PT85408B

PT85408B - Processo para a preparacao do antibiotico a 42867 e dos seus sais de adicao de acidos

Info

Publication number: PT85408B
Application number: PT85408A
Authority: PT
Inventors: Enrico Selva; Giovanni Cassani; Ernest Riva; Maurizio Denaro; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1986-07-29
Filing date: 1987-07-27
Publication date: 1990-04-30
Also published as: ES2046184T3; EP0254999A2; FI872860A; JPS6341490A; IL83225A0; NO872811L; AT388566B; HUT46361A; AU7445187A; ZA874164B; AU602700B2; IL83225A; US4804534A; CN87105285A; EP0254999B1; GB8618445D0; DK392087D0; GR3006514T3; FI87469B; JPH07114704B2

Description

Um novo antibiótico, A 42867, é preparado por cultura da estirpe Nocardia sp. ATCC 55492, ou de um seu variante ou mutante produtor do antibiótico A 42867, sob condições aeróbicas submersas na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos. 0 antibiótico e os seus sais de adição são úteis no tratamento de doenças infecciosas e como agentes promotores do crescimento.

GRUPO LEPETIT S.p.A.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DO ANTIBIÓTICO A 42867 E DOS SEUS SAIS DE ADIÇÃO DE ÁCIDOS” presente invento é dirigido a uma nova substância antibiótica denominada antibiótico A 42867, seus sais de adição, as suas composições farmacêuticas e o seu uso como medicamentos, particularmente no tratamento de doenças infecciosas envolvendo microorganismos susceptíveis a eles.

Os compostos do invento são também activos como agentes promotores do crescimento em animais tais como criação, suinos, ruminantes, etc.

Outro objecto do invento é um processo para a preparação do antibiótico A 42867 o qual inclui a cultura da nova variedade Nocardia sp. ATOO 53492 ou uma sua variante ou mutação produtora do antibiótico A 42867.

Nocardia sp ATCC 53492 foi isolada a partir de uma amostra de solo e foi depositada em 23 de Maio de 1986 com a American Type Culture Collection (ATOO), 12301 Parklawn Drive, ROCKVILLE, 20852 Maryland, U.S.A. sob as condições do Tratado de Budapeste.

A variante foi dado o número de admissão ATCC 53492.

Em vista das semelhanças entre as actividades antimicrobianas do antibiótico A 42867 e os sais correspondentes farmacêuticamente aceitáveis, na presente aplicação quando se trata com as propriedades biológicas do antibiótico A 42867 também se incluem os sais correspondentes e, vice versa, quando se trata com propriedades biológicas de um sal de adição farmacêuticamente aceitável do antibiótico A 42867 também está contida a forma correspondente ”sal de não adição”. A produção do antibiótico A 42867 é efectuada por cultura de Nocardia sp. capaz de 0 produzir, i.e., Nocardia sp. ATCC 53492 ou uma sua variante ou mutação pro dutora do antibiótico A 42867, sob condições aeróbicas num meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto, e sais inorgânicos. Muitos dos meios nutrientes normalmente empregados na arte de fermentação podem ser usados, preferindo-se no entanto certos meios. Fontes de carbono preferidas são glicose, manose, galactose, amido, farinha de milho, e análogos. Fontes de azoto preferidas são amónia, nitratos, farinha de soja, peptona, extracto de carne, extracto de fermento, triptona, aminoácidos, e análogos. Entre os sais inorgânicos que se podem incorporar no meio de cultura há os sais solúveis usuais capazes de originarem sódio, potássio, ferro, zinco, cobalto, magnésio, cálcio, amónio, cloreto, carbonato, sulfato, fosfato, nitrato e iões análogos.

Ordináriamente, a variedade produtora do antibiótico é pré-cultivada num frasco de agitação, e a seguir a cultura é usada para inocular jarros fermentadores para produção de quantidades substânciais das substâncias antibióticas. 0 meio usado para a pré-cultura pode ser o mesmo que o empregado para fermentações maiores, mas outros meios podem também ser empregados. A variedade produtora do antibiótico A 42867 pode crescer a temperaturas entre 20 e 40°0, de preferência entre 24 e 35°C·

Durante a fermentação, a produção do antibiótico pode ser vigiada por teste de amostra do liquido ou miceliais para a actividade antibiótica por exemplo por bioensaios ou processos TLC ou HPLO.

Os organismos sensíveis ao antibiótico A 42867 tal como Bacillus subtilis e S. aureus podem ser usados como organismos de teste. 0 bioensaio é convenientemente efectuado pelo método de difusão agar sobre lamelas de agar. A produção máxima de actividade antibiótica ocorre geralmente entre o segundo e o quinto dia de fermentação.

antibiótico A 42867 θ produzido por cultura da variedade Nocardia sp. ATCC 55492, ou uma sua variedade ou mutação produtora do antibiótico A 42867, e é principalmente encontrado nos líquidos de cultura.

Propriedades Morfológicas de Nocardia sp. ATOO 55492

A morfologia desta variedade cultivada num meio de agar de terra é análoga à das actinomicetas mostrando um desenvolvimento de um micelium aéreo abundante com hifas longas moderadamente ramificadas. Uma característica morfológica principal desta variedade é a fragmentação do substrato e micelium aéreo em elementos tipo varão. A fragmentação do substrato micélio foi observada em todos os meios agar usados para as caracteristicas culturais mas no meio No. 5, meio No. 7, Hickey-Tresner e albumina do ovo observou-se uma fragmentação completa. As hifas do substrato de Nocardia sp. ATCC 55492 foram completamente desenvolvidas com elementos tipos varão ramificados e fragmentados dependendo da idade da cultura.

micelium aéreo foi bem desenvolvido sobre agar de terra e sobre agar de água. As hifas aéreas eram de cadeia longa sobre agar de terra formando algumas vezes nós ou emaranhados como ninhos. A morfologia desta variedade parece-se com a do género Nocardia.

A caracterização morfológica desta variedade foi conseguida nas mesmas lamelas empregadas para o estudo de propriedades culturais. Para estabelecer se a fragmentação ocorre em lâminas de agar, a superfície do meio foi retirada com uma faca de plástico e o espécime foi observado numa lâmina de vidro sob um microscópio óptico. Em cultura líquida esta variedade apresentou uma fragmentação extensa em elementos bacilares.

Caracteristicas da Cultura de Nocardia sp. ATCC 554-92

Para o exame das caracteristicas de cultura, cultivamos Nocardia sp. ATCC 554-92 em vários meios padrão sugeridos por Shirling e Gottlieb (Shirling Ξ.Β. e Gottleb D., 1966-Metodo para caracterização de espécies Streptomyces-Int. J. Syst. Bacteriol, 16, 315-54-0) com a adição de vários meios recomendados por Waksman (Waksman, S-A. 1961-The Actinomycetes - The Williams and Wilkins Go. Baltimore; Vol. _2 , 328-354-).

A determinação da cor foi feita quando necessário pelo método de Maerz e Paul (Haerz A. e M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc. New York).

A capacidade do organismo para utilizar diferentes fontes de carbono foi investigada pelo método descrito por Shirling e Gottlieb.

As caracteristicas de cultura e fisiológicas e as fontes de utilização do carbono são assinaladas nas Tabelas I, II, III, IV e V.

As leituras na Tabela I foram tornadas após duas semanas de incubação a 28°G.

TABELA 1

CARACTERISTICAS DA CULTURA DA VARIEDADE

Nocardia sp. ATCC 53492

Meio de cultura

Meio No. 2 (extracto de levedura-agar de malte)

Meio No. 3 (agar de farinha de aveia)

Meio No. 4 (sais inorgânicos-agar de amido)

Meio No. 5 (glicerol-agar de asparagina)

Meio No. 6 (peptona-extrato de levedura agar de ferro)

Meio No. 7 (agar de tirosina)

Czapek-agar de sacarose

Caracteristicas

Crescimento abundante, superfície enrugada, cor castanha 15/H/ll, pigmento amarelo solúvel

Crescimento moderado, superfície suave, cor de laranja 12/L/12, indicio de micelium aéreo branco

Crescimento abundante, superfície enrugada cor de laranja-escura, 13/L/12, vestígio de micelium aéreo branco, vestígio de pigmento solúvel cor de rosa.

Crescimento abundante, superfície enrugada cor de laranja-escura 13/L/12, vestígio de micelium aéreo branco.

Crescimento moderado, superfície levemente enrugada, cor de damasco 10/F/7

Crescimento abundante, superfície enrugada cor castanha 15/H/ll, vestígios de micelium aéreo branco.

Crescimento abundante, superfície suave cor amarelo-laranja 9/G-/8, vestígio de micelium aéreo.

TABELA I (Continuação)

Meio de Cultura

Agar de farinha de aveia

Agares Hickey e Tresner

Agar de malto de cálcio

Agar de Bennett

Czapek agar de glicose

Agar de glicose asparagina

Nutriente agar

Caracteristicas

Crescimento abundante, superfície levemente enrugada, cor de laranja 12/F/10, vestigio de micelium aéreo branco, vestigio de pigmento cor de rosa solúvel.

Crescimento abundante, superfície enrugada, cor dourada 9/1/6.

Crescimento abundante, superfície suave, cor amarelo pálido lo/c/4, vestigio de micen lium aéreo branco

Crescimento abundante, superfície enrugada, cor castanha 15/H/ll.

Crescimento abundante, superfície enrugada, cor castanha 7/E/12, vestigio de micélio aéreo branco, pigmento solúvel amarelo escuro.

Crescimento moderado, superfície levemente dura, cor amarela 10/L/5·

Crescimento abundante, superfície suave, cor amarelo-laranja 9/0/6/

8TABELA I (Continuação)

Meio de Cultura

Agar de espuma de leite

Agar de albumina do ovo

Agar Sabouraud

Agar de batata

Agar de Água

Agar de terra

Agar de dextrose triptona

Caracteristicas

Crescimento abundante, superfície suave, cor de pera 9/1/5, vestígio de micelium aéreo branco.

Crescimento moderado, superfície suave, sem cor, vestígio de micelium aéreo.

Crescimento abundante, superfície rugosa, cor castanho 10/L/10.

Crescimento abundante, superfície rugosa, cor amarela 10/L/7, vestígio de micelium aéreo branco, pigmento cor de rosa solúvel.

Crescimento muito limitado, superfície suave, incolor, boa formação de micelium aéreo branco.

Crescimento moderado, superfície suave, incolor, formação abundante de micélio aéreo.

Crescimento abundante, superfície rugosa, cor amarelo 10/L/7.

As letras e números referem-se à cor determinada de acordo com Maerz e Paul (2).

CARACTERISTICAS FISIOLÓGICAS DE Nocardia sp. ATCC 55492

TABELA II

Testes	Resultados
Hidrólise de Amido Reacção da Tirosina Hidrólise da Caseina Solubilização de malato de cálcio Nitrito a partir do nitrato Decomposição da Celulose Produção de ácido sulfidrico	Positivo positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo com lâminas de acetato de chumbo

peptonização

positivo

Leite de tornesol/

1 coagulação

negativo

Temperatura de Tolerância

TABELA III

15°C	*	-
22°C	s	+
28°C	=	++
37°C	sk	++
42°C		+
50°C	—	—

A temperatura mais apropriada para o desenvolvimento das colónias foi observado andar entre cerca de 22°C e cerca de 42°C.

A temperatura óptima varia entre 28°C e 57°C.

Tolerância do pH

TABELA IV

PH	3 =	-
PH	4 »	-
PH	5 =	++
PH	6 =	++
PH	7 =	++
PH	8 =	++
PH	9 =	++
PH	10 --	s -
pH	11 =	_s _

- = Nenhum crescimento + = Crescimento Moderado ++ = Crescimento abundante

Para as caracteristicas fisiológicas, usamos as tolerâncias de pH e temperatura das experiências de Hickey e Tresner em meio de agar.

Utilização de fontes de carbono

TABELA V

Utilização do carbono

Fonte de Carbono	Crescimento
Lactose	++
Arabinose
Xilose	++
Manose	++
Fructose	++
Celobiose	++
Galactose	+ +
Inositol	++
Glicose	++
Rafinose	-
Ribose	++
Sacarose	-
Salicina	+
Celulose	-
Ramnose	-

- = Nenhum crescimento + = Crescimento moderado ++ = Crescimento abundante

Para este teste, o meio de teste No. 8 foi empregado e os resultados tomados após 10 dias de incubação a 28°C-50°C.

-12Estudos Quimicotaxonomicais

A variedade foi cultivada num meio V-6 (extrato de bife 0,5%; levedura autolizada 0,5%; peptona 0,5%; caseina hidrolizada 0,5%; glicose 2%; ITaOl 0,15%)» incubada num agitador rotativo a 200 rpm a 30°0 durante 72 horas. 0 crescimento do micelium num meio V-6 foi recolhido por centrifugação (3000 rpmxlO minutos), e lavado duas vezes com água destilada. 0 micelium foi a seguir lavado com etanol, seguido por secagem à temperatura ambiente sob um fluxo laminar.

micelium seco foi usado como uma preparação global da célula.

Análise dos Amino ácidos;

A análise dos amino ácidos efectuada como descrito por Becker e outros, (Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates”, Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964) mostrou a presença de ácidos meso-diaminopimélicos.

Análise do Açúcar;

A análise do teor de açúcar efectuada de acordo com M.P. Lechevalier, (Identification of aerobic actinomycetes of clinicai importance, J. Lab. clin. Med. 71, 934-944 (1968) usando folhas de cromatografia de camada fina como descrito por J.L. Staneck e G.p. Hoberts, (Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography, 28, 226-231 (1974) mostrou a presença de arabinose e galactose.

-15Identidade de Nocardia sp. ATOO 55492

A presença de ácidos meso-diaminopimélicos juntamente com açucares diagnosticados tal como galactose e arabinose, indicou que esta variedade é uma actinomycetes com parede celular tipo IV, de acordo com a classificação de Lechevalier M.P. e Π. Lechevalier, (Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes, Int. Journ. Syst. Bacterial. 2p, 455-443 (1970)).

Tal como com outros microorganismos, as caracteristicas da variedade produtora de A 42867 estão sujeitas a variação, por exemplo as variantes e mutações artificiais da variedade podem ser obtidas por tratamento com várias mutações conhecidas, tal como raios U.V., raios Σ, ondas de alta frequência, raios radioactivos e produtos químicos tal como ácido nitroso, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, e muitos outros. Todas as variantes e mutações naturais e artificiais que pertencem à espécie do género Nocardia e produzem antibióticos A 42867, são consideradas equivalentes à variedade Nocardia sp. ATCC 55492 e são comtemplados como estando dentro do âmbito deste invento.

A recuperação dos antibióticos A 42867 a partir dos líquidos de fermentação do microorganismo de produção é efectuada de acordo com técnicas conhecidas per se as quais incluem extracção com solventes, precipitação por adição de não solventes ou por variação do pH da solução, cromatografia de partição, cromatografia de partição de fase inversa, cromatografia de permutação iónica, cromatografia de afinidade e análogos.

Um processo preferido inclui uma cromatografia de afinidade sobre D-Alanil-D-Alanina imobilizada seguida por cromatografia de coluna de fase inversa.

Matrizes D-Alanil-D-Alanina imobilizadas próprias para o presente processo de recuperação são divulgadas na Aplicação da patente Europeia No. 85112555· A matriz preferida no presente processo é D-Alanil-D-alanina associada com um polidextrano de poro controlado e ligação cruzada.

Os líquidos de fermentação filtrados são a seguir submetidos a uma cromatografia de afinidade sobre D-Alanil-D-Alanina imobilizada, quer em coluna quer em descontinuo.

A ligação da substância antibiótica A 42867 à matriz de afinidade é de preferência efectuada a um pH de cerca de 7,0-δ,Ο θ a sua eluição é efectuada a valores pH mais básicos (de preferência entre 9,0 θ 11,5) por meio de uma base aquosa. Esta base aquosa pode ser amónia, uma amina volátil, uma base ou um hidróxido de metal alcalino ou uma solução básica tamponada opcionalmente na presença de um solvente orgânico polar tal como um solvente polar miscível em água como a seguir definido.

Após remoção das impurezas por lavagem da coluna com tampão aquoso pH 4-8, contendo opeionalmente sais, ureia e/ou solventes micíveis em água, o antibiótico A 42867 é eluído com a mistura de eluição acima descrita. A substância antibiótica em bruto é a seguir recuperada de preferência por remoção completa da água das fracções que contêm o conjunto antibiótico por destilação azeotrópica com um solvente orgânico capaz de formar misturas azeotrópicas mínimas com água, seguida por adição de um não solvente para precipitar o produto desejado.

Exemplos representativos de solventes orgânicos capazes de formar misturas azeotrópicas mínimas com água são n-butanol, benzeno, tolueno, éter butílico, te-15-

tracloreto de carbono, clorofórmio, ciclohexano, 2,5-dimetilfurano, hexano e m-xileno; o solvente preferido sendo o n-butanol.

Exemplos de não solventes são: éter de petróleo, éteres alquil inferior, tal como éter etílico, éter propílico e éter butilico, e cetonas de alquil inferior tal como acetona.

Alternativamente, as fracçoes contendo o conjunto do antibiótico são concentradas até um pequeno volume, de preferência por destilação azeotrópica com um solvente orgânico como acima definido, e a solução aquosa resultante é liofilizada.

Se a base aquosa empregada na eluição é não volátil, pode ser necessário neutralizar e desalinizar o concentrado antes da precipitação ou secagem por congelação,

Um processo de desalinização conveniente inclui a aplicação da solução aquosa contendo o antibiótico a uma coluna de sílica gel silanizada, lavando com água destilada e eluindo com uma mistura de um solvente polar miscível em água e água.

Exemplos representativos de solventes polares miscíveis em água são: alcóois solúveis em água, (tal como metanol, etanol, iso-propanol, n-butanol), acetona, acetonitrilo, alquil inferior alcanoatos (tal como etil acetato), tetrahidrofurano, dioxano e dimetilformamida e suas misturas; sendo o solvente polar miscível em água preferido o acetonitrilo.

Alternativamente, a desalinização pode ser efectuada por aplicação da solução contendo o antibiótico à coluna de afinidade acima descrita, lavando com água destila

-16da e eluindo com uma base-aquosa volátil como acima descrito para a eluição e a cromatografia de afinidade.

produto assim obtido é o antibiótico A 42867· Um processo conveniente para obter o antibiótico puro A 42867 é representado por uma purificação posterior como obtida acima sobre uma coluna de cromatografia de afinidade. A mesma fase istacionária que acima (D-Alanil-D-Alanina imobilizada) é geralmente usada e a substância antibiótica desejada é eluida seguindo o processo de cromatografia de afinidade sobre D-Alanil-D-Alanina imobilizada acima descrita.

Uma D-Alanil-D-Alanina imobilizada preferida é Sefarose-£-aminocaproil-D-Alanil-D-Alanina, uma mistura de equilíbrio preferida é 0,16% (w/v) de amónia contendo NaCl 2M ajustada a pH 7-8, uma solução de lavagem preferida é 0,16% (w/v) amónia contendo NaCl 2M ajustado a pH 7-8, uma mistura de eluição preferida é 0,16% (w/v) amónia.

Alternativamente, a substância antibiótica do invento pode ser isolada a partir do líquido de fermentação ou a seguir purificada por meio de uma resina aniónica forte ou fraca incluindo matrizes de poliestireno funcionalizado, acrílico ou polidextrano. Exemplos de resinas de permutação aniónicas fracas são as que são vendidas sob as designações comerciais seguintes: Dowex IWA-1 ou WGR (Dow Che mical), Amberlite IRA-73 (Rohm and Haas), DEAE-Sephadex (Pharmacia). Exemplos de resinas de permutação aniónica forte que podem ser usadas de acordo com o invento incluem as vendidas sob os nomes comerciais seguintes: Dowex KSA-1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), Amberlite 13-904 (Rohm and Haas) e QAE-Sephadex (Pharmacia).

A eluição da substância antibiótica A 42867 destas resinas é efectuada por meios de misturas de

-17gradiente linear de solução aquosa de electrólitos, tal como cloretos de sódio ou potássio, em água ou misturas de água e um solvente orgânico miscível em água tal como álcool inferior (e.g. (Cj-C^Jalcanol) ou alquil inferior cetonas (e.g. acetona, metiletil cetona, etc.)

CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DO ANTIBIÓTICO A 42867

A) Espectro de absorção ultravioleta, o qual é representado na Figura 1 dos desenhos em anexo, e apresenta a absorção máxima seguinte:

	max (nm)
HC1 O,1N	282
água	282
fosfato tampão pH 7,4	282
fosfato tampão pH 9	282

305 (redondo)

fosfato tampão 0,1 KOH

305 265 (redondo)

B) Espectro de absorção infravermelho que se apresenta na Figura 2 dos desenhos em anexo e apresenta a absorção máxima seguinte (cm”¹): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1650; 1580; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1300; 1235; 1210; 1160; 1130; 1060; 1025; 1000; 970; 840; 790-700; 720 (nujol).

C) Espectro ^í-NMR o qual é apresentado na Figura 3 θ exibe os grupos de sinais seguintes (em ppm) a 270 KHz registados em DMSO άθ (hexadeuterodimetilsulfóxido) usando TM3 como o padrão interno (0,00 ppm), (5 = ppm):

0,90, e Z^_(0H5)2-(CH)_7; 1,02, d /CHj-CCH)J; 1,23, d Z‘CH3-(OH)_7; 1,52, s Z'CH3-^_7 1,77, n Z^_0H(0H3)₂_7; 2,38, s (N-CHj); 3,0-6,35, s e m (CIi’s aromático, açúcar e CH’s peptidicos); 6,27-9,29 (CH's aromático, NH’s pep-18-

tidico e 0H's fenólico). d a duplo s = simples m = múltiplo

D) Tempo de retenção (R^_) de 0,557 em relação a Vancomycin.HOl (Vancocin, Eli Lilly, = 16,56 min.) quando analizado por HPLC de fase inversa, sob as condições seguintes:

coluna: Ultraesfera ODS (5 Jim) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.d.) x 250 mm pré-coluna: Brownlee Labs RP 18 (5 um) eluente: água: acetonitrilo: 2-etanolamina: ácido trifluoroacético 9:1:0,01:0,01 (v/v) caudal: 1,6 ml/min detector U.V.; 254 nm

Padrão interno: Vancomycin HC1 (R^_ = 16,56 min) (Vancocin, Eli Lilly).

E) Tempo de Retenção (R^.) de 0,665 em relação a Vancomycin. HC1 (Vancocin, Eli Lilly, R^_ 9,96 min) quando analizado por HPLC de fase inversa sob as condições seguintes:

Coluna: Ultraesfera ODS (5 )*m) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.d.) x 250 mm pré-coluna: Brownlee Labs RP 18 (5 )im) eluente A: CH^CN (2,5 g/1) NaH₂P0₄.H₂0 eluente B: CH^CN (2,5 g/1) NaH₂P0₄.H₂0

2% 1 ajustado a

98% J pH 6,0

70% / ajustado a

50% J pH 6,0

eluição; gradiente linear de % a 60% de eluente B em eluente A, em 40 min.

caudal: 1,6 ml/min detector U.V. 254 nm

Padrão interno: Vancomycin.HCl (R^ = 9,96 min)

Vencocin, Eli Lilly)

F) Análise elementar, após a amostra ter sido préviamente seca a cerca de 140°C sob atmosfera inerte a qual indica a seguinte composição percentual aproximada (média): carbono 53,3%; hidrogénio 5,9%; azoto 7,85%; cloro (total) 4,41%; cloro (iónico) 2,22%. Resíduo inorgânico a 900°C no ar: 0,87%.

G) Perfil de titulação ácido-base em água após titulação com KOH 0,05N aquosa de uma amostra préviamente adicionada com excesso de HC1 aquoso o qual mostra valores pKa a 3,2; 7,1 e 8,3.

H) valor de 0,56 no sistema cromatográfico seguinte;

(Cloreto de sódio aquoso 87,5g/l» NaEypO^ 70%? ajustado a CH^CN 0,5 g/1) ) PH 6 usando lâminas de silica gel silanizada de fase inversa (RA—18

Visualização:

-Luz U.V. a 254 nm

-Cor amarela com Reagente Pauly, i.e., ácido sulfanilico diazotizado (J. chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1955))

-Bioautografia usando B. subtilis ATCC 6633 sobre meio Davis minimo.

I) MW de cerca de 1559 obtido a partir do do espectro FAB-MS mostrando 0 pico M+H a 1560

antibiótico A 42867 possui funções ácidas e básicas e além de formar sais internos sob condições de pH apropriado pode formar sais com contra iões orgânicos e inorgânicos de acordo com processos convencionais.

Sais ácidos de adição, representativos e apropriados, dos compostos do invento incluem os sais formados por reacção padrão quer com ácidos orgânicos quer inorgânicos, tal como, por exemplo, clorídrico, bromidrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, tricloroacético, succinico, citríco, ascórbico, láctico, maleico, fumárico, palmitico, eólico, pamóico, mícico, glutâmico, canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, láurico, esteárico, salicilico, metanosulfónico, benzenosulfónico, sórbico, picrico, benzóico, cinâmico, e ácidos análogos.

Exemplos representativos daquelas bases são; hidróxido de metal alcalino ou de metal alcalino terroso tal como hidróxido de sódio, potássio, cálcio, magnésio, bário; amónia e aminas orgânicas alifáticas, aliciclicas ou aromáticas tal como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, e picolina.

A transformação dos compostos não-sal¹¹do invento nos sais de adição correspondentes, e o inverso, i.e., a transformação de um sal de adição de um composto do invento na forma não sal, estão dentro do talento técnico ordinário e estão compreendidos no presente invento.

Por exemplo o antibiótico A 42867 pode ser transformado no sal ácido de adição correspondente por dissolução da forma não sal num solvente aquoso e adição de um ligeiro excesso molar do ácido ou base seleccionado. A solução ou suspensão resultante e a seguir liofilizada para recuperar o sal desejado.

No caso do sal final ser insolúvel num solvente onde a forma não sal é solúvel, recolhe-se por filtração a partir da solução orgânica da forma não sal após adição da quantidade estequiométrica ou um excesso molar ligeiro do ácido ou base seleccionado.

A forma não sal pode ser preparada a partir de um sal de ácido ou base correspondente dissolvido num solvente aquoso o qual é a seguir neutralizado para libertar a forma não-sal.

Quando após a neutralização a eliminação do excesso de ácido ou base é necessária, podemos empregar um processo de desalinização vulgar.

Por exemplo, a cromatografia de coluna sobre sílica gel silanizada, poliestireno não funcionalizado, resinas acrílicas e de polidextrano de poro controlado (tal como Sephadex LH 20) ou carbono activado podem ser convenientemente usadas. Após eluição dos sais indesejáveis com uma solução aquosa, o produto desejado é eluido por meio de um gradiente linear ou um gradiente progressivo de uma mistura de água e um solvente orgânico polar ou apoiar, tal como acetonitrilo/água de 50:50 até cerca de 100% de acetoni trilo.

Como é conhecido na especialidade, a formação de sal quer com ácidos farmacêuticamente aceitáveis (ou bases) ou ácidos farmacêuticamente não aceitáveis (ou bases) pode ser usado como uma técnica de purificação conveniente. Após formação e isolamento, a forma sal de um antibiótico A 42867 pode ser transformado na forma não sal correspondente ou numa forma sal farmacêuticamente aceitável.

Nalguns casos, um sal base de adição do antibiótico A 42867 é mais solúvel em água e solventes hidrofilicos.

A actividade antibacteriana do composto do invento pode ser demonstrada in vitro por meio de testes de diluição padrão sobre diferentes culturas de microorganismos.

Os meios de cultura e as condições de crescimento para determinações MIO (Concentração inibidora mínima) foram os seguintes: Líquido Isosensitest (oxoid), 24 h, para staphylococci, Strep. faecalis e bactérias de Gram-negativo (Escherichia coli; líquido Todd-Hewitt (Difco)., 24 h para outras espécies estreptococais; GG do líquido base (Difco) + 1% Isovitalex (BBL), 48 h, atmosfera enriquecida por C0₂ para Neisseria gonorrh.oeae; líquido Brain Heart (Difco) + 1% de suplemento C (Difco), 48 h. para Haemophilus influenzae; líquido AC (Difco), 24 h, atmosfera anaeróbica para Clostridium perfringens; agar Wilkins-Chalgren (ref: T-i. Wilkins & S. Chalgren, 1976, Antimicrob. Ag- Chemother. 10, 926), 48h, atmosfera anaeróbica para outros anaerobos (£. difficile, propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis); líquido PPLO (Difco) + 10% de soro de cavalo + 1% de glicose, 48 h para Mycoplasma gallisepticum; líquido PPLO com suplementos com um R.T. Evans e D. Taylor-Robinson (J. Antimicrob. Chemother. 4, 57), 24 h para U. urealyticum. A incubação foi a 37°C. A inoculação foi como se segue: 1% (v/v) de um líquido de cultura 48 h para M. gallisepticum» cerca de IO⁴ unidades de mudança de cor/ml para U. urealyticum; cerca de 10⁴-10^ unidades formadoras de colónia/ml para outros líquidos de diluição MICs; cerca de 10⁴-10^ bactérias/ /local (inoculadas com um inoculador de ponto múltiplo) para diluição agar MICs (_C. difficile» P. acnes, B. fragilis).

As concentrações inibidoras mínimas (MIC, pg/ml) para alguns microorganismos são assinaladas a seguir na Tabela VI.

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TABELA VI

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-240 antibiótico A 42867 foi observado activo contra coagulase staphylococci negativa. As M.I.C.

(ug/ml) em relação a uma série de isolados clínicos de S.

epidermidis e S. haemolyticus são assinalados a seguir:

Variedade

S. epidermidis 1595

s. epidermidis 1408

S. epidermidis L410

S. haemolyticus L381

S. haemolyticus L382

S. haemolyticus L383

TABELA VII

Antibiótico A 42867

M.I.O. (pg/ml)

0,5

A actividade antimicrobiana dos compostos do invento é também confirmado em septicemia experimental em ratos.

Grupos de control e tratamento contém ! dez ratos CD-1 (Charles River) pesando 18-22 g. Eles foram infectados intraperitonealmente com 0,5 ml de suspensão bacteriana preparada por diluição durante uma noite de cultura de S. pyogenes C 203 (L49) com solução salina peptonizada estéril. A inoculação foi ajustada de tal modo que animais não tratados morreram de septicemia dentro de 48 h. Os compostos a serem testados foram subcutâneamente administrados após infecção. Ao 7² dia, o SDc_n θ® mg/kg foi calculado pelo método de Spearman e Karber (D.J. Finney Statistical Methods in Biological Assay, Griffin, página 524, 1952) a partir da percentagem de animais sobreviventes a cada dose.

Sob estas condições o valor

do an-25-

tibiótico A 42867 foi 1,54 mg/kg.

Em geral, para tratamento antibacteriano o antibiótico A 42867, bem como os seus sais farmacêuticamente aceitáveis não tóxicos ou suas misturas, podem ser administrados por vias diferentes tal como topicamente ou parenteralmente. A administração parenteral é, em geral, a via preferida de administração.

As composições para injecção podem tomar tais formas como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter adjuvantes tal como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersantes.

Alternativamente, o ingrediente activo í pode estar na forma de pó para reconstituição no momento da ί entrega, quando um veículo apropriado, tal como água estéI ril, se lhe adiciona.

I i Dependendo da via de administração, estes compostos podem ser formulados em várias formas de dosagem.

Nalguns casos, pode ser possível formular os compostos do invento em formas de dosagem entéricas revestidas para administração oral as quais podem ser preparadas como sabido na especialidade (ver por exemplo Remington's pharmaceutical Sciences”, décima quinta edição, Mack Publishing Company, Easton, Pensylvania, U.S.A. página 1614).

Isto podia ser especialmente o caso quando a absorção da substância antimicrobiana no aparelho entérico, é particularmente desejada enquanto passa inalterada através do aparelho gástrico.

A quantidade de principio activo a ser

administrado depende de vários factores, tal como o taman- j ho e condição do sujeito a ser tratado, a via e frequência da administração, e o agente causador envolvido.

As substâncias antibióticas do presente invento e os seus sais fisiológicamente aceitáveis, são geralmente eficazes com uma dose diária de entre cerca de 0,5 e 50 mg de ingrediente activo por quilograma de peso do corpo do doente, opcionalmente dividido em 1 a 4 administrações por dia.

Composições particularmente desejadas são as preparadas em doses unitárias contendo de cerca de 100 a cerca de 5000 mg por unidade.

Exemplos representativos de veículos apropriados para injecção são: água estéril para injecção, solução Ringer’s, solução salina a 0,9% e dextrose a 5%·

Para infusão i.v., a concentração apropriada do antibiótico no veículo está entre cerca de 5% θ 10%. Outras formulações apropriadas para unidades de dosagem são frascos hermeticamente selados, bolsas plásticas, ι estéreis, frascos com tampa de borracha e análogos.

] Além disso, a substância antibiótica do invento pode ser formulada numa preparação tópica tal como uma solução, um creme ou uma loção. Estas preparações contêm convenientemente de 0,1 a 15% (w/v) do ingrediente activo.

Além disso, as substâncias antibióticas ι do invento são úteis para a supressão do crescimento de Ciosíj tridium difficile a qual causa colite prendomembranosa no intestino. Estes antibióticos podem ser usados no tratamento de colite prendomembranosa pela administração oral de uma dose eficaz dos antibióticos ou um seu sal farmacêuticamente

aceitável, preparado numa forma de dosagem farmacêuticamente aceitável. Para tal uso, os antibióticos podem ser administrados em cápsulas de gelatina ou em suspensão líquida.

Além da sua actividade como medicamento, o antibiótico A 42867, ou um seu sal aceitável, pode ser usado como um promotor do crescimento animal.

Com este fim, um composto do invento é oralmente administrado numa alimentação eficaz apropriada. A concentração exacta empregada é a que é necessária para fornecer um agente activo numa quantidade eficaz promotora do crescimento quando se consomem quantidades normais de administração.

A adição do composto activo do invento à alimentação animal é de preferência efectuada pela preparação de um premix de alimentação apropriado contendo o composto activo numa quantidade eficaz e incorporando o premix na ração completa.

Alternativamente, o concentrado intermediário ou suplemento alimentar contendo o ingrediente activo podem ser misturados na alimentação.

A maneira pela qual podem ser preparados e administrados tais premixes na alimentação e rações completas, são descritas nos livros de referência (tal como Applied Animal Nutrition”, W.H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 ou Livestock Feeds and Feeding” livros 0 e B, Corvallis, Oregon, U.S.A., 1977) θ são aqui incorporados para referência.

Os exemplos seguintes ilustram ainda mais o invento, e não devem ser interpretados como limitando-se de algum modo.

-28Exemplo 1: produção de antibiótico A 42867

A cultura de stock do organismo produtor (Nocardia sp. ATOO 55492) é riscada em ladeiras de agar de farinha de aveia e incubada a 28°C durante 2 semanas.

Um buraco cheio da variedade de crescimento é inoculado num balão Erlenmayer de 500 ml contendo 100 ml de um meio de cultura composto de 2,0% de dextrose, 0,8% farinha de feijão de soja, 0,2% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl e 0,4% de CaCO^, cujo pH do meio foi ajustado a 7,5 antes da esterilização. 0 balão foi incubado num agitador rotativo a 28°0 durante 72 horas. Uma parte aliquota de 100 ml da cultura é a seguir inoculada num jarro de fermentação contendo 4 litros do mesmo meio de cultura e a cultura é incubada a 28°C durante 48 horas com agitação de cerca de 90 rpm e aeração de um litro padrão de ar por volume por minuto. Após inoculação de 4 litros do meio de cultura num jarro fermentador contendo 200 litros de meio de fermentação tendo a mesma composição do meio de cultura, a fermentação é efectuada durante 96 horas com agitação de cerca de 250 rpm e aeração de um litro padrão de ar por volume por minuto.

A actividade antibiótica foi vigiada por ensaio microbiológico usando B. subtilis cultivado no mínimo de meio Davis.

Exemplo 2: Recuperação de antibiótico A 42867 líquido de fermentação total (400 litros) obtido como descrito no Exemplo 1, é filtrado usando o auxiliar filtrante (Hyflo-ploI-Ia®), num filtro rotativo. 0 lí quido filtrado é ajustado a pH 7,5 com ácido clorídrico 2N,

-29e adicionado a 1000 ml de matriz modificada D-Ala-D-Ala-aminocaproil-sefarose-4B pré-entumescida (preparada como descrito na Aplicação da Patente Europeia No. 83112555.4) e deixada durante a noite sob agitação suave.

A resina é recolhida por filtração e lavada com cerca de 10 1 de 0,5% (w/v) HCl-Tris tampão pH 7» 5 o qual contem 5% (w/v)NaCl e a seguir com água (4x5 1) enquanto o líquido é rejeitado.

produto selectivamente ligado à resina é eluido com 1,5% (w/v) de hidróxido de amónio (4χ5 1) e concentrado até um pequeno volume (cerca de 1800 ml) por meio de destilação azeotrópica com n-butanol sob pressão reduzida.

A solução aquosa concentrada é liofilizada obtendo-se antibiótico A 42867 em bruto (75>6 g).

Exemplo 3; purificação de antibiótico A 42867 em bruto.

antibiótico A 42867 em bruto obtido seguindo o processo do Exemplo 2 (75 g) é dissolvido em 2 litros de água contendo cloreto de sódio 2M, ajustamos a pH 7»5 com solução de hidróxido de sódio O,1N e a seguir filtramos.

filtrado é aplicado a 500 ml/hora a uma coluna de 1000 ml (0,1x0,1 m) de matriz modificada D-Ala-D-Ala-6-aminocaproil-sefarose-4B pré-entumescida (preparada como descrito na Aplicação da Patente Europeia No. 83112555.4) préviamente equilibrada com borato 0,04M tampão pH 7,5 contendo cloreto de sódio 2M e 0,6 ml de Triton x 100 (grau Baker).

A coluna é lavada com 8 1 de ureia 8M

500 ml/h seguido por 70 1 de NaOTI fracções de 1000 ml cada.

(pH 7,5) com um caudal de aquosa a pH 10 recolhendo

Estas fracções foram ensaiadas sobre culturas B. subtilis por ensaio de disco de agar e as fracções que são inactivas são rejeitadas enquanto as activas ( como as fracções 65-70 neste caso) juntam-se, concentram-se até um pequeno volume (500 ml) sob pressão reduzida por meio de destilação azeotrópica com n-butanol e liofilizamos para obtermos o antibiótico A 42867 (4 g).

Exemplo 4: Purificação e desalinização do antibiótico A 42867

3,5 g do antibiótico A 42867 obtido segundo o processo do Exemplo 3, são dissolvidas em 70 ml de uma solução de dihidrogeno fosfato de sódio monohidratado (2,5 g/1) θ acetonitrilo (91:9) e filtramos.

ml deste filtrado são aplicados a uma coluna de aço inoxidável (2x50 cm) cheia com 40 g de silica gel de fase inversa 10 pm RP18 Lichrosorb (Merck).

A coluna faz parte de uma unidade Chromatospac Modulprep (jobin Tvon, 16-18 Rue de Canal 9116$ Longjumeau, Rrance).

A coluna é eluida a 8 ml/min com a mesma solução usada para dissolver a amostra e recolhemos fracções de 50 ml.

Cada fracção é vigiada por HPLO e bioensaio em discos de papel para microorganismos susceptíveis tal como B. subtilis.

As fracções activas sobre B. subtilis de sete ensaios juntam-se, remove-se acetonitrilo por destilação sob pressão reduzida e o resíduo é diluído com uma quantidade de água a qual foi cerca do volume da solução inicial.

A solução foi ajustada a pH 7,5 θ mais tarde aplicada com um caudal de 100 ml/h a uma coluna (5x15 cm) de matriz modificada D-Ala-D-Ala-6-aminocaproil-sefarose-4B pré-entumescida (preparada como descrito na Aplicação da Patente Suropeia No. 85112555.4) préviamente equilibrada com borato tampão 0,04M pH 7,5·

A coluna foi lavada com 8 1 de água (aci difiçada com 0,5 ml/1 de ácido cloridrico 1N).

A coluna foi a seguir eluida com 1,5% (w/v) de hidróxido de amónio recolhendo fracções de 100 ml cada.

As fracções activas contra B. subtilis são misturadas, concentradas sob pressão e liofilizadas para obtermos 1,2 g de uma preparação dessalinizada do antibiótico A 42867 cujas caracteristicas físico-quimicas são assinaladas a seguir.

REIVINDICAQÕES la. - processo para a preparação do antibiótico A 4286? ou de um seu sal, tendo na forma não salina, as caracteristicas seguintes:

Çaracteristicas fisico-quimicas do antibiótico A 42867:

A) Espectro de absorção ultravioleta, o qual se repre- senta na Figura 1

e representa os máximos de absorção seguintes:

a) HC1 Ο,ΙΝ

b) água

c) fosfato tampão pH 7 »4

d) fosfato tampão pH 9

e) fosfato tampão 0,1 KOH

Xmax (nm)

282

305 (rebordo)

505

265 (rebordo)

B) 0 espectro de absorção infravermelho que se mostra na Figura 2,

e apresenta os máximos de absorção seguintes (cm”¹): 3700-5100, 5000-2800 (nujol); 1650; 1580; 1460 (nujol), 1575 (nujol); 1300; 1235; 1210; 1160; 1130; 1060; 1025; 1000; 970; 840 ; 790-700; 720 (nujol)·.

C) 0 espectro o qual se mostra na Figura 3

e exibe os grupos de sinais seguintes (em ppm) a 270 MHz registados em DIÍSO d^ (hexadeuterodimetilsulfóxido) usando TMS como o padrão interno (0,00 ppm), (^ = ppm):

Ppm), (6 = PPm):

0,90, d QGítyz-tWtiJ·, 1,02, d /CH₃-(GH)_7;

1,25, d Z^_GH₅-(GH)J7; 1,52, S

1,77, m /“CH(CH^)_2-7; 2,58, s (N-CHj); 5,0-6,55, s e m (GH‘, aromáticos de açúcar e peptidicos; 6,27-9,29 (CH's aromáticos, NH’s peptidicos e 0H's fenólicos).

d) = dubleto s = singeleto m = multipleto

D) Tempo de retenção (R^) de 0,557 em relação a Vancomicina HC1 (Vancomicina, Eli Lilly, = 16,56 min) quando analizado por HPLC de fase reversa sob as condições seguintes Coluna: Ultraesfera ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (d.i.)x 250 mm

pré-coluna: Brownlee Labs Rp 18 (5 jum)

Eluente: água:acetonitrilo:2-etanolamina:ácido trifluoroacético 9:1:0,01:0,01 (v/v) caudal: 1,6 ml/min.

Detector U.V.: 254 nm.

Padrão Interno: Vancomicina HC1 (R^ = 16,36 min.) Vancomicina, Eli Lilly).

E) Tempo de Retenção (R^) de 0,665 em relação a Vancomicina.

HC1 (Vancomicina, Eli Lilly, R^ 9,96 min.) quando analisado por HPLC de fase reversa sob as condições seguintes:

Coluna: Ultraesfera 0D.S 55 P&) Altex (Beckman)

4,6 mm (d.i.) x 250 mm pré-coluna: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluente A: CH^CN (2,5 g/1) NaH₂P0₄.H₂0 eluente B: CH^CN (2,5 g/1) NaH₂P0₄.H₂0

2% 1	ajustado a
98% ]	' pH 6,0
70% j	1 ajustado a
30% J	pH 6,0

eluição: gradiente linear de 5% a 60% de eluente B em eluen· te A, em 40 min.

caudal: 1,6 ml/min.

Detector U.V.: 254 nm

Padrão interno: Vancomicina.HC1 (R^_ = 9,96 min.)

Vancomicina, Eli Lilly)

Claims

p) Análise elementar, após a amostra ter sido préviamente seca a cerca de 140°C sob atmosfera inerte a qual indica a seguinte composição percentual aproximada (média): carbono 53,3%; hidrogénio 5,9%; azoto 7,85; cloro (total) 4,41%; cloro (iónico) 2,22%. resíduo inorgânico a 900°C no ar: 0,875%.

G) perfil de titulação ácido-base em água após titulação com KOH 0,0511 aquosa de uma amostra previamente adicionada com excesso de H01 aquoso o qual mostra valores pKa a 5,2; 7,1 e 8,5.

usando placas de sílica gel silanada de fase reversa (RA-18 ^254)

Visualização:

- Luz U.V. a 254 nm

- cor amarela com Reagente Pauly, i.e., ácido sulfanilico diazotado (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953))

-Bioautografia usando B. subtilis ATOO 6633 sobre meio mínimo de Davis.

I) PM de cerca de 1559 obtido do espectro BAR-EM mosa trando o pico M+H a 1560, caracterizado por compreender a cultura da estirpe Nocardia sp. ATCC 53492 ou de um seu variante ou mutante produtor de antibiótico A 42867, sob condições aeróbicas submersas, na presença de uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos, a recuperação e isolamento do referido antibiótico a partir dos caldos de fermentação e a sua transformação no sal desejado, se necessário.
2â. - processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a variante ser cultivada a uma temperatura entre 20°0 e 40°C.

-57Ja. - processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a temperatura se situar entre cerca de 24°C e 55°O·
4a. - processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da recuperação e isolamento das substâncias antibióticas, ser obtido por sujeição dos caldos de fermentação filtrados a uma cromatografia de afinidade sobre D-Alanyl-Alanina imobilizada seguida por cromatografia de partição de fase reversa ou de permuta iónica.
5&. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de incluir, na referida composição um composto obtido de acordo com a reivindicação 1, como o ingrediente activo, juntamente com. um veículo farmacêuticamente aceitável.
6â. - Kétodo de tratamento de doenças infecciosas, caracterizado pelo facto de compreender a administração de uma quantidade antibióticamente eficaz de um composto obtido de acordo com a reivindicação 1 a um doente dele necessitado, sendo a gama de dosagem de 0,5 a 50 mg de ingrediente activo por Kg de peso corporal, em 1 a 4 administrações por dia.
7^. - Cultura biologicamente pura de Nocardia sp. ATCC 55492 ou de um seu variante ou mutante produtor de antibiótico A 42867, sendo a referida cultura capaz

-33de produzir antibiótico A 42867 numa quantidade recuperável, num meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e substâncias inorgânicas.
8ã. - Estirpe produtora do antibiótico

A 42867 caracterizada pelo facto de ser a TTocardia sp. ATCC 53492.

Lisboa, 27 de Julho de 1937

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOfl CORDON, 10-A, 1.’ 1200 LISBOA

FIGURA 1 (3 FOLHAS)

FIG.1

300 340 ,4

250

X(nm)

FIGURA 3 (3 FOLHAS)

FIG. 3