HU200488B - Process for producing demannosyl teichoplanin derivatives - Google Patents

Process for producing demannosyl teichoplanin derivatives Download PDF

Info

Publication number
HU200488B
HU200488B HU883470A HU347088A HU200488B HU 200488 B HU200488 B HU 200488B HU 883470 A HU883470 A HU 883470A HU 347088 A HU347088 A HU 347088A HU 200488 B HU200488 B HU 200488B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
beta
deoxy
aminoglycopyranosyl
teicoplanin
mixture
Prior art date
Application number
HU883470A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT49379A (en
Inventor
Angelo Borghi
Piero Antonini
Giancarlo Lancini
Original Assignee
Lepetit Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lepetit Spa filed Critical Lepetit Spa
Publication of HUT49379A publication Critical patent/HUT49379A/hu
Publication of HU200488B publication Critical patent/HU200488B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/365—Nocardia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/51—Streptomyces candidus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű de-mannozil-teikoplanin antibiotikum származékok, ahol
R jelentése N-(Z-4-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil, N-(8-metil-nonanoil)-bétaD-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil, N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil, N-dekanoil- vagy N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
R2 jelentése hidrogénatom;
és ezek bármilyen arányú keverékének előállítására.
A találmány tárgya eljárás az említett antibiotikum származékoknak a megfelelő teikoplanin prekurzorokból való előállítására.
A teikoplanin az Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 törzs által emészthető szén és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó tenyészközegben termelt antibiotikum.
Az említett törzs által termelt főtermék három fő komponensnek (Ai, A2 és A3) a keveréke, melyet eredetileg teichomycinnek neveztek (4 239 751 számú USA szabadalmi leírás).
Az újabban előállított teikoplanin preparátumok, melyeket a fermentléből kinyert tennék tisztításával nyernek és alkalmasak Gram-pozitív mikroorganizmusok által okozott fertőzések kemoterápiás kezelésére [Η. H Williams et. al.: Journal of Hospital Infection, 7 (Supplement A) 101-103 (1986)], fő komponensként öt, szerkezetileg szoros kapcsolatban álló anyag komplexét tartalmazzák, amelyeket eredetileg együttesen teichomycin A2 faktornak neveztek. Az említett öt, közeli rokonságban lévő vegyületet egymás után izolálták és a komplex egy-egy komponenseként jellemezték, amely komplexet azután mind a szakirodalomban, mind a szabadalmi irodalomban „teikoplanin A2” vagy „teikoplanin komplex” néven említenek.
A teikoplanin komplex öt fő komponensét (konvencionális nevük: TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 és TA2-5) az (I) általános képlettel írhatjuk le, amelyben
R jelentése
TA2-l:N-(Z-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-2:N-(8-metil-nonanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-3:N-dekanoil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-4:N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-5:N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
R2 jelentése alfa-D-mannopiranozil csoport.
A komponensek aránya a teikoplanin komplexben változik, függően a fermentációs körülményektől és a fermentléhez adagolt prekurzoroktól (lásd a 204179 számú E.RA. publikációt).
Korábban leírták a teikoplanin aglikonját (L 17392), azaz a fenti (I) általános képletű vegyületből azt, amelyben R=Ri=R2, jelentésük hidrogénatom, valamint két pszeudo aglikont, nevezetesen az L 2
17054 jelű vegyületet [(I) általános képlet, R jelentése a hidrogénatom, Rt jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport, R2 jelentése alfa-D-mannopiranozil csoport], és az L 17046 jelű vegyületet [(I) általános képlet R=R2, jelentésük hidrogénatom, Rí jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport],
A teikoplanin említett származékait úgy állítjuk elő, hogy a teikoplanin komplexet vagy annak egyes fő komponenseit megfelelő körülmények között savasán hidrolizáljuk. Lásd például a 146053 sorszámú, a 119575 sorszámú és a 119574 sorszámú E.P.A. publikációkat.
Összefoglalva, gyengén savas körülményekkel eltávolítható az acilglükózamin egység, erősebben savas körülményekkel eltávolítható a mannóz egység is, és még erősebb savas kezeléssel eltávolítható a megmaradt N-acetil-glükózamin egység, így állítható elő az ágiikon.
De-mannozil teikoplanin származékokat, azaz olyan teikoplanin származékokat, amelyekben R és Rl jelentés ugyanaz mint az előzőkben bemutatott teikoplanin komplexben, és R2 jelentése hidrogénatom, még addig nem írtak le, és valószínűleg nem állíthatók elő savas kezeléssel. A teikoplanin lúgos kezelése az N-terminális végtől számított harmadik aminosav királis központjának epimerizációjához vezet, az aktivitás lényeges csökkenésével [lásd J.C.J. Barna et. al.: The Journal of Antibiotics 37, (10), 1204-1208 (1984)].
A jelen találmány szerint de-mannozilezett teikoplanin származékokat jó hatásfokkal állíthatunk elő a teikoplanin komplexből választott szubsztrátum, az egyes komponensek bármyilen arányú elegye, vagy bármely komponens mikrobiológiai transzformációjával, Nocardia orientalis NRRL 2450 vagy Streptomyces candidus NRRL 3218 tenyészeteivel, ezek természetes mutánsaival vagy variánsaival, amelyek ugyanezt a tulajdonságot mutatják, azaz, hogy képesek elhasítani a glikozidos kötést a teikoplanin molekulában az ágiikon és a D-mannóz között. A hasítás kivitelezhető mind a mosott micéliummal, mind az abból készült sejtmentes preparátummal.
A Nocardia orientalis törzs fiziológiai és morfológiai tulajdonságait a 3 076 099 sz. USA szabadalmi leírás, a Streptomyces candidus törzsét pedig a 3 387 786 sz. USA szabadalmi leírás ismerteti.
Az említett törzsek közül az elsőt az újabb cikkekben Streptomyces orientalis NRRL 2450 néven is említik [lásd. S.K. Chung et. al„ The Journal of Antibiotics, 39 (5), 652-659 (1986)].
Az említett törzsekből a mi belső kódjainkat viselő mintákat (A/156 és S/802) újból letétbe helyeztünk 1987. június 10-én az ATCC-nál (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA) a Budapesti Egyezmény (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms fór the Purposes of Patent Procedúra) által meghatározott körülmények között, mikor is az ATCC 53 630 és 53 629 sorszámot kapták.
Amikor a teikoplanin komplexet, vagy a komponensek keveréket használják, a mikrobiológiai transzformációban szubsztrátként, akkor a kapott öt, I általános képletű de-mannozil származék keveréke, bármilyen arányban. Ezen keverékek előállítása is
HU 200488 Β ennek a találmánynak az oltalmi körébe tartozik. Az említett keverékeket használhatjuk úgy, ahogy vannak, vagy igény szerint az öt külön komponensre szétválaszthatjuk ismert technikák alkalmazásával, például fordított fázisú megoszlással, ioncserélő kromatográfiával vagy preparatív HPLC-vel (lásd hivatkozásként a 4 542 018 sorszámú USA szabadalmi bejelentést).
A jelen találmány szerinti teikoplanin származékok antibiotikusan aktív vegyületek.
A . rövidség kedvéért mindegyik, jelen találmány szerinti, de-mannozil-teikoplanin vegyületet a továbbiakban a konvencionális nevén fogjuk említeni, amely utal arra a teikoplanin komplex fő-komponensre amelyből származik, eléje rakva a DM rövidítést. Ennek megfelelően
DM-TA2-1 jelöli az 1. komponens (TA2-1) de-mannozil származékát;
DM-TA2-2 jelöli a 2. komponens (TA2-2) de-mannozil származékát;
DM-TA2-3 jelöli a 3. komponens (TA2-3) de-mannozil származékát;
DM-TA2-4 jelöli a 4. komponens (TA2-4) de-mannozil származékát;
DM-TA2-5 jelöli az 5. komponens (TA2-5) de-mannozil származékát.
A találmány szerinti vegyületek antibakteriális ak5 ti vitását in vitro igazolhatjuk a standard hígítási tesztekkel különböző mikroorganizmus tenyészetekben.
A táptalajok és növesztést körülmények a MIC (minimális gáltó koncentráció) meghatározásához a következő voltak: Isosensitest táptalaj (Oxoid), 24 10 óra a staphylococcusokhoz, Strep. felcalis-hoz és Gram-negatív baktériumokhoz (Escherichia coli): Todd-Hewitt táptalaj (Difco), 24 óra más streptococcus fajokhoz; GC base táptalaj (Difco) + 1 % Isovitalex (BBL), 48 óra, CO2 gazdag atmoszféra Neisseria 15 gonorrhoae-hoz; Brain Heart táptalaj (Difco) + 1 % Supplement C (Difco), 48 óra Haemophilus influemae-hoz; Az oltóanyag ΙΟ4—105 telepképző egység/ml volt a táptalaj hígításos MIC-ekhez.
A fenti de-mannozil teikoplanin származékok minimális gátló koncentrációját (MIC, mikrogram/ml) néhány mikroorganizmusra az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat
Törzs Μ. I. C. (mikrogram/ml) DM-TA2-2 DM-TA2-3 DM-TA2-4 DM-TA2-5
Stapk. aureus L165 0,063 0,063 0,125 0,063
Staph. aureus (106 telepképző egység/ml) 0,125 0,125 0,25 0,125
Staph. aureus (30 % borjú szérum) 0,5 0,5 0,5 0,5
Staph. epidermidis L147 ATCC 12228 (Koaguláz negatív) 0,063 0,063 0,063 0,063
Strep. pyogenes L49 C203 0,063 0,063 0,063 0,063
Strep. pneumoniae L44 UC41 0,063 0,063 0,063 0,063
Strep. faecalis L149 ATCC 7080 0,063 0,063 0,063 0,063
Strep. mitis L796 (klinikai i2olatum) 0,063 0,063 0,125 0,063
Neisseria gonorrhoeae L997 ISM68/126 32 32 32 32
Haemophilus influenzáé L 970 type b ATCC 19418 64 64 64 32
Escherichia coli L47 SKF 12140 128 128 128 128
Proteus vulgáris L79 Y19H ATCC881 128 128 128 128
Pseudomonas aeruginosa L4 ATCC10145 128 128 128 128
Staph. haemolyticus L602 (klinikai izolátum) 0,5 0,5 0,5 0,25
Amint az a szakirodalomból ismert, akár gyógyászatilag elfogadható savakkal (vagy bázisokkal) vagy gyógyászatilag nem elfogadható savakkal (vagy bázisokkal) való sóképzés alkalmazható mint egy kényelmes tisztítási technika.
A jelen találmány szerinti de-mannozil-teikoplanin származékokat úgy állítjuk elő, hogy a teikoplanin komplexből választott szubsztrátot, az egyes komponensek bármely keverékét, vagy ezek közül egyetlen komponenst, amelyet az (I) általános képlettel lehet jellemezni, és amelyben
R jelentése:
TÁ2-l:N-(2-Z-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-2 N-(8-metil-nonanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-3: N-dekanoil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-gliikopiranozil csoport;
TA2^4: N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
TA2-5: N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rí jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozii-csoport;
R2 jelentése alfa-D-mannopiranozil csoport, mikrobiológiai transzformációnak vetjük alá a Nocardia orientalis NRRL 2450, Streptomyces candidus NRRL 3218 törzsek közül választott mikroorganizmussal, vagy ezek olyan természetes variánsával, vagy mutánsával, amely megtartotta a képességét arra, hogy a teikoplanin molekulában lévő, D-mannózhoz kapcsolódó glikozidos kötést elhasítsák, vagy a tenyészetekből származó mosott micéliummal vagy sejtmentes preparátummal.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kiválasztott kiindulási anyagot akár tiszta formában, akár nyers preparátumként, beleértve az Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 törzs fermentlevét is, érintkezésbe hozzuk a fenti törzsek közül az egyiknek növekvő tenyészetével fermentációs körülmények között.
HU 200488 Β
Az említett törzseket a szokásos süllyesztett levegőztetett körülmények között tenyésztjük, emészthető szén- és nitrogénforrást valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajban.
Általában az említett kiindulási anyagot a Nocardia orientalis NRRL 2450 vagy a Streptomyces candidus NRRL 3218 törzsek tenyészetéhez adjuk olyan időpontban, amely az oltás időpontja után 18 órától addig terjedhet, míg a tenyészet a maximális növekedést eléri, azonban a beoltás utáni 24-72. órában történő adagolás, legalábbis néhány esetben előnyös.
A reakcióidő, azaz a kiindulási anyag és a mikrobiális tenyészet érinkezésének időtartalma a végtermék kinyerése előtt, 48 és 140 óra között változhat, az alkalmazott speciális körülményektől függően. Azonban mivel a reakció lefutását jól ismert módszerekkel lehet követni, például a kiindulási anyag mennyiségének csökkenését követve, és/vagy a végtermék mennyiségének növekedését követve HPLCvel, ezért a gyakorlott kutató könnyen képes meghatározni hogy a reakció mikor tekinthető teljesen lefutottnak és a kinyerési eljárás elkezdhető.
A Nocardia orientalis NRRL 2450 vagy Streptomyces candidus NRRL 3218 növekedésben lévő tenyészetének használata helyett használhatjuk ezek bármely olyan mutánsának vagy variánsának tenyészetét, amely még képes az említett kiindulási anyagban lévő fenolos rész és a mannóz rész közötti glikozidos kötés elhasításával a találmány szerinti de-mannozilezett vegyületek előállítására. A jelen találmány szerinti bármely eljárás, amely ilyen mutánst vagy variánst alkalmaz, a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.
A jelen találmány szerinti vegyületeket úgy is előállíthatjuk a találmány szerinti eljárással, hogy az említett de-mannozilezésre képes tenyészetek micéliumát használjuk, izotóniás sóoldatban, célszerűen NaCl-ben mosva, hogy ne roncsoljuk a micélium említett vizes oldatát.
Mosás után a micéliumot kényelmesen felszuszpendáljuk egy fiziológiailag elfogadható közegben. A mosott micéliumos eljárást arra használhatjuk, hogy a reagáltatandó teikoplanin vegyületek menyiségét megnöveljük, az optimális átalakítási hatásfok megtartása mellett. Az is lehetséges, hogy az átalakítást sejtmentes preparátummal végezzük a sejteket például ultrahanggal feltárva.
Az antibiotikumok kinyerését a reakcióközegből ezután önmagában jól ismert technikákkal végezzük, idetartozik az oldószeres extrahálás, kicsapás folyadékokkal vagy a oldat pH-jának megváltoztatásával, megoszlási kromatográfia, fordított fázisú megoszlási kromatográfia, ioncserés kromatográfia, affinitás-kromatográfia és hasonlók.
Egy előnyös eljárásban immobilizált D-Alanil-D-alaninnal végzett affinitás-kromatográfia után különböző pH-η végezzük az elválasztást.
A jelen elválasztási eljárásban használható immobilizált D-alanil-D-alanint a 122 969 sorszámú E.P.A. bejelentésben írnak le. Ebben a kinyerési eljárásban az előnyös töltet a D-Alanin, ellenőrzött pórusméretű keresztkötéses polidextránhoz kapcsolva.
A reakció-elegyet közvetlenül szűrés után vagy egy előzetes tisztítási eljárás után affinitás-kromatográfiának vethetjük alá. Ez az utóbbi eljárás magában foglalja a teljes közeg lúgosítását, előnyösen pH 8,5 és pH 11 között, majd adott esetben egy szűrési segédanyag jelenlétében történő szűrést
Az éles szűrlet pH-ját ezután 7 és 8 közé állítjuk, majd immobilizált D-Álanil-D-Alaninon végzett affinitás-kromatográfiának vetjük alá, vagy oszlopban vagy bekeverve.
Míg az anyag pH 7-8 között kötődik az affinitás töltethez, a leoldást bázikusabb pH értéteknél végezzük (előnyösen pH 9,0 és 10,5 között) vizes lúg segítségével. Ez a vizes lúg lehet ammónia, illékony amin, alkáli- vagy alkáli-földfém-hidroxid, vagy egy bázikus puffereit oldat, igény szerint poláros szerves oldószer, úgymint egy vízzel elegyedő poláros oldószer jelenlétében.
A poláros, vízzel elegyedő oldószerekre jellemző példák: vízben oldódó alkoholok (úgymint metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, alacsony szénatomszámú alkanoátok (például etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán és dimetilformamid és ezek keveréke; az előnyös poláros, vízzel elegyedő oldószer ebben az esetben az acetonitril.
Miután a szennyeződéseket eltávolítjuk az oszlopot vizes, 4-9 közötti pufferrel mosva, amely tartalmazhat sókat (pl. ammónium-formiátot) karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket, a de-mannozil teikoplanin antibiotikumot az előzőkben említett eluáló keverékkel leoldjuk. Az eluátumot HPLC-vel analizáljuk és a kívánt anyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük.
Ennek az eluátumnak a pH-ját 7,0-7,5-re állítjuk szerves vagy ásványi savval.
Az eluátumot ezután betöményítjük és sómentesítjük.
Egy kényelmes sómentesítési eljárás során az antiobiotikum-tartalmú vizes oldatot szilanizált szilikagél oszlopra visszük, desztillált vízzel mossuk, majd egy fentiekben meghatározott poláros vízzel elegyedő oldószer és víz keverékével leoldjuk.
Egy másik módszer szerint a de-mannozilezett teikoplanin szánmazék(ok) vizes oldatát szimultán koncentráló/sómentesítő eljárásnak vetjük alá, olyan membránon keresztül ultraszűrve, amelynek a nominális móltömeghatára (NMWL) 1000 dalton vagy kevesebb.
A fenti eljárásból kapott oldatot liofilezzük és a kinyert anyagot további tisztításnak vetjük alá.
Néhány esetben, főleg nagymennyiségű preparátumoknál az említett tisztítást előnyös két lépésben végrehajtani. Az első lépésben a teikoplanin komplex egyes komponenseinek az elválasztására a 4 542 018 sorszámú USA szabadalomban leírt általános fordított fázisú kromatográfiás eljárást használjuk. Az említett eljárás egyik kivitelezési módjában a liofilezés során kapott de-mannozil teikoplanin származék(ok)at ammónium-formiát/acetonitril keverékében oldjuk, pHját nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk, és a kapott oldatot szilanizált szilikagél oszlopon bocsátjuk keresztül, majd az oszlopot ammónium-formiátban oldott acetonitril lineáris gradiensével eluáljuk. Az eluátumot HPLC-vel vizsgálva követjük és a kívánt anyago(ka)t tartalmazó frakciókat összesítjük, majd csökkentett nyomáson bepárolva kapjuk a kívánt szilárd anyagot. Ez az eljárás használható a teikoplanin komplex egyes de-mannozil származékainak elválasztására is,
HU 200488 Β ha ez utóbbit, vagy az egyes kompensek keverékét használjuk az egyes komponensek helyett.
Az első tisztítási lépést kihagyhatjuk, ha a mikrobiológiai traszformácíóhoz használt kiindulási anyag eléggé tiszta és a teikoplanin komplexnek lényegében egyetlen komponensét tartalmazza.
A második tisztítási lépésben egy fél-preparatív HPLC-t használunk egy szilanizált, kémiailag módosított preparatív HPLC oszloppal mozgófázisként két acetonitril/ammóniurn-formiát keveréket használva különböző arányban, és lineáris acetonitril gradienst fenntartva az ammónium-formiátban. Az eluált frakciókat HPLC-vel vizsgáljuk és a kívánt terméket tartalmazókat egyesítjük, a szerves oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a vizes oldatot szimultán töményítés/sómentesítésnek vetjük alá ultraszűréssel, a fentiek szerint Az ultraszűrésnél kapott oldatot liofilezve kapjuk a kívánt tiszta terméket.
A jelen találmány szerinti de-mannozil teikoplanin származékok hatásosak olyan Gram-pozitív baktériumokkal szemben, amelyek számos, széles körben elterjedt fertőzésért felelősek.
A jelen találmány szerinti vegyületek különösen nagy aktivitást mutatnak Staphylococcus epidermidis és Staphylococcus haemolyticus törzsekkel szemben.
Antibakteriális kezelés céljára a de-mannozil teikoplanin származékokat vagy azok keverékét általában különböző módokon lehet beadni, úgymint topikálisan vagy parenterálisan. Az adagolás előnyös útja általában a parenterális adagolás.
Az injekciós készítmények formája lehet szuszpenzió, oldat vagy emulzió olajos vagy vizes hordozóval, és adalékanyagokat tartalmazhatnak, például szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergáló ágenseket.
Egy másik változat szerint az aktív anyag lehet por formában, és beadáskor lehet folyadék fázisba vinni, ha megfelelő hordozót, például steril vizet adnak hozzá.
Az adagolás módjától függően ezeket a vegyületeket különböző dózis-formákban lehet formulázni.
Néhány esetben a találmány szerinti hatóanyagot bélben oldódó bevonattal rendelkező dózisformában szerelik ki szájon át való adagolás céljára, a szakterületen ismert módon [lásd pl. „Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15. kiadás 1614. oldal, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA].
Speciálisan ez lehet a helyzet, ha különösen kívánatos az antimikrobiális hatóanyag felszívódása a bélrendszerből, miközben változatlanul áthalad a gyomortraktuson.
A hatóanyag adagolt mennyisége számos tényezőtől függ, úgymint a kezelt alany méretétől és állapotától, az adagolás módjától és gyakoriságától, valamint a fertőző ágenstől.
A jelen találmány szerinti antibiotikus hatóanyagok általában körülbelül 0,5-500 mg hatóanyag/páciens testtömegkilogramm napi dózisban hatékonyak, igény szerint 1-4 adagra szétosztva naponta.
Különösen előnyösek azok a dózis-egységben meghatározott készítmények, amelyek körülbelül 50-200 mg-ot tartalmaznak egységenként.
Tartós hatású készítményeket különböző mechanizmusokra és módszerekre alapozva készíthetünk, a szakirodalomból ismert módon.
A de-mannozil antibiotikum hatóanyagot tartalmazó tartós hatású készítmények előállítására előnyös eljárás, ha az antiobiotikum vízben oldhatatlan formáját vizes vagy olajos közegben szuszpendáljuk
Gyógyászati aktivitásuk mellett a jelen találmány szerinti de-mannozil antibiotikumok használhatók állati növekedést elősegítő anyagként, azaz a hús és tejtermelő állatok táphasznosításának növelésére.
Erre a célre a találmány szerinti hatóanyagot megfelelő tápban szájon át adagoljuk. Az a megfelelő alkalmazott koncentráció, amely ahhoz szükséges, hogy a hatóanyagot növekedést elősegítő mennyiségben juttassák az állat szervezetébe, ha az normál mennyiségű táplálékot fogyaszt.
A találmány szerinti hatóanyagnak az állati táphoz való hozzáadását előnyösen úgy végezhetjük, hogy a hatóanyagot hatásos mennyiségben tartalmazó, megfelelő táp-premixet készítünk és a premixet a komplett adaghoz adjuk.
Másik módszer szerint a hatóanyagot tartalmazó átmeneti koncentrátumot vagy táp-kiegészítést keverhetünk bele a tápba.
A mód, ahogy ezek a táp-premixek és komplett adagok készülnek, és ahogyan adagolják őket, kézikönyvekben vannak leírva [úgymint .Applied Animál Nutrition”, W.H. Feedman and Co., S. Francisco, USA (1969), vagy „Livestock Feeds and Feeding” O and B books, Corvallis, Oregon, USA (1977)] és hivatkozási alapként idézzük ezeket.
A de-mannozil teikoplanin származékok készítésének részletes leírása
1. A de-mannozil teikoplanin komplex 2. komponensének (DM-TA2-2) előállítása.
Egy liofilezett Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset tartalmazó csövet kinyitunk és zabliszt agárból készült ferde agarra visszük. 7 napos, 28 ’C-os inkubálás után a tenyészetet desztilállt vízben szuszpendáljuk, majd 2 db olyan Erlenmeyer lombikba visszük át amelyek 100-100 ml, következő összetételű S/bis jelű vegetatív táptalajt tartalmaznak.
Élesztőkivonat 4 g
Pepton 4 g
Glükóz 10 g
MgSO4 0,5 g
KH2PO4 2 g
K2HPO4 4 g
Desztillált víz 1000 ml-re pH sterilezés után: 7
A beoltott táptalajt 48 órán át 28 ’C-on inkubáljuk egy körkörös rázógépen, 200/perc fordulatszámmal. A kapott tenyészetet 5 ml-es adagokra osztjuk, lefagyasztjuk és a további felhasználásig tároljuk.
A lefagyasztott tenyészetből 2,5 ml-rel oltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml S/bis vegetatív táptalajt A tenyészetet 48 órán át 28 ’C-on inkubáljuk 200/perc fordulatszámmal egy 5 cm-es kitérésű rázógépen.
Ennek a tenyészetnek 5 ml-ét használjuk 500 ml-es lombikban lévő 100 ml C jelű, a következő összetételű termelő táptalaj beoltására.
-5HU 200488 Β
Glükóz^ 2 g/1
Élesztőkivonat 5 g/1
Aszparagin 1,5 g/1
MgSO4 0,5 g/1
CaCO3 5 g/1
NaCl 0,1 g/1
CaCl2xH2O 0,1 g/1
Nyomelem oldat (b’ 1 ml/1 pH sterilezés után: 6,9 (a) a glükózt külön sterilezzük (b) a nyomelem oldat összetétele.
Bórsav 0,50 g/1
CuSO4x5H2O 0,04 g/1
KI 0,10 g/1
FeCl3x6H2O 0,20 g/1
MnSOxH2O 0,40 g/1
FeSO4x7H2O 0,40 g/1
Ammónium molibdát 0,20 g/1
A fenti eljárással harminc lombikot készítünk. 48 óra elteltével 20 mg TA2-2 szubsztrátot (azaz a teikoplanin koplex 2 komponensét) adunk mindegyik lombikhoz, és a fermentációt aerob körülmények között folytatjuk tovább az adagolástól számított 72 órán át. A fermentlé HPLC-s vizsgálatával kimutatható a TA2-2 40 %-nak DM-TA2-2-vé alakulása.
Mind a 30 lombikból származó egyesített reakcióelegy pH-ját 10,5-re állítjuk IN NaOH hozzáadásával, majd szűrési segédanyag hozzáadásával leszűrjük. A szűrt lé pH-ját 7,5-re állítjuk IN HCI hozzáadásával, majd ehhez 150 ml Sepharose-epszilon-aminokaproil-D-Alanil-D-Alanin affinitás gyantát (122 969 sorszámú EPA bejelentés) adunk.
Az elegyet éjszakán át 4 ’C-on kevertetjük. A gyantát ezután elválasztjuk a kimerített fermentlétől és kromatográfiás oszlopba töltjük. Az oszlopot öt gyanta-térfogatnyi Tris-HCl pufferrel (0,05 M, pH 7,5), majd ugyanilyen térfogatú Trisz-bázis oldattal (0,05 M) mossuk. A gyantát ezután 1 %-os ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 100 ml-es frakciókat szedve. A frakciókat hangyasavval semlegesítjük, majd HPLC-vel elemezzük. A HPLC vizsgálatot a következő körülmények között végezzük.
Berendezés: Hewlett Packard 1084B modell,
254 nm-es detektorral
Oszlop: Erbasil C-18, 5 mikrométer, 4,6 x 150 mm Mozgófázis:
A) CH3CN:NaH2PO4 (0.02M), 5:95;
B) CH3CN:NaH2PO4 (0,02M), 75:25;
A gradiens profil a következő perc 0 40 45 48 50 %B 8 40 55 8 stop
Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc
Injektálás: kb. 20 mikroliter a vizsgált anyagot tartalmazó oldatból, kb. 1 mg/ml vízben, vagy H2O:CH3CN-ben (1:1)
A fenti körülmények között a TA2-2 retenciós ideje (RT) 24,71 perc, míg a DM-TA2-2 RT-je 26,30 perc.
A DM-TA2-2 tartalmú frakciókat egyesítjük (kb. 200 ml), majd ultraszűréssel töményítjük 90 mm-es 6
Hi-Flux U-F Cell Millipore berendezést használva, ebben egy PCAC Pellicon ultraszűrő membránnal, amelynek a névleges molekulatömeg határa (NMWL) 1000 dalton. Az oldat térfogatát kb. 20 ml-re csökkentjük, majd a maradékot liofilezve 268 mg nyers DM-TA2-2-t kapunk.
A nyersterméket tovább tisztítjuk fél-preparatív HPLC-vel a következő körülmények között: Berendezés: Waters folyadék-kromatográf, kétszivattyús 6000 A modellel ellátva, egy 254 nm-re állított 440-es modellszámú abszorbciós UV detektor, és egy 660-as oldat-programozó modell.
Oszlop: HIBAR LiChrosorb RP-18, 7 mikrométer 250 x 10 mm (Merck);
Mozgófázis:
A) vizes (2 g/1) HCOONH4/CH3CN (9:1)
B) vizes (2 g/1) HCOO NH4/CH3CN (3:7); Gradiens: lineáris 5 % B-től 45 % B-ig 45 perc alatt
Áramlási sebesség: 6 ml/perc
Injektálás·. 10 mg tennék oldva 2 ml A-ban minden egyes alkalommal.
Az eluátumnak azokat a részeit, amelyek a kromatográfiás profil alapján DM-TA2-2-t tartalmaznak, összegyűjtjük.
Az ismertetett fél-preparatív tisztítási eljárást alkalmazzuk az ultraszűrés után kapott összes nyerstermékre, az eluátumokat egyesítjük (összesen 180 ml) és a szerves oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A visszamaradó vizes oldatot (DM-TA2-2 oldat) ultraszűréssel 5 ml-re töményítjük az előzőkkel egyező körülmények között, és a visszamaradó oldatot liofilezve 85 mg tiszta, I általános képletű DM-TA22-t kapunk; ahol
R = N-(8-metil-nonanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rl = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil;
R2 = hidrogén.
A tiszta DM-TA2-2 ’H-NMR spektrumát Bruker AM-250 modellel rögzítjük, amely tömb-processzort tartalmaz, 250 MHz-es mágnessel és egy komputerizált Aspect 3000 konzollal működik. A protonokra jellemező spektrumokat DMSO-dő oldatban vesszük fel 250 ’C-on, TMS-t használva referenciaként
A teikoplanin komplexhez hasonlítva a DM-TA2-2 legjellemzőbb jeleit a Π. táblázatban közöljük.
A DM-TA2-2 gyors-atom bombázásos (FAB) tömegspektrumát FAB forrással ellátott VG 70-70 EQ berendezéssel rögzítjük. A pozitív ionsepktrumot néhány mikroliter tioglicerinben diszpergált mintából kapjuk, amelyet 7 KeV energiájú Ar atomokkal bombázzuk. Ez a kísérlet 1715-ös molekulatömeget mutat, amely egyezik a hozzárendelt szerkezettel.
Egy kísérletben, mikor is azonos körülmények között a Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset Streptomyces candidus NRRL 3218 törzzsel helyettesítjük, hasonló eredményeket kapunk.
Hasonlóképpen járunk el, azonban szubsztrátként TA2-2 helyett 200 mg teikoplamin komplexet használunk. A fermentlevelet a fentiekben ismertetett módon kezeljük és tisztítjuk. A fermentlé konverziós foka 21 %.
A HPLC vizsgálatot szintén a fenti módon végezzük, a kapott eredmények az alábbiak.
HU 200488 Β
Komplex (teiko-planin faktorok) gg/ml kiindulási érték RT (perc) Demannozil- származékok gg/ml végső érték RT (perc)
TA2-1 H,3 . 22,58 DM-TA2-1 2,26 24,17
TA2-2 112,1 24,71 DM-TA2-2 26,3 26,30
TA2-3 39,9 25,60 DM-TA2-3 5,2 27,20
TA2-4 20,0 28,66 DM-TA2-4 2,0 30,19
TA2-5 16,7 29,35 DM-TA2-5 1,7 30,92
Az egyes demannozil 1 faktorokat a 193 538 sz. A fenti módon eljárva, azonban Streptomyces can-
magyar szabadalmi leírásban szereplő módon választ- didus NRRL 3218 törzset alkalmazva a termék HPLC
juk szét; az egyes faktorokat alacsony kitermeléssel vizsgálatának eredményei az alábbiak.
kapjuk.
Komplex pg/ml RT Demannozil- pg/ml RT
(teiko-planin kiindulási (perc) származékok végső (perc)
faktorok) érték érték
TA2-1 10,7 27,58 DM-TA2-1 2,3 24,17
TA2-2 110,9 24,71 DM-TA2-2 20,8 26,30
TA2-3 35,2 25,60 DM-TA2-3 6,9 27,20
TA2-4 23,6 28,66 DM-TA2-4 2,8 30,19
TA2-5 19,7 29,35 DM-TA2-5 1,5 30,92
2. A de-mannozil-teikoplanin komplex 3. komponensének (DM-TA2-3) előállítása
Az 1. példában, leírt körülmények között dolgozva Nocardia orientalis NRRL 2450 törzzsel, de a beoltás után 48 órával TA2-2 helyett 200 mg TA2-3-at adagolva olyan fermentlevet kapunk, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozunk fel. A kinyerést és tisztítást az 1. példában leírttal azonos módon végezzük. A fermentlében az átalakítás hatásfoka 32 százalék. Az előzővel azonos körülmények között végzett HPLC analízis a TA2-3-ra 25,60 perc RT értéket mutat, és 27,20 percet a DM-TA2-3-re. A kitermelés 28 mg tiszta DM-TA2-3, azaz olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben:
R = N-dekanoil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rl = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
R2 = hidrogénatom.
A tiszta DM-TA2-3-nak az 1. példában leírtakkal azonos körülmények között rögzített NMR spektrumának jellegzetes csúcsait a Π táblázatban mutatjuk be.
Az 1. pontban leírtakkal azonos körülmények között rögzített FAB tömegspektrum 1715-ös molekulatömeget mutat, ami egyezik a hozzárendelt szerkezettel.
Egy analóg kísérletben, amelyben a Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset Streptomyces candidus NRRL 3218 törzzsel helyettesítettük, hasonló eredményeket kaptunk.
3. A de-mennozil teikoplanin komplex 4. komponensének (DM-TA2-4) előállítása.
Az 1. példában leírt körülmények között dolgozva Nocardia orientalis NRRL 2450 törzzsel, de a beoltás után 72 órával TA2-2 helyett 200 mg TA2-4-et adagolva olyan fermentlevet kapunk, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozunk fel. A fermentlében az átalakítás hatásfoka 34 %. A kinyerést és tisztítást az 1. példában leírttal azonos módon végezzük. Az előzővel azonos körülmények között végzett HPLC analízis a TA2-4-re 28,66 perc RT értéket mutat és 30,19 percet a DM-TA2-4-re. A kitermelés 24 mg tiszta DM-TA2-4, azaz olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben:
R = N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezQxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rl = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
R2 = hidrogénatom.
A tiszta DM-TA2-4-nek az 1. példában leírtakkal azonos körülmények között rögzített NMR spektrumának jellegzetes csúcsait a Π. táblázatban mutatjuk be.
A FAB tömegspektiumot olyan Kratos MS-9 berendezéssel rögzítjük, amely MS 50TC konzollal és FAB forrással van ellátva. A pozitív ion spektrumot néhány mikroliter alfa-tioglicerin-diglicerin 1:1 arányú elegyében diszpergált olyan mintából nyerjük, melyet 9 KeV energiájú Xe atomnyalábbal bombázunk.
A kísérlet 1891-es molekulatömeget mutat, ami egyezik a hozzárendelt szerkezettel.
Egy analóg kísérletben, amelyben a Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset Streptomyces candidus NRRL 3218 törzzsel helyettesítjük, hasonló eredményeket kapunk.
4. A de-mannozil teikoplanin komplex 5. komponensének (DM-TA2-5) előállítása
Az 1. példában leírt körülmények között dolgozva Nocardia orientalis NRRL 2450 törzzsel, de a beoltás után 48 órával TA2-2 helyett 200 mg TA2-5-öt adagolva olyan fermentlevet kapunk, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozunk fel. A fermentlében az átalakítás hatásfoka 36 százalék. A kinyerést és tisztítást az 1. példában leírttal azonos módon végezzük. Az előzővel azonos körülmények között végzett HPLC analízis a TA2-5-re 29,35 perces RT értéket mutat és 30,92 percet a DM-TA2-5-re. A
HU 200488 Β kitermelés 30 mg tiszta DM-TA2-5, azaz olyan (I) általános képletű vegyület amelyben:
R = N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rí = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
R2 = hidrogénatom.
A tiszta DM-TA2-5-nek az 1. példában leírttal azonos körülmények között rögzített NMR spektrumának jellegzetes csúcsait a Π. táblázatban mutatjuk be.
A 3. pontban leírttal azonos körülmények között rögzített FAB tömegspektrum 1891-es molekulatömeget mutat, ami egyezik a hozzá rendelt szerkezettel.
Egy analóg kísérletben, amelyben a Norcadia orientalis NRRL 2450 törzset Streptomyces candidus NRRL törzzsel helyettesítjük, hasonló eredményeket kapunk.
5. A de-mannozil teikoplanin komplex 1. komponensének (DM-TA2-1) előállítása
Az 1. példában leírt körülmények között dolgozva Nocardia orientalis NRRL 2450 törzzsel, de a beoltás után 24 órával TA2-2 helyett 400 mg TA2-l-et adagolva olyan fermentlevet kapunk, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozunk fel. A fermentlében az átalakítás hatásfoka 28 százalék. A kinyerést és tisztítást az 1. példában leírttal azonos módon végezzük. Az előzővel azonös körülmények között végzett HPLC analízis a TA2-l-re 22,58 perces RT értéket mutat és 23,98 percet a DM-TA2-l-re. A kitermelés 55 mg tiszta DM-TA2-1, azaz olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben:
R = N-(Z-4-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
Rí = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport;
R2 = hidrogénatom.
A 3. példában leírttal azonos körülmények között rögzített FAB tömegspektrum 1713-as molekulatömeget mutat, ami egyezik a hozzárendelt szerkezettel.
6. A de-mannozil teikoplanin komplex 2. komponensének (DM-TA2-2) előállítása
Egy liofilezett Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset tartalmazó csövet kinyitunk, és aszeptikusán átoltjuk egy zabliszt agar ferdére. 7 napig 28 °C-on inkubáljuk, majd a kinőtt tenyészetet desztillált vízben szuszpendáljuk és 2 db, 100-100 ml következő összetételű, S/bis jelű vegetatív táptalajra oltjuk:
Élesztőkivonat 4 g
Pepton 4 g
Glükóz 10 g
MgSCU 0,5 g
KH2PO4 2 g
K2HPO4 4 g
Desztillált víz 1000 ml-re pH sterilezés után: 7
A beoltott táptalajt 48 órán át 28 °C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámú körkörös rázógépen. A kapott tenyészetet 5-5 ml-es részekre osztjuk, lefagyasztjuk és további felhasználásig tároljuk.
A lefagyasztott tenyészetből 2,5 ml-rel oltunk 100 ml S/bis vegetatív táptalajt tartalmazó 500 ml-es Er8 lenmeyer lombikot. A tenyészetet 48 órán át 28 ’C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámmal, 5 cm-es kitéréssel.
Az így kapott tenyészet 5 ml-ével oltunk 100 ml C jelű termelő táptalajt (500 ml-es lombikban), összetétele a következő:
glükóz® 2 g/1 élesztőkivonat 5 g/1 aszparagin 1,5 g/1
MgSÖ4 0,5 g/1
CaCO3 5 g/1
NaCl 0,1 g/1
CaCl2xH2O 0,1 g/1 nyomelem oldat® 1 ml/1 pH sterilezés után: 6,9 (a) a glükózt külön sterilezzük (b) a nyomelem oldat összetétele:
bórsav 0,50 g/1
CuSO4x5H2O 0,04 g/1
KI 0,10 g/1
FeCl3x6H2O 0,20 g/1
MnSO4xH2O 0,40 g/1
FeSC>4x7H2O 0,40 g/1 ammónium-molibdát 0,20 g/1.
A fenti eljárással harminc lombikot készítünk.
óra elteltével a micéliumot centrifugálással kinyerjük, kétszer mossuk izotóniás sóoldattal (vizes NaCl 1:1000 tömegarány), majd újra szuszpendáljuk 3 1 fiziológiás oldatban (ugyanilyen térfogatú termelő táptalaj) és 200 mg TA2-2 szubsztrátot (azaz a teikoplanin komplex 2. komponensét) adunk mindegyik lombikhoz és a fermentációt a hozzáadás időpontjától számított 96 órán át aerob módon folytatjuk. A fermentlé HPLC vizsgálata azt mutatja, hogy a TA2-2 35 százaléka DM-TA2-2-vé alakul.
A 30 lombikban lévő összes reakcióközeg pH-ját
10,5-re állítjuk 1 N NaOH hozzáadásával, majd szűrési segédanyaggal leszűrjük. A szűrlet pH-ját IN HC1 hozzáadásával 7,5-re állítjuk, majd 500 ml Sep/tarose-epsí/on-aminocaproil-D-Alanyl-D-Alanine affinitás-gyantát (122 969 sorszámú EPA bejelentés) adunk hozzá.
A keveréket éjszakán át 4 ’C-on kevertetjük. A gyantát ezután elválasztjuk a kimerített fermentlétől, majd kromatográfiás oszlopba töltjük. Az oszlopot öt gyanta térfogatnyi Tris-HCl pufferrel (0,05 M, pH 7,5), majd ugyanilyen mennyiségű Tris bázis oldattal (0,05 M) mossuk. A gyantát ezután 1 %-os ammónium hidroxid oldattal eluáljuk és 100 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat hangyasavval semlegesítjük, majd az 1. pontban meghatározott körülmények között HPLC-vel analizáljuk.
A fenti körülmények között a TA2-2 retenciós ideje (RT) 24,71 perc, míg a DM-TA2-2 RT-je 26,30 perc.
A DM-TA2-2 tartalmú frakciókat egyesítjük, majd ultraszűréssel betöményitjük 90 mm-es Hi-Flux U-F Cell Millipore-t használva, amelyben 1000 dalton névleges molekulatömeg-határú PCAC Pellicon ultraszűrő membrán van.
Az oldat térfogatát lecsökkentjük, és a maradékot liofilezve 2965 mg nyers DM-TA2-2-t kapunk.
HU 200488 Β
A nyersterméket tovább tisztítva az 1. pontban leírt 2450 törzset a Streptomyces candidus NRRL 3218 feltételek között, 880 mg tiszta DM-TA2-t kapunk. törzzsel helyettesítjük, hasonló eredményeket kapunk.
Egy, a fenti körülmények között végrehajtott kísérletben, amelyben a Nocardia orientalis NRRL
Π. táblázat
Proton’** Multiplicitás* Teikoplanin DM-TA2-2 DM-TA2-3 (6ppm) DM-TA2-4 (δρρπι) DM-TA2-5 (δρριη)
KUllipiC/Λ (δρριη) (5ppm)
Különböző CH3 csoportok d 0,84 0,83 0,84 0,84 0,84
Különböző CH2 csoportok m 1,05-1,28 1,05-1,20 1,05-1,28 1,05-1,28 1,05-1,20
CH2 béta C=O és izopropil CH m 1,43 1,41 1,41 1,40 1,42
Glükózamin acetil csoportja s 1,88 1,83 1,86 1,86 1,86
CH2 alfa csoportok C = O-hoz m 2,03 2,00 2,02 2,01 2,00
C2-H-acetil glükózamin C2-H m 3,33 n.d. n.d. 3,31 3,35
mannóz CH2 m 3,48 nincs nincs nincs nincs
acil glükózaminok C2-H m 3,71 n.d. n.d. 3,62 3,70
xó dd 4,10 4,12 4,12 4,13 4,12
x5, x7, és az acetil-csoport anomer hidrogénje d 4,3-4,5 4,3-4,5 4,2-4,5 4,2-4,5 4,2-4,45
x2 m 4,99 4,97 4,96 4,93 4,93
4f s 5,11 5,13 5,11 5,11 5,10
xl** s 4,73 4,56 4,59 4,65 4,66
anomer hidrogénje s 5,22 nincs nincs nincs nincs
zó s 5,27 5,25-5,4 5,2-5,4 5,2-5,4 54-5,4
x3 d 5,34 5,25-5,4 5,2-5,4 5,2-5,4 5,2-5,4
acetil glükózaminok anomer d 5,40 5,25-5,4 5,2-5,4 5,2-5,4 5,2-5,4
4b hidrogénje s 5,56 5,53 5,53 5,51 5,51
x4 d 5,64 5,65 5,68 5,69 5,68
w6 d 6,22 6,09 6,08 6,09 6,09
3b, 3d, 3f s 6,3-6,5 6,25-6,5 6,2-6,4 6,25-6,4 6,25-6,4
7f s 6,50 6,28 6,29 6,29 649
7d s 6,71 6,39 6,35 6,38 6,38
lb s 6,74 6,62 6,65 6,62 6,60
5b s 7,09 7,26 7,18 7,18 7,17
6b s 7,78 7,84 7,83 7,83 7,83
n.d. = nincs meghatározva * = d = dublett; m = multiplett; s = szinglett; dd = dublettek dublettje ** = a pH erősen befolyásolja *** = az atomok és gyűrűk számozása megfelel a (H) általános szerkezeti képletnek
HU 200488 Β
A táblázatban közölt fontos jeleket összehasonlítva a teikoplanin komplex jeleivel, tisztán megállapíthatjuk, hogy a DM-TA2-2, DM-TA2-3, DM-TA2-4 és DM-TA2-5 vegyületek szerkezete megfelel a teikoplanin komplex mannozil egységek nélküli fő komponenseinek.
Ennek a következtetésnek a kulcspontjait a következőképpen olvashatjuk le a táblázatról. A teikoplanin koplex jellegzetes csúcsai 3,48-nál és 5,22-nél hiányoznak a de-mannozil vegyűletekból. A teikoplanin-komplexből a de-mannozil vegyületekbe is átkerülő W6, 7F, 7d és 5b jelek változása mutatja a
7. gyűrű helyettesítésében bekövetkezett változást. Az összes többi jel gyakorlatilag azonos mind a teikoplanin komplexben, mind a de-mannozil vegyületekben.

Claims (7)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (I) általános képletú de-mannozil-teikoplanin származékok előállítására - a képletben
    R jelentése N-(Z-4-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport; N-(8-metil-nonanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport, N-dekanoil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport, N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport vagy N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport és
    R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy a teikoplanin komplexet, az egyes komponensek bármely keverékét vagy valamelyik komponenst mint szubsztrátot a Nocardia orientalis NRRL 2450 (ATCC 53630) vagy Streptomyces candidus NRRL 3218 (ATCC 53629) törzzsel vagy ezek valamely olyan természetes variánsával vagy mutánsával, amely képes a teikoplanin molekulában lévő D-mannóznál lévő glikozidos kötés hasítására, mikrobiológiai transzformációnak vetjük alá oly módon, hogy a fenti törzs asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajban süllyesztett levegőztetett körülmények között növesztett tenyészetével, illetve a mosott micéliummal vagy ennek sejtmentes preparátumával érintkezésbe hozzuk a szubsztrátot, majd az említett hatóanyagot vagy a hatóanyagok keverékét kinyerjük, és abban az esetben, ha a hatóanyagok keverékét kapjuk, azt kívánt esetben egyes komponenseire szétválasztjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy de-mannozilező szerként a mikroorganizmus tenyészet izotóniás sóoldattal mosott micéliumát használjuk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletú vegyület előállítására, amelynek a képletében
    R jelentése N-(Z-4-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport és
    R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként teikoplanin komplexet, az egyes komponensek keverékét vagy az R helyén N-(Z-4-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoportot tartalmazó komponenst alkalmazunk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletú vegyület előállítására, amelynek a képletében
    R jelentése N-(8-metil-nonanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként teikoplanin komplexet, az egyes komponensek keverékét vagy az R helyén N-(8-metil-nonaoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoportot tartalmazó komponenst alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletú vegyület előállítására, amelynek a képletében
    R jelentése N-dekanoil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként teikoplanin komplexet, az egyes komponensek keverékét vagy az R helyén N-dekanoil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoportot tartalmazó komponenst alkalmazunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletú vegyület előállítására, amelynek a képletében
    R jelentése N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopirazonil-csoport;
    Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként teikoplanin komplexet, az egyes komponensek keverékét vagy az R helyén N-(8-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoportot tartalmazó komponenst alkalmazunk.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletú vegyület előállítására, amelynek a képletében
    R jelentése N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    Rl jelentése N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoport;
    R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként teikoplanin komplexet, az egyes komponensek keverékét vagy az R helyén N-(9-metil- dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil-csoportot tartalmazó komponenst alkalmazunk.
HU883470A 1987-07-03 1988-07-01 Process for producing demannosyl teichoplanin derivatives HU200488B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878715735A GB8715735D0 (en) 1987-07-03 1987-07-03 De-mannosyl teicoplanin derivatives

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT49379A HUT49379A (en) 1989-09-28
HU200488B true HU200488B (en) 1990-06-28

Family

ID=10620077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU883470A HU200488B (en) 1987-07-03 1988-07-01 Process for producing demannosyl teichoplanin derivatives

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5064811A (hu)
EP (1) EP0301247B1 (hu)
JP (1) JPH0819155B2 (hu)
KR (1) KR890002214A (hu)
AT (1) ATE90731T1 (hu)
CA (1) CA1334655C (hu)
DE (1) DE3881775T2 (hu)
DK (1) DK357488A (hu)
ES (1) ES2055719T3 (hu)
GB (1) GB8715735D0 (hu)
HU (1) HU200488B (hu)
IL (1) IL86895A (hu)
ZA (1) ZA884577B (hu)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5135857A (en) * 1987-07-03 1992-08-04 Gruppo Lepetit S.P.A. Process for the preparation of de-mannosyl teicoplanin derivatives
DE68925951T2 (de) * 1988-12-27 1996-07-25 Lepetit Spa Chemisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums L 17392 (Deglukoteicoplanin) und dessen Salze
US5500410A (en) * 1989-03-29 1996-03-19 Gruppo Lepetit S.P.A. Substituted alkylamide derivatives of teicoplanin
US5185320A (en) * 1989-04-03 1993-02-09 Gruppo Lepetit S.P.A. O56 -alkyl derivatives of aglycone and pseudo aglycones of teicoplanin
ES2106738T3 (es) 1990-03-28 1997-11-16 Lepetit Spa Procedimiento de preparacion de derivados de manosil-teicoplanina y de aglicona de manosil-teicoplanina.
HUT63860A (en) * 1990-12-05 1993-10-28 Lepetit Spa Process for producing 39-decarboxy-38-(hydroxymethyl) derivatives of teikoplanin antibiotics
US5606036A (en) * 1991-03-27 1997-02-25 Gruppo Lepetit Spa Antibiotic A 40926 ester derivatives
AU701463B2 (en) * 1995-07-05 1999-01-28 Sanofi Aventis S.P.A. Purification of dalbaheptide antibiotics by isoelectric focusing
US5638609A (en) * 1995-11-13 1997-06-17 Manufacturing And Technology Conversion International, Inc. Process and apparatus for drying and heating
CA2250578C (en) 1996-04-23 2003-06-24 Versicor Inc. Improved chemical process for preparing amide derivatives of antibiotic a 40926
US7119061B2 (en) * 2002-11-18 2006-10-10 Vicuron Pharmaceuticals, Inc. Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections
US20060074014A1 (en) * 2002-11-18 2006-04-06 Vicuron Pharmaceuticals Inc. Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections
US20050090433A1 (en) * 2002-11-18 2005-04-28 Vicuron Pharmaceuticals, Inc Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections
WO2013061814A1 (ja) 2011-10-25 2013-05-02 株式会社パイロットコーポレーション 可逆熱変色性組成物
CN106459637B (zh) 2014-04-24 2019-10-01 株式会社百乐 可逆热变色性印章用墨液组合物及印章
CN107175968A (zh) * 2017-07-12 2017-09-19 重庆工业职业技术学院 一种大学生思想政治教育智能教学系统
PL3702419T3 (pl) 2017-10-23 2024-03-11 Kabushiki Kaisha Pilot Corporation (Also Trading As Pilot Corporation) Odwracalnie termochromowa wodna kompozycja i przybór do pisania ją wykorzystujący

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1496386A (en) * 1975-03-05 1977-12-30 Lepetit Spa Antibiotics
JPS5830037A (ja) * 1981-08-18 1983-02-22 Toshiba Corp 陰極線管の製造装置
FI73697C (fi) * 1982-06-08 1987-11-09 Lepetit Spa Foerfarande foer framstaellning av individuella faktorer 1, 2, 3, 4 och 5 av teikomysin a2.
GB8307847D0 (en) * 1983-03-22 1983-04-27 Lepetit Spa Antibiotics l 17054 and l 17046
AU579120B2 (en) * 1983-12-16 1988-11-17 Gruppo Lepetit S.P.A. Chemical process for preparing antibiotic L 17392 (deglucoteicoplanin) and its salts
GB8512795D0 (en) * 1985-05-21 1985-06-26 Lepetit Spa Increasing ratio of components of teicoplanin a2 complex
US4694069A (en) * 1985-09-30 1987-09-15 Smithkline Beckman Corporation Kibdelosporangium aridum SK&F-AAD-609

Also Published As

Publication number Publication date
HUT49379A (en) 1989-09-28
EP0301247A3 (en) 1990-07-11
KR890002214A (ko) 1989-04-10
IL86895A0 (en) 1988-11-30
ZA884577B (en) 1989-04-26
IL86895A (en) 1993-04-04
JPH0819155B2 (ja) 1996-02-28
EP0301247A2 (en) 1989-02-01
DE3881775T2 (de) 1994-01-05
ATE90731T1 (de) 1993-07-15
DK357488A (da) 1989-01-04
ES2055719T3 (es) 1994-09-01
US5064811A (en) 1991-11-12
JPS6429398A (en) 1989-01-31
CA1334655C (en) 1995-03-07
GB8715735D0 (en) 1987-08-12
EP0301247B1 (en) 1993-06-16
DE3881775D1 (de) 1993-07-22
DK357488D0 (da) 1988-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4322343A (en) Pseudo-aglycone of actaplanin
US4547488A (en) Antibiotic M43D, pharmaceutical compositions and method of use
HU200488B (en) Process for producing demannosyl teichoplanin derivatives
CS228909B2 (en) Method of preparing antibioticum a-4696 in complex form, or in the form of factor b1,b2,b3,c1a,c3 and e1
JP2554350B2 (ja) グリコペプチド抗生物質
HU201099B (en) Process for producing a 40926 antibiotic mannosylaglycon and pharmaceutical compositions comprising same
US4918054A (en) Antibiotics called `chloropolysporins B and C`, a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use
US5187082A (en) Process for producing A83850 antibiotics
US5085990A (en) Teicoplanin-like derivatives
EP0287110B1 (en) Glycopeptide antibiotics pa-45052
US4548925A (en) Antibiotic M43A, pharmaceutical composition and method of use
US4548924A (en) Antibiotics M43B and M43C, pharmaceutical composition and method of use
CA2038667C (en) Process for the preparation of mannosyl teicoplanin derivatives and mannosyl teicoplanin aglycone
US4341768A (en) Antibiotic compounds
US4558008A (en) Process for production of A-51568B antibiotic
US5135857A (en) Process for the preparation of de-mannosyl teicoplanin derivatives
US4246400A (en) Tallysomycin compounds
JPH07114704B2 (ja) 抗生物質ａ４２８６７およびその付加塩
US4717714A (en) A-51568B antibiotic
US4360593A (en) Process of producing a peptide antibiotic with Bacillus circulans
US4950605A (en) FR-900493 substance, a process for its production and a pharmaceutical composition containing the same
US4314028A (en) Fermentation process for producing tallysomycin compounds
JPH0430400B2 (hu)
JPH01242598A (ja) 抗生物質ａ４２８６７誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee