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 제제는 상기 미생물을 배양한 상태의 액상형태, 또는 동결건조, 열풍건조, 감압건조 등의 방법을 이용하여 건조된 건조분말형태의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 미생물 제제의 제형이 액상형태인 경우 상기 미생물의 배양액을 혼합하거나 희석하고, 미생물을 안정화시키기 위해 포도당이나 글리세린을 혼합한 후 미생물의 최종 농도가 5 내지 20중량%, 바람직하게는 10 내지 15중량%가 되도록 제조한다. 상기 미생물의 농도가 5중량% 미만인 경우에는 미생물 제제의 메탄 생성 억제 효과가 미미할 수 있으며, 미생물의 함량이 20중량%를 초과하는 경우에는 그 이하의 함량을 포함하는 미생물 제제에 비하여 메탄 생성 억제 효과의 증가가 미미하여 비경제적인 문제가 있다. 액상형태로 미생물 제제를 사용하는 경우 건조분말형태 제형에 비하여 활성이 빠르고 취급이 간편한 장점이 있다.

상기 미생물의 제형이 건조분말형태인 경우 상기 미생물을 담체에 부착시킨 후 수분 함량이 0.1 내지 10중량%가 되도록 건조시키고 분쇄하여 제품화한다. 수분함량이 10중량%를 초과하는 경우에는 미생물의 재활성화 효율이 떨어지거나 그 이하의 수분 함량을 가진 미생물 제제에 비하여 메탄 생성 억제 효과의 증가가 미미하여 비경제적인 문제가 있다. 건조분말형태로 미생물 제제를 사용하는 경우 제조공정이 단순하고 제품 생산비가 낮으며, 보존성이 좋다는 장점이 있다.

상기 담체는 점토류, 활성탄, 코크스, 화산재 및 연소재 등이 사용될 수 있으며, 상기 점토류는 제올라이트, 질석, 규조토, 고령토, 옹기토, 장석, 차지토 및 활석 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 건조분말형태의 미생물 제제는 부형제가 추가 포함될 수 있다. 상기 부형제는 아미노산, 비타민 C, 비타민 E, 키토산 및 포도당 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 메탄 생성 억제용 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 사료는 반드시 이로 제한되는 것은 아니나 옥수수, 소맥, 밀, 대두밀, 대두박, 연맥, 콩, 쌀 등의 어느 하나 또는 이들로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 혼합물을 분쇄하여 얻어지는 분쇄물과 이들을 가공하는 과정에서 얻어지는 쌀겨, 밀겨, 보릿겨와 같은 가공 부산물이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 축산용 사료는 메탄 생성 억제용 미생물 제제가 사료의 총 중량에 대하여 0.1 내지 0.5중량%, 바람직하게는 0.3중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 미생물 제제가 0.1중량% 미만인 경우에는 축산용 사료의 메탄 생성 억제 효능이 미미할 수 있으며, 미생물 제제가 0.5중량%를 초과하는 경우에는 그 이하의 함량을 가지는 미생물 제제와 비교하여 메탄 생성 억제 효과의 증가가 미미하여 비경제적인 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 축산용 사료는 반드시 이로 제한되는 것은 아니나 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과에 속하는 소, 염소, 황소, 물소, 들소, 사슴, 낙타, 양 등의 반추위가 있는 동물에 제공하기 위한 것이며, 바람직하게는 소에 제공하기 위한 것이다.

본 발명에 따른 축산용 사료 내의 미생물은 무독성이며, 열, 담즙, 위액, 항생물질에 대한 강한 내성을 가지고 있어 장으로 가는 동안 살아남는 특성을 가진다. 또한, 혐기성 환경에서도 증식 가능하여 생리활성물질을 생산하며, 장내 상피세포나 점막에 흡착하여 생활할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 축산용 사료를 섭취하는 경우 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시켜 지구 온난화 효과를 방지할 수 있으며, 사료 이용 효율을 증대시킬 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 반추 동물에게 급여하여 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)은 반추 동물이 사료를 섭취하는 경우 반추위 내 미생물에 의해 발효 및 분해하면서 최종 분해산물 중 이산화탄소 또는 수소를 이용하여 푸마르산을 환원하여 숙신산을 생성하는 것을 특징으로 한다.

상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)은 반추 동물의 반추위 내에서 메탄 생성을 억제할 수 있는 미생물이라면 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD이다.

본 발명에 있어서, 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD는 본 발명자들에 의하여 재래산양의 반추위에서 분리된 축사내 악취 제거능을 갖는 장내 구균으로서 메탄 생성 미생물과 효과적으로 기질 경쟁을 하여 숙신산을 생성하므로 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시키는 효능을 나타낸다.

*본 발명에 있어서, 상기 반추 동물은 반추위가 있어 되새김질을 하여 음식을 소화시키는 동물을 말하며, 예를 들어 낙타과, 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과에 속하는 소, 염소, 황소, 물소, 들소, 사슴, 낙타, 양 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 소이다.

본 발명에 있어서, 상기 급여는 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)이 포함된 미생물 제제 또는 상기 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료를 반추 동물에게 제공하는 것을 말하나, 반추 동물에게 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 제공하는 방법이라면 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)이 포함된 미생물 제제를 물 등으로 액체화하여 액체화된 미생물 제제를 주사기 등을 이용하여 반추위 내로 투여하거나 미생물제제를 포함하는 사료를 제공할 수도 있다.

상기 미생물 제제는 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 메탄 생성을 억제하는 2종 이상의 혼합균주자체, 액상형태 또는 건조분말형태일 수 있으며, 상기 미생물 제제의 특성 및 함량은 상술한 바와 같다.

본 발명의 상기 축산용 사료는 상기 미생물 제제를 포함하고 있는 반추 동물이 성장하기 위해 반추 동물에 급여하는 먹이를 말하며, 그 특성 및 함량은 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 축산용 사료를 반추 동물에게 급여하여 반추 동물이 이를 섭취하는 경우 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하여 지구 온난화를 방지할 수 있으며, 사료 이용 효율을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD는 재래산양의 반추위에서 분리한 것이므로, 화학적인 방법을 사용하여 메탄 생성을 억제시키는 것에 비하여 인체나 동물에 부작용이 적고 안전하며, 반추위 내 메탄을 생성하는 원인을 근본적으로 감소시켜 메탄 생성을 억제하는 효과를 나타낸다. 아울러, 상기 미생물을 이용하여 미생물 제제 및 축산용 사료 등을 제조하여 반추동물에 제공하는 경우 반추동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하고, 사료 이용 효율을 증가시켜 부가적인 경제적 이득을 취할 수 있다.

도 1은 가용성 탄수화물을 기질로 사용하고, 배양 24시간 후의 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD(KCCM 11098P)의 휘발성 지방산 함량 및 탄소 생성 억제 정도를 측정한 결과이다.

본 발명은 이하 실시예를 통하여 좀 더 구체적으로 설명될 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명이 좀 더 이해될 수 있도록 예시적으로 제시되는 것이므로, 이들 실시예로서 본 발명의 범위를 한정해서는 안 될 것이다.

실시예 1: 재래산양의 사육 환경 및 위액의 수집

재래산양은 전라남도 화순에서 사육하였고, 평균체중이 45kg인 재래산양을 사용하였다. 시험 기간 동안 재래산양에게 티모시 건초를 체중의 2%의 양으로 1일 2회 급여하였고, 물은 자유 섭취하도록 하였다. 그 다음 상기 재래산양을 도축하여 반추위액을 채취하였다. 채취한 반추위액은 붕대용 거즈(surgical gauze)에 여과한 후 혐기상태 및 39℃의 플라스크에 옮겨 담았다.

실시예 2: 재래산양의 위액으로부터 균주 분리

2-1. 선택배지 제조

증류수 1L에 펩톤 C(Pancreatic digest of casein) 17g, 펩톤 A(Peptic digest of animal tissue) 3g, 효모 추출물(Yeast extract) 5g, 옥스골(Oxgall) 10g, 염화나트륨(Sodium chloride) 5g, 에스쿨린(Esculin) 1g, 구연산 철 암모늄(Ferric ammonium citrate) 0.5g, 아지드화 나트륨(Sodium azide) 0.25g, 구연산 나트륨 1g 및 한천(Agar) 13.5g을 섞고 마개로 막은 후, 염산(HCl)을 첨가하여 pH가 6.0 내지 6.3이 되도록 적정하였다. 그 다음 1기압, 121℃의 온도에서 15분 동안 멸균시킨 후 이산화탄소가 공급되는 챔버에 30분 동안 반응시켜 배지를 제조하였다.

2-2. 균주 분리 및 보관

상기 실시예 1에서 수집한 재래산양의 위액을 10^-5 내지 10^-7 희석한 후 상기 실시예 2-1의 고체배지에 도말하여, 혐기성 환경의 챔버 내의 39℃ 인큐베이터에서 30시간 동안 배양하여 분리하였다. 상기 분리된 균주는 30% 글리세롤에 저장한 후 -70℃에 얼려 분석하기 전까지 보관하였다.

2-3. PCR 수행 및 DNA 확인

상기 실시예 2-2에서 분리한 균주를 50ml 튜브에 담고 세포용해용액(500mM EDTA, pH 9.4) 75㎕를 첨가하여 1분 동안 액체 질소에 담근 후 바로 60℃의 온도에서 녹이는 과정을 4번 반복하였다. 그 다음 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) 용출기법을 이용하여 총 게놈성 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 상기 분리한 총 게놈성 DNA(genomic DNA, 50ng)를 주형으로 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 프라이머와 1492R(5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 프라이머를 사용하여 94℃의 온도에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃의 온도에서 45초, 55℃의 온도에서 45초 및 72℃의 온도에서 1분 주기로 32회 수행하고 마지막에는 72℃의 온도에서 10분 동안 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응(Polymerrase chain reaction, PCR)을 통해 16S rDNA를 증폭시켰다. 그 다음, 상기 증폭한 DNA를 EtBr(ethidium bromide)을 이용하여 전기영동법에 의하여 DNA를 확인한 결과, 22종의 균주를 분리하였다.

실시예 3: 푸마르산 환원균 관련 유전자의 검출 및 계통수의 작성

3-1. 푸마르산 환원균 관련 유전자의 검출

상기 실시예 2-3에서 분리한 균주를 푸마르산 환원효소 관련 유전자(Fumarate reductase gene, frd gene)을 이용하여 분리 및 동정하기 위해 frdA-Cf 프라이머와 frdA-Dr 프라이머를 사용하여 상기 실시예 2-3의 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 다음 상기 증폭한 DMA를 EtBr(ethidium bromide)을 이용하여 전기영동법에 의하여 푸마르산 환원효소 유전자를 가지는 균주를 선별하였다.

3-2. 푸마르산 환원균의 계통수 작성

상기 실시예 3-1에서 선별한 균주의 계통학적 소속을 결정하기 위해 BLAST 프로그램 및 EzTaxon을 이용하여 NCBI의 Gene Bank에 있는 16s rRNA 유전자의 염기서열과 비교하였다.

염기서열 정렬은 DLUSTAL W version 1.6을 이용하여 수행하였으며, Kimura two-parameter model에 따라 계산된 distance matrix를 사용하고, NJ(neighbor-joining) 방법에 의해 계통수를 작성하였으며, 부트스트랩(bootstrap) 값은 1,000회 반복하여 계산하였다.

실험 결과, 푸마르산염 분해능을 가지는 균주는 축사내 악취 제거능을 갖는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD의 염기서열과 100% 일치하는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 본 발명에 따른 미생물의 푸마르산 환원효소 활성 측정

상기 실시예 3에서 선별된 SROD 균주를 배지에 접종하여 미생물 흡광도(O.D.₆₀₀)가 각각 1.84 및 1.54가 될 때까지 배양하였다. 그 다음 상기 배양된 균주를 초음파 처리기(Ultrasnic homogenizer 4710 seruesm cole-parmer instrument corp. chicago, USA)를 이용하여 15분, 25분 및 25분 동안 초음파 처리하여 세포벽을 파괴한 후 13,000rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 그 다음 상기 균주(1mg/ml), 5mM 푸마르산염 및 0.15mM NADH를 50mM 포타슘포스페이트 용액(Potassium phosphate buffer, pH 7.5)에 첨가하여 혼합한 후 흡광도 340nm로 NADH 산화능을 측정하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

미생물 균주	NADH 산화능(mM)
	15분	20분	25분
Enterococcus faecium(SROD)	17.64±2.61^a	37.05±5.48^a	8.82±1.31^b
값은 평균±표준편차, n=3, ^a,b,c 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, 초음파 처리 시간에 따라 푸마르산 환원효소가 분비되어 NADH를 산화시키는 효능을 측정한 결과, 20분 동안 초음파 처리한 상기 SROD 균주에서 37.05±5.48^amM의 NADH를 산화시키는 것을 확인하였다. 이는 상기 SROD 균주가 푸마르산 또는 숙신산을 환원시키는 효능을 가지는 것을 의미한다.

실시예 5 : in vitro 발효 시스템에서 실험 수행

5-1. 균주 준비

상기 실시예 2-1의 선택배지에 1% 가용성 탄수화물이 첨가된 삼각 플라스크에 상기 실시예 3에서 분리된 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD 균주 및 30mM 푸마르산을 접종하여 밀봉한 후, 기체 진공펌프 및 혐기 가스 시스템(anaerbic gassing system)을 이용하여 삼각 플라스크 내의 기체를 이산화탄소로 교환하였다. 그 다음 120rpm의 속도로 39℃의 온도에서 미생물 흡광도(O.D.₆₀₀)가 1.5가 될 때까지 교반배양하였다. 대조군으로 균주 또는 푸마르산염을 접종하지 않은 선택배지를 사용하였다.

5-2. 총 가스량 측정

혐기성 환경에서 채취한 반추위액에 완충액(K₂HPO₄ 0.45g/L, KH₂PO₄ 0.45g/L, (NH₄)₂SO₄ 0.9g/L, CaCl₂·H₂O 0.12g, MgSO₄·7H₂O 0.19g.L, trypticase peptone 1.0g/L, yeast extract 1.0g/L, cysteine·HCl 0.6g/L; pH 6.9)을 1:2의 비율로 혼합하였다. 그 후 상기 실시예 5-1의 배양된 균주에 상기 반추위액과 혼합된 완충액을 25ml씩 첨가한 후 120rpm의 속도로 39℃의 온도에서 혐기 배양한 후, 12시간 및 24시간 후 총 가스량을 측정하였다. 총 가스량은 압력 및 센서 기기(Press & Sensor machine)를 사용하여 측정하였다. 이때, 상기 총 가스량은 실험식 1을 이용하여 ml 단위로 변환시켰다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[실험식 1]

총 가스량(ml) = 0.023x + 0.055(R²=0.996)

x = 압력 및 센서기기로 측정된 PSI 단위를 가지는 총 가스량

배양시간(h)	대조군	푸마르산	SROD	SEM
12	26.00^b	42.67^a	33.00^b	1.93
24	48.67^b	78.33^a	49.33^b	6.04
SEM=표준오차, n=3, ^a,b 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, 배양시간이 증가함에 따라 총 가스량은 증가하였다. 구체적으로, 12시간 배양한 후 총 가스량은 푸마르산을 처리한 군에서 가장 높게 나타났으며, SROD 및 대조군 순으로 감소하였다. 또한, 24시간 배양한 후 총 가스량은 푸마르산을 처리한 군에서 가장 높게 나타났으며, SROD 및 대조군 순으로 감소하였다.

5-3. pH의 측정

상기 5-2에서 배양이 끝난 삼각 플라스크를 4℃의 온도를 유지하는 얼음 위에 두어 발효를 멈추게 한 후 측정하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.

배양시간(h)	대조군	푸마르산	SROD	SEM
12	5.54^b	5.87^a	5.47^c	0.02
24	5.32^c	5.83^a	5.30^c	0.04
SEM=표준오차, n=3, ^a,b,c 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험 결과, 배양시간이 12시간에서 24시간으로 갈수록 푸마르산을 첨가한 군을 제외하고 대조군 및 SROD균주를 첨가한 군의 경우 pH 값은 약간 감소하였다.

5-4. 휘발성 지방산(Volatile fatty acid, VFA) 함량 측정

상기 실시예 5-2의 방법을 사용하여 휘발성 지방산 함량을 측정하였다. 휘발산 지방산은 아세테이트(acetate), 부틸레이트(butylate) 및 프로피오네이트(protionate) 함량을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent technolgies 1200 series)를 사용하여 측정하였다. 용매로는 0.0085 노르말의 황산을 0.6㎕/min의 속도로 흘려주었으며, 컬럼(METACARB87H, Varian, Germany)의 온도는 35℃의 온도로 유지하였다. 시료는 사용전 13,000rpm의 속도로 4℃의 온도에서 10분 동안 원심분리 후 상층액을 취해 0.2㎛의 필터(Milipore)로 필터한 후 20㎕씩 주입하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.

	휘발성지방산 생성량(mM/L)
배양시간(h)	대조군	푸마르산	SROD	SEM
	아세트산
12	31.22^a	19.11^b	32.61^a	0.46
24	33.71^b	57.34^a	34.36^b	1.77
	부티르산
12	5.74^ab	5.44^b	6.23^a	0.18
24	7.22	7.49	7.70	0.38
	프로피온산
12	8.33^c	12.90^a	10.24^b	0.18
24	9.95^b	27.87^a	11.40^b	0.60
	아세트산/프로피온 산 비율
12	3.75^a	1.49^c	3.19^b	0.08
24	3.41^a	2.05^b	3.05^a	0.24
	총 휘발성지방산
12	45.28^b	37.44^c	49.07^a	0.55
24	50.87^b	92.71^a	53.46^b	1.81
SEM=표준오차, n=3, ^a,b,c 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, 배양시간이 길어질수록 총 휘발성지방산의 함량이 증가되었으며, 모든 군에서 아세테이트의 함량이 가장 높게 나타났다. 구체적으로, 푸마르산을 처리한 군의 총 휘발성지방산의 함량이 가장 많이 증가하였으며, 아세트산/프로피온산의 비율은 감소하였다. 그러나, SROD 균주를 처리한 군의 총 휘발성지방산의 함량은 대조군과 비교하여 총 휘발성지방산의 함량은 미약하지만 증가하는 것을 확인하였다.

5-5. 메탄 발생량 측정

상기 실시예 5-2의 방법을 사용하여 메탄 발생량을 측정하였다. 메탄은 가스 크로마토그래피(Agilent technolgies HP 5890)를 이용 분석하였다. 검출은 TCD, 컬럼 Carboxen 1006PLOT capillary column 30mX0.53mm(Supelco)를 이용하였으며 분석조건은 oven 온도 35℃, injection 부분은 온도 200℃, 사출구의 부분 detector 온도 200℃로 이동상 가스 N₂를 3ml/min 흘러주어 배양시간 24시간 후의 발생량을 분석하였다. 총 가스 발생량 속 메탄생성량을 기초로 하여 Qrskov와 McDonald(1979)의 공식에 의해 메탄 생성량을 추정하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

배양시간(h)	메탄 발생량(mM/ml)
배양시간(h)	대조군	푸마르산	SROD	SEM
24	24.12	15.56	3.98	2.41
SEM=표준오차, n=3, ^a,b,c 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험 결과, 배양 24시간 후에는 SROD 균주를 첨가한 군은 대조군보다 메탄 발생량이 감소하였으며, 특히 SROD 균주의 메탄 발생량이 가장 적음을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11098P

20100831

Claims

엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD(KCCM 11098P)을 포함하는 반추동물의 반추위 내 메탄 생성 억제용 미생물 제제.
제1항의 미생물제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산용 사료.
엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD(KCCM 11098P)을 반추 동물에게 급여하여 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 급여는 상기 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) SROD(KCCM 11098P)이 포함된 미생물 제제 또는 상기 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료를 반추 동물에게 제공하는 것을 특징으로 하는 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 방법.