PT91535A - Processo para a preparacao de um novo antibiotico glicopeptido, decaplanin e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de HOECHST AKTIEIGESEL-LSCHAF3!, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Christopher Milton Mathew Franco, Dr. Sugata Chatterjee, Dr. Irra Koteswara Satya Yijakumar, Dr. Deepak Kumar Chatterjee, Dr. Bimal Raresh Ganguli, residentes na índia e Dr. Richard Helmut Rupp, Dr. Hans-Wolfram Felha-ber, Dr. Herbert Kogler, Prof.Dr. Gerhard Seibert e Dr. Volker Teetz, residentes na Alemanha Ocidental) para “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE m NOVO ANTIBIÓTICO G1I00PEP-TIDQ. PECAPDANIN E DE COMPOSI-QOES FARMACÊUTICAS QUE 0 CONTEM"

Descrição GSP ’ A presente invenção refere-se a um novo antibiótico glicopeptido, a decaplanin, ao processo para a sua produção por meio de uma cultura de actinomiceta Y-86 36910 (depositada no Deutsche Sammlung fur Mikroorga- - 1 - \ Jintt/Airrrv

•ÍBníysxruírjLKíi:

nismen de acordo com o Tratado de Budapeste, a 5 de Agosto de 1988 com o námero DSM 4763) aos seus variantes e mutantes e à sua utilização como medicamento. A cultura de actinomioeta is HIL Y--86,36910 (cultura de actinomioeta η2 Y-86,36910) foi isolada a partir de um solo recolhido próximo de Pune, Maharashtra, índia. 0a variantes e mutantes da cultura de actinomioeta N2 HII T-86 36910 podem ser obtidas por um processo conhecido utilizando um mutagénio, tal como luz ultra-violeta ou N-metil-EP-nitro-IT-nitrosoguanidina (c.f. por exemplo, H. G. Schlegel, Allgemeine Mikroobio-logie. New York, G-eorg Thieme Verlag, 1985). A oultura de actinomioeta n2 T-86, 36910 pertence à ordem dos Actino-mioetais e ao genero Kibdelosporangium. $ considerada como uma nova estirpe visto que difere das estirpes conhecidas em muitas das suas caraeterísticas morfológicas, culturais e fisiológicas como se tornará evidente a partir da descrição apresentada a seguir. ]$ considerada também como uma nova estirpe porque produz um novo antibiótico aqui designado por Decaplanin, como se verificará a partir da descrição a seguir. A Decaplanin, um composto de fórmula IV é um antibiótico glicopeptido do tipo vancomicina. Os antibióticos glicopeptidos do tipo vancomicina descritos na literatura são o Antibiótico A 477, na patente de invenção norte-amcrioana n2 3 780 174 de 18 de Dezembro de 1972; Antibiótico A 35512 em J. Antibiotics 33. 1980, 1407-1416: Antibiótico A 41030 e Antibiótico A 47934 no Programme and Abstracts of the 23rd interscience Oonference on Antimicrobial Agents and Ohemotherapy, Abstracts n2s 440 e 443, respectivamente, p. 164, Das Vegas, 1983;

Antibiotics AAJ-271 no Programme and Abstracts of the 26th Interscience Oonference on Antimicrobial Agentsand Ohemotherapy, Abstract I2 226, p. 137, New Orleans, 1986; Antibiótico AB-65 no J. Antibiotics, 28, 1975, 395-397; 2

Aetaplaninas in J. Antibiotios, 57. 1984 85-95; Aotinoidina^ in letrahedron lett.. Jl, 1979, 2861-2864; Aetinoidina A2 in J. Antibiotios 40, 1987 (165-172; Aridicinas in J. Antibiótica 58 1985 555-560 e 561-571: Avoparicina in J. Am. Ohem. Soc. 101. 1980, 2237-2239 e 102 1671-1684, 1980;

Cloropolisporinas em 5 artigos oonseoutivos, in J. Anti-biotios 40. 1987. 917-952, Eremomicina in Antibiotik.

Med, Biotekíinol. 32. 1987, 571-576; Kibbdelina in J. Anti-biotios. 59. 1986, 1386-1406; Antibiotioo LL-AM-374 na patente de invenção norte americana ns 3 803 306 de 9 de Abril de 1974; Antibiotic LL-AV-290 in Antimiorob. Agents and Chemotlier, 1968. 242-245. Manopeptinas in J. Antibiotios. 28, 1975, 503-507; Antibiotioo 0A-7653 in Agrio. Biol.

Chem.. £7, 1983, 499-506 e J. Org. Ohem. 53 1980, 471-477;

Orientioinas in Qbem. Abstr.,108. 1988 164466Í; Parvodi-cina in J. Antibiotios. 40. 1987, 970-990; Ristoeetinas in Obem. Soo. Ohem. Gommun.. 1979 906-908, e in Antibiotios Anpual 1957-1957, Eds. H. Welob & P. Marti-Ibanez, pp. 699-705, Medioal EnoyGlopedia, Ino. New York, 1957; Ristomycinas A e B in Antibiotiki 14. 1969 594-597; leiooplaninas (tei-oomicinas) in J. Antibiotios. 51. 1978, 170-177, e in J.

Am. Cbem. Soo., 106, 1984, 4891-4895 e 4895-4902, e Vancomi-cina in J. Am. Ohem, Soo.. 105, 1983, 6915-6922.

Artigos de revisão sobre antibióticos glioopeptidos enoontram-se também em Ann. Rev. Miorobiol. 38, 1984, 339-357? Sonics in Antibiotic Ohemistry, 5, 1980, 119-158; Nanos Berdy, ORO Handbook of antibiotic Oompnnds. Boca Raton, Plorida, CRC Press, Volume I, 1980, pp. 305-323.

Outras descriçOes resumidas dos antibióticos glioopeptidos do tipo vanoomicina estão referidos no Index of Antibiotios from Antinomyoetes, Hamao Umezawa, Editor-Cbefe, Univ. Park Press, State College, Pennsylvania, U.S.A., Volume I, 1967, pags. 568-570, 675, 733; e Univ. - 3 -

Park Press, Baltimore, U. S. A., Volume II 1978, págs. 105, 106, 167, 625, 1091, 1100.

Os antibióticos glioopeptidos do tipo vaneomicina são caraoterizados pela presença de uma aglícona heptapeptídica de fórmula geral

(I) na qual R·^ e Rg representam, cada um, um átomo de hidrogénio e/ou de cloro, R^ e R^ representam, cada um, um átomo de hidrogénio e/ou um grupo alquilo; X e Y representam 2 aminoácidos diferentes ou são partes do m esmo aminoácido; aos grupos hidroxilo benzílieos e/ou fenólicos podem ligar-se açúcares (básicos e neutros). A maior parte destes antibióticos podem também conter um ou mais átomos de cloro no componente ácido vancomioínieo e/ou no componente X, Y. A aglícona descrita anteriormente contém ácidos aromáticos reticulados semelhantes ao ácido vancomiGÍnico (fórmula geral II na qual R·^ e R2 representam, cada um, um átomo de hidro- - 4 - f

génio e/ou de cloro) e ao ácido aetinoidínieo (fórmula III) ·

(II) (III)

Gon*tddo, todos os dados disponíveis mostram que o antibiótico Decaplanin é claramente diferente de qualquer antibiótico glicopeptido" do "tipo vaneomicina descrito na literatura referida anteriormente. Além disso, a pesquisa no Chemical Abstract Service Online Literatura efecèuada com as chaves de pesquisa "peso molecular" e "fórmulas molecular" confirma também que o Decaplanin é um novo composto. A estrutura do. Decaplanin é a indicada na fórmula IVs - 5 - A’ .^r·' *-L- •ramnose

Os antibióticos glicopeptidos do tipo vancomicina são importantes em medicina oomo agentes antimiorobianos contra um largo espectro de bactérias Gram-positivas incluindo estirpes de Staphylococcus e Streptococcus sp. resistentes a penicilina, meticilina e oxacilina. 0 novo antibiótico da presente invenção ê activo contra um certo número de microrganismos pa-togénicos e portanto é útil em medicina humana e veterinária, Mais precisamente, o Decaplanin pode ser utilizado como um fármaco terapêutico para o tratamento de doenças infecciosas provocadas por bactérias Gram-positivas, tais como, por exemplo, Ataphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Streptococcus faeoalis, Diplococcus pneumoniae, Bacteroides fragilis, Clostridium difficile, Corynebacterium sp., Acti-nobacter sp. e Busobacterium sp. - 6 -

0 Decaplanin pode também ser utilizado como um aditivo alimentar para criação e gado como um promotor das oaraoterísticas de crescimento.

Um outro objeoto da presente invenção é proporcionar um processo para a produção do novo antibiótico Decaplanin a partir da cultura na Ya86,36910, dos seus mutantes e variantes. 0 referido processo compreende desenvolver-se a cultura na Y-86,36910, com os seus variantes e mutantes, sob oondiçSes aeróbicas, a uma temperatura compreendida entre 18°0 e 40°C, no seio de um meio nutritivo aquoso que contém fontes de carbono, fontes de azoto, juntamente com sais orgânicos e minerais essencialmente nutritivos, a um pH compreendido entre 5,5 e 8,5, até o meio apresentar uma aotividade antibiótica substancial, e isolar-se e purifioar-se o referido antibiótico a partir do caldo de cultura.

De acordo com a presente invenção proporciona-se também um processo para o isolamento da cultura na Y-86,36910, a partir do solo utilizando um meio nutritivo, a um pH de 6,5 a 8,5, por um processo convencional. 0 meio nutritivo utilizado para o isolamento do microrganismo a partir do solo é constituido por fontes de carbono e de azoto, sais nutritivos inorgânicos e agentes de solidifioação. As fontes de carbono podem ser glucose, amido, dextrina, glicerol, sacarose e melaços. As fontes de azoto podem ser peptona, extracto de levedura, extractos de carne de vaca, extracto de malte, caseína ou aminoácidos, tais como arginina ou aspara-gina. Osagentes de solifioação pode ser, por exemplo, agar. Os sais nutritivos inorgânicos podem ser, por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio, oálcio, fósforo ou de enxofre. Também se pode incorporar no meio como sais de oligoelementos sais de ferro, cobre, manganês, zinco e de - 7 -

cobalto 0 microrganismo da presente invenção é um organismo filamentoso Gram-positivo, "non-acid-fast", que forma mioélios aéreos a partir de um substrato de micé-lio ramificado. 0 substrato de micélio bem desenvolvido pode apresentar vários graus de fragmentação sem deslocamento Mfálico. Em frascos de agitação e fermentadores observa-se normalmente fragmentação. 0 micélio aéreo produzido é rectilíneo ou ligeár amente curvo e apresenta esporos com a forma de barra,de paredes lisas. Os esporos tem uma dimensão de 0,2-0,5 x 1-3 >um. Ás cadeias de esporos são normalmente muito longas com mais de 50 esporos por cadeia, mas estão também presentes algumas cadeias curtas com 10 esporos ou menos. Observam-se também estruturas semelhantes e esporângios. Estas estruturas semelhantes a esporângio, análogas às estruturas oonidiálicas observadas na Aotinoplanaoeae, são rodeadas por paredes bem definidas mas não contém esporos. Apesar de manipulações e experimentações extensiva não se observou o desenvolvimento ou libertação de esporos a partir destas estruturas semelhantes e esporângios. Elas germinam directamente, produzindo um ou mais tubos germes. Descrevem-se também característi-cas morfológicas semelhantes para o género Kibdelospo-rangiup em Int, J. System. Bacterol.. 56. 1986, 47-54. A superfície dos corpos semelhantes a esporângios observada em ISP (International Streptomyces Projeet) meios 2, 3, 4, 5 e 7 e em agar nutritivo são ásperas e rugosas e tem tamanhos compreendidos entre 2 e 16 ^um.

Em certos meios as culturas de acti-nomiceta NS Y-86,36910 produzem cristais Garacterísticos em agar. As características de cultura do microrganismo em vários meios de agar desorevem-se a seguir; - 8 -

Agar de Extracto de levedura/Extracto de malte (Meio 2 ISP) Crescimento : bom, seco. rugosa mieélio aéreo : moderado, pulvurulento, bran co amarelado Reverso í amarelo-oastanho Pigmento solúvel í verde acastanhado Agar de farinha de aveia (Meio 3 ISP) Crescimento ; moderado, elevado no centro, seco Mieélio Aéreo i moderado, pulvurulento, branco amarelado Reverso : amarelo pálido Pigmento solúvel : nenhum

Agar de sais inorgânicos/amido (Meio 4 ISP)

Crescimento í moderado, elevado no centro, seco Mieélio Aéreo s fraeo, pulvurulento, branco amarelado Reverso s amarelo pálido Pigmento solúvel : nenhum Agar de Glicerol -(Meio 5 ISP) - asparagina w

Crescimento : moderado, elevado , seco Micélio Aéreo : fraco, pulvurulento, branco amarelado Reverso : amarelo Pigmento solúvel s nenhum Agar de Peptona -(Meio 6 ISP) extracto de levedura - ferro Crescimento : bom, elevado, húmido Micélio Aéreo s nenhum Reverso : amarelo pálido Pigmento solúvel í nenhum Agar de tirosina (Meio 7 ISP) Crescimento ϊ bom, elevado, seco Micélio Aéreo s moderado, pulvurulento, branoo amarelado Reverso : amarelo pálido Pigmento solúvel ; nenhum Agar de sacarose (Agar de Czapek) - nitrato Crescimento : fraco, com relevo, seco Micélio Aéreo : nenhum Reverso : amarelo pálido Pigmento solúvel : nenhum - 10 - 8

Agar de peptona - extracto de carne de vaca (Agar nutritivo)

Crescimento ϊ abundante, elevado Micélio Aéreo : muito escasso, pulvurulento branco amarelado Reverso : amarelo pálido Pigmento solúvel : nenhum

Reverso da colónia: Não são produzidos pigmentos distintivos em qualquer dos meios utilizados, 0 micélio do subs-tracto não apresenta resposta à alteração de pH.

Pigmento solúvel : 0 pigmento verde-acastanhado observado no meio 2 ISP não ê um indicador de pH. 0 intervalo de crescimento óptimo para o organismo da presente invenção está compreendido entre 25°C e 35°C. com um fraco crescimento à temperatura de 4°0 e ausência de crescimento a 45°C. Este microrganismo liquefa* a gelatina em meio de glucose-peptona-gelatina, hidroliza o amido em agar de amido-sais inorgânicos e reduz o nitrato em caldo de nitrato. Não se observa a produção cfe melanina em agar de tirosina. agar de peptona-extracto de levedura--ferro ou caldo de triptona-extracto de levedura. Este mi-croorganismo não apresenta actividade celulósica, não coagula o leite, apresenta uma reacção negativa à tirosinase e uma produção negativa de ácido sulfídrico e apenas pep-toniza ligeiramente o leite.

Em agar de solução de Czapek o desenvolvimento é bom com formação de colónias brancas planas e lisas. 11 - •f

WlrtVAtwK·.·*»**' Ο esquema de assimilação de carbono deste microorganismo é o seguinte (em meio de Pridham--Gottlieb):

Positivo í D-glucose, L-arabinose, D-xilose, M-inositol, D-manitol, D-fructose, galactose/ salicina, maltose, celubiose, manose, lactose e glutama-to de sódio.

Duvidosos Sacarosil, rafinose.

Negativo : Ramnose, celulose e dulcitol. A cultura de actinomiceta ns Y--86,36910 é inibida pela estreptomicina a concentrações superiores a 0,2 mg/ml, pode tolerar cloreto de sódio a concentrações compreendidas entre 5 e 7% e tem um intervalo de tolerância de pH compreendido entre 5,5 e 10,5. A análise das paredes celulares da cultura de actinomiceta ns γ-86,36910 mostra a presença de paredes de células do tipo IV que contém ácido meso--diamino-pimélico, ácido D-glucâmico, DL-alanina, ácido murámico, N-acetil-D-glucosamina, D-galactose, e arabi-nose e um esquema de açúcar celular completo do tipo A de D-galactose e arabinose. Não estão presentes ácidos mi-cólicos. A cultura de actinomiceta NS HIL Y-86,36910 apresenta propriedades quimiotaxónicas, características culturais e morfologia que são consistentes com a sua atribuição ao género Kibdelosporangium. Uma comparação diferenciadora com as 3 estirpes registadas das espécies de Kibdelosporangium, viz. Kibdelosporangium aridum. ATCC 39323 (Int. J. Svstemic Bacterioloqy, 36. 1986, 47 - 54), K. aridum subsp, larqum ATCC 39922 J. Antibiotics, 39, 1986, 1386 - 1394) e K. philippinense NRRL 18198 (Int. J. Svstemic Bacterioloqy. 38, 1988, 282--286), é apresentado a seguir. 12 - * ϊ

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A informação publicada acerca das características culturais e fisiológicas dos microrganismos conhecidos, mostra claras diferenças quando comparada com o microrganismo da presente invenção. Além disso, quando se fermenta a cultura de actinomiceta n2 Y-86,36910, este produz o novo antibiótico glicopeptido Decaplanin.

Portanto, o micorganismo da presente invenção é proposto como uma nova espécie de Kibdelosporan-gium e foi denominado Kibdelosporangium deccaensis sp.nov,

Como é compreensível para os especialistas na matéria, a presente invenção não se limita ao organismo particular especificado anteriormente mas inclui todos os mutantes e varianfees espontâneos e artifi-oialmente derivados do referido microrganismo que sejam capazes de produzir o novo antibiótico glicopeptido Deca-planin.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se um processo para a produção de um novo antibiótico, Decaplanin, compreendendo cultivar-se uma cultura de actinomiceta n2 Y-86,36910 mediante fermentação de preferência a um pH compreendido entre 6.0 e 8.0 e a uma temperatura compreendida entre 18° e 40°C, sob condições aeróbicas, no seio de um meio nutritivo que contém fontes de carbono e de azoto, sais inorgânicos nutritivos e oligoelementos e isolar-se os compostos a partir do caldo de cultura mediante um processo convencnonal tal como aqui se descreve.

As fontes de carbono utilizadas no meio nutritivo para a produção dos novos antibióticos podem ser, por exemplo, glucose, amido, dextrina, glicerol, sacarose, melaços ou petróleo. As fontes de azoto utilizadas no meio nutritivo para a produção dos novos antibióticos podem ser, por exemplo, farinha de soja, extraoto de - 15 - :*^**53ΐΓτ*

carne de vaca, extracto de malte, solução de infusão de milho, peptona ou caseína. Os sais inorgânicos/sais minerais nutritivos utilizados num meio nutriente para a produção do novo antibiótico, podem ser, por exemplo, cloreto de sódio, sulfato de magnósio, nitrato de potássio, sulfato de amónio ou c arbonato de cálcio. Gomo oligoelementos podem utilizar--se sais de ferro, manganês, cobre, zinco, cobalto ou de outros metais pesados.

Em particular, a cultura de actinomi-ceta ns X-86,36910 é cultivada à temperatura de 29°c (+ 1°0) a pH 6,5. A fermentação é de preferência interrompida após 66 a 68 horas quando se obtem o máximo do rendimento do composto. A fermentação pode, de preferência, ser uma fermentação submersa. 0 processo de fermentação e formação do novo complexo antibiótico pode ser seguido através da activi-dade antibaoteriana do fluído da cultura e do mioélio con-tra Staphylocous aureus 209 P e Microooocus luteus mediante o método de difusão de placa de agar já conhecido.

Se necessário, utiliza-se um agente (R) anti-espuma tal como Desmophenv ' (um poliéter linear à base de óxido de propileno - Bayer AG, Leverhusen, RPA) num meio nutritivo durante a fermentação da cultura. 0 Decaplaáiin pode ser obtido a partir do caldo de cultura mediante adsorção directa em adsorventes apropriados, Por exemplo, o filtrado da cultura que contém o composto de acordo com a presente invenção pode ser adsor-vido em carvão aotivado, Diaion^ HP 20 (resina adsorvente de alta porosidade à base de copolímero de poliéstireno--divinilbenzeno - Mitsubishi Chemical Industries, Japão) ou Amberlite^ XAD (resina adsorvente porosa à base de poliéstireno ou éster do ácido acrílico - Rohm & Haas Co., U,S.A.). 0 adsorvente preferido é Diaion^ HR 20. 0 composto \ de acordo com a presente invenção pode ser eluído a partir - 16 - dos adsorventes utilizando fases mdveis apropriadas tais como metanol, aeetonitrilo ou acetona, utilizados quer isoladamente quer em associação uns com os outros ou com água e os eluídos são, de preferência, evaporados até à secura. Os elementos preferidos são o metanol e a acetona aquosos. 0 Decaplanin pode também ser isolado do filtrado da cultura mediante cromatografia de permuta idnica. Uma resina apropriada seria uma resina de permuta catidnioa do copolímero fracamente ácido do ácido meti-lacrílico e do divinilbenzeno, de um tipo tal como Amber-lite^ IR0-50 (Rohm & Haas Oo. U.S.A.). leste procedimento submete-se o filtrado da cultura a uma cromatografia em coluna utilizando uma resina de permuta catidnioa Amber-lite^^ IRC-50 (H+). 0 composto de acordo com a presente invenção é primeiro adsorvida no permutador idnico e depois elufdo mediante utilização de fases mdveis apropriadas tais como soluçães aquosas ou metandlicas de ácido clorídrico diluído; de preferência utiliza-se uma solução de ácido clorídrico 0,1 I em agua. Os eluídos activos assim obtidos são reunidos e concentrados. A Amberlite^ IRA-68 01”. uma resina de permuta anidnioa do tipo fracamente básico, pode ser também utilizada para descorar os eluídos activos.

Os eluídos activos concentrados referidos anteriormente, que contém Decaplanin, podem ser depois purificados durante um certo número de dias. Por exemplo, processos de readsorção e eluição com carvão activado, Amberlite^ XAD-4 e 7, Diaion^ HP-20. filtração de gel com Sephadex^ IH-20 e geles das séries G· (geles de porosidade definida sobre agarose -- Pharmacia Pine Chemicals SB, Suécia) e seus equivalentes, e filtração por gel de permuta idnica com geles Sephadex^ ' DEAE (dietilaminoetilo) podem ser convenientemente combinados para maior purificação. Além disso, pode utilizar-se - 17 - <r ϊ

ii'L Λ oromatografia em camada fina, cromatografia líquida de média pressão e de alta pressão utilizando adsorventes apropriados tais como gel de sílica, alumina e gel de sílica modificada C^g com sistemas dissolventes apropriados. Além disso, é apropriado para este fim a oromatografia em contra-corrente com um sistema dissolvente particular.

Os métodos de purificação preferidos incluem adsorção e eluição repetidas utilizando Diaion^ HP-20 seguido de oromatografia líquida do meio em gel de sílica modificado O^g eluindo oom metanol/ou acetonitrile /solução salinas aquosas. 0 Decaplanin pode ser transformado nos seus sais farmacologicamente aceitáveis por exemplo oom ácidos inorgânicos e orgânicos tais oomo ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido benzdico ou com bases, por exemplo, com aminas, tais como trietilamina por um processo convencional.

As propriedades físico-químicas por espectrais:do:Decaplanin apresentam-se no Quadro I a seguir: 18

Quadro I Propriedades físico-químicas e espectrais do Decaplanin. Natureza : pó branco com coloração ligeiramente cor de rosa ÍCipo químico : glicopeptido básico da classe da vanco-tnicina

Solubilidade : Água P.l > 240°C (decompressão)

: -87,6° (0 0,5, H20)

Oromatografia de camada fina (TLC)^ : 0,5 (Isopropanol: 2N a 70:30: placa de gel de sílica artigo // 5554 de E. Merck.

Oromatografia de Alta Pressão (HPLO)E^ : 3,5 mins (coluna ODS-Hypersil (10>u) de 4 x 25 mm, eluente GH^ON a 15$ em tampão de fosfato de sódio aquoso, pH 6,0j Análise UY 220 nm, velocidade do papel 10 mm min”^". Caudal 1 ml/minuto (ligura 1 dos desenhos em anexo). Pórmula molecular ®72^86®"^9^28 con^^-rBia<ia Por espectro-metria de massa 1ΆΒ de alta resolução matriz de ácido trifluoroaeático álcool 3-nitrobenzílico medida: m/z 1560. 536 calculado como ião M+H+ m/z 1560,535 para 12^ 1^ 35^14^16^ - 19 -

; 224, 280 (302 oom álcali) nm. (Figura 2 dos desenhos em anexo). : 3300 (largo), 2920 (2). 1650 (s) cm"1 (Figura 3 dos desenhos em anexo). : como se mostra na Figura 4 dos desenhos em anexo. πν χ (Ηοθ) A max ν 2 IV (KBr) ^Ή-ΕΜΝ (270 ΜΗζ, dg-DMSO)'

150-RMN (100 ΜΗζ, $ Figura 5. Tabela A

H2°/d6-DMSO 9:1, 343 -K)

Restos de Amino- ; ácido aspártico, H-metil-leucina ácidos obtidos por 1:1. ádido actinoidinico e um monodecloro hidrólise ácida análogo do ácido vancomicinico completa Açúcares presentes : 3 -D-gluoose, d\ -L-4-epivancosa- mina e CÁ -I-ramnose

Quadro A: l"?

Desvios Químicos dos Sinais de C-RMH de Decaplanin (ppm em relação a TMS). 17,97 63,85 18,79 67,56 19,76 70,15 22,97 70,87 23,75 71,97 25,51 72,33 34,71 72,36 39,80 73-46 38,19 75,95 107,92 137,06 109,69 138,95 119,10 139,61 119,56 151,20 122,72 153,69 123,11 155,86 124.06 156,47 126.07 157,03 126,96 157,59 20 la C“

Xiarosra.ustnsavLiísK^

'«λ J 42,00 76,72 127,54 157,92 53,63 77,06 127,95 168,28 55,80 77,43 129,16 170,58 56,09 82,14 129,53 171,75 57,97 93,76 130,13 172,33 60,24 102,92 131,01 172,70 60,73 103,34 134,51 174,86 62,53 104,33 134,71 177,88 63,71 105,15 135,60 178,47 A estrutura do Decaplanin tal como elucidada pela análise espeotroscópica completa do composto e dos seus produtos de degradação é representada pela lórmula IV.

Actividade biológica do Decaplanin 0 Decaplanin apresenta actividade contra um largo espectro de bactérias Gram-positivas incluindo enterocoeci e isolados clínicos que são resistentes aos antibióticos vulgarmente utilizados tais como, penicilina, metioilina, oxaeilina, outros antibióticos $-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglioosidos e eritromicina. A concentração inibidora mínima (OIM) foi determinada para vários microrganismos e os resultados apresentam-se no Quadro II a seguir: 21 -

Quadro II CIM de Decaplanin - Aig/ml

Organismo de leste Eecaplanin S$aph.ylococcus aureus 209 P 0,78 - 1,25 S. aureus 20424 Mac^ 1,25 - 2,5 S. aureus 256 E 0,39 - 0,78 S. aureus 3066 Meth? 1,25 - 2,5 S. aureus 6971 E 0,39 - 0,78 S. aureus R85 Tet^ 0,78 - 1,25 S. aureus 705 0,39 - 0,78 S. aureus R85/si EmR 0,78 - 1,25 S. aureus E 710 Meti? 0,78 - 1,25 S. aureus 712 MethR 1,25 - 2,5 S. aureus 789 Meth.R 0,78 - 1,25 S» aureus 011UC5 Mac®· 0,78 - 1,25 S. aureus SG 511 0,78 - 1,25 S aureus 6538P Me th11 0,78 - 1,25 Staphyloooccus epidermidis 178 0,78 - 1,56 S. epidermidis 32965 0,78 - 1,56 Streptocoocus faecalis 2,5 - 3,2 Str. faecalis 02D0DU1 MaeS 1,25 - 2,5 Str. faecalis ΌΒ8ΐ3 0,78 - 1,25 Str. faeealis 756 0,78 - 1,25 Str. faecalis 23241 1,25 - 2,5 Str, faecalis 21777 2,5 - • 3,2 Str. pyogenes 308 0,098 - 22 -

Str. pyogenes A 77 0,098 Str. bovis 0,78 - 3,2 Str. viridans 0,78 - 3,2 Str. pneumoniae 0,12 - 0,39 Str. haemolyticus 1,0 - 4,0 Enterocoocus faeoalis ΑΪ00 29212 1,56 - 3,2 Ent. durans 58 0,78 - 1,25 Ent. hirae 55 1,56 - 2,5 Ent. faeoium D 59 2,5 - 3,2 Bacillus sp. 1,56 - 3,2 Olostridium dificile 0,39 - 1,56 Clostridium perfringens 0,12 - 0,39 Corynebacterium jekeium 0,39 - 1,25 Listeria monooytogenes 1,56 - 3,2 Peptostreptocooous sp. 0,12 - 0,39 Propionibaoterium acnes 0,12 - 0,78

Mao = Macrolido;

Meth. = Meticilina Tet = Tetraoiolina;

Em = Eritromicina

Estudos de protecção antibaoteriana in vivo 0 decaplanin apresentou uma boa actividade quando ensaiado nos sistemas in vivo nos ratos de laboratório infectados experimentalmente oom Staphyloooccus aureus E 710 (methici-lina resistente) Os resultados apresentam-se no Quadro III. - 23 -

Quadro III : Actividade de Decaplanin e Vancomici- na contra infeoçSes experimentais oom ratos Swiss.

Inóculo : 5 x 10^ CFU/rato para S. aureus E 71o (MethR) Dosagem : mg/kg x 3 (subcutânea)

Composto vs. S. aureus E 710 - mg/kg DB50 ra90 Decaplanin 14,26 28,23 Vancomioina 18,94 32,01 Estudoè de toxicidade

Determinou-se a toxicidade aguda do composto em animais de laboratório.

Mesmo para doses de 1000 mg/kg e 2000 mg/kg, acima das doses mais elevadas, injectada por via sub-cutânea em ratos Swiss não se observou toxicidade aguda. Além disso, descobriu-se inesperadamente que enquanto a vanoomicina para as mesmas doses provoca a necrose do tecido no local da injecção, com Decaplanin não se observa nada de anormal.

Os estudos de toxicidade aguda efectua dos injectando por via endovenosa 0 composto em ratos Wistar indicaram que a DL^Q é superior a 2 500 mg/kg (i.v.).

Os estudos de tcsdcidade aguda efectua-dos injectando por via endovenosa 0 composto em ratos brancos Swiss indicaram que a DL^q é maior que 3 000 mg/kg (i.v.). - 24 -

I

7 0 exame microscópico àa dissecação dos animais ao fim de um período de acompanhamento de 14 di4s não revelou alteraçães morfológicas em qualquer estudo.

Estes resultados indicam que o novo antibiótico da presente invenção, nomeaáamente Decaplanin, é muito bem tolerado e pode ser administrado por via oral, intramuscular ou endovenosa.

Assim, a presente diz também respeito aos produtos medicinais para o tratamento de infecçSes microbianas, que contém o composto Decaplanin. 0 composto de acordo com a presente invenção pode também ser utilizado em associação com outras substâncias activas, por exemplo, oom uma série de penicilinas, oefalosporinas, aminoglicosidos ou quinolo-nas. 0 Decaplanin e os seus sais de adição de ácido tolerados fisiologicamente podem ser administrados, por exemplo, por via oral, intramuscular ou endovenosa. Os produtos medicinais que contém Decaplanin como substância activa podem ser preparados misturando o referido composto eom um ou mais veículos tolerados farmacolo-gicamente ou diluentes tais como, por exemplo, cargas, emul-sionantes, lubrificantes, agentes para mascarar aromas, substâncias corantes ou tampão, e convertidos em uma forma farmacêutica apropriada tal como, por exemplo, comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, ou uma suspensão ou solução apropriada para administração parentérica. São exemplos de veículos ou diluentes o tragacanto. lactose, talco, agar-agar, poliglicois, etanol e água. São apropriados e preferidos para administração parentérica as suspensSes ou soluçães em água. 35 também possível administrar substâncias activas como tais, sem - 25 - veículos ou diluentes, sola uma forma apropriada, por exemplo, em cápsulas.

As doses apropriadas do composto de acordo com a presente invenção ou dos seus sais de adição de ácido fisiologicamente tolerados estão compreendidas entre cerca de 0,4 e 20 g/dia, de preferênoia 0,5 e 4 g/ /dia, para um adulto com peso de cerca de 60 kg. 2 possível administrar doses únicas, ou, em geral, doses múltiplas, em que a dose única contém uma quantidade de substâncias activa compreendida entre cerca de 50 e 4 000 mg, de preferência entre eerca de 500 e 2 000 mg.

Os exemplos seguintes são ilustrativos mas não limitativos do âmbito da presente invenção:

Exemplo 1

Isolamento da cultura de actinomioeta nQ Y-86,56910 do solo a) Preparação do isolado de meio nutritivo

Meio 1: Glucose 5 · · 1,0 g Glioerol • · · 1,0 g L-Arginina • · · 0,5 g k2hpo4 • · · 0,3 g MgS04.7H20 • · · 0,2 g EaCl • · t 0,3 g Extraoto de levedura ... 2,0 g I?e2(S04)^ • » · 10.0 mg CuS04,5H20 • · · 1,0 mg - 26 -

Meio 2 s

Meio 3

ZnS04.7H20 • · · 1,0 mg MnS04.7H20 • · · 1,0 mg Agar • · · 15,0 g Âgua destilada • · e 1 litro pH • · · 6,5 Glucose • · · 2,0 g L-Asparagina • · · 1,0 g K2HP°4 • · · 0,5 g MgS04.7H20 • · · 0.5 g Extracto de soja / * · 200 ml Agar • · · 15,0 g Água destilada • · · 800 ml pH • · · 8,0 Amido * · · 10,0 g Caseina é · « 0.3 g KNO O • · · 2,0 g NaCl • · · 2,0 g K2HP04 • · * 2,0 g MgS04.7H20 • · · 0,05 g CoOOg • · · 0,02 g FeS04 • · · 0,01 g Agar • · * 15,0 g Água destilada • · · 1 litro pH • · · 7, 2 - 7 de 121°« 0 meio foi esterilizado à temperatura durante 30 minutos. 27

b) Preparação da suspensão de solo

Fez-se uma suspensão de 1 g de solo em água destilada, agitando vigorosamente. Deixou-se decantar o solo e utilizou-se o líquido sobrenadante para inocular cada um dos meios de isolamento referidos ante-riormente. c) Inoculação do meio de isolamento

Pratos de Petri contendo 50 ml de um dos meios nutritivos de isolamento referidos anteriormente cada um com 1 ml de suspensão de solo. d) Isolamento da cultura de aotinomiceta ]P Y - 86, 36910

Incubando à temperatura de 30°C durante 2 semanas o prato de Petri incoulado e isola-se a cultura de aotinomiceta D2 Y-86,36910 a partir dos microrganismos em crescimento.

Exemplo 2

Desenvolvimento de cultura de anti-nomiceta nQ Y-86, 36910 para a preparação de Decaplanin mediante fermentação.

Mantem-se a cultura de aotinomiceta P Y - 86,36910 em agar composição: de levedura- -malte com a seguinte Extraoto de malte • · · 10,0 g Extracto de levedura « · · 4,0 g Glucose • · · 4,0 g Agar • · · 15,0 g Agua destilada • · · 1 litro pH • · ♦ - 28 - 7,0 1 κ*.

Distribuiu-se o meio por tubos de ensaio e esteriliza-se à temperatura de 121°0 durante 30 minutos. Para preparar lâminas de agar oom a forma de cunha arrefeee-se os tubos numa posição inclinada. Cada cunha de agar é inoculada com a cultura e incubada à temperatura de 28°C durante 10 a 15 dias, tempo ao fim do qual se observa um bom crescimento e formação de esporos. Utiliza-se uma suspensão em água destilada dos esporos do micélio vegetativo proveniente duma cunha de agar para inocular 5 balães de Erlenmeyer de 500 ml contendo cada um 10o ml de meio de cultura de sementeira.

Composição por meio de cultura de sementeira:

Glucose • · · 15,0 g Parinha de soja · · · 15,0 g Solução de de milho infusão • · · 5,0 g CaC03 • · · 2,0 g UaCl é · · 5,0 g Água destilada ... 1 litro pH • · · 6,5

Distribuiu-se este meio em porçães de 100 ml por balães de Elenmeyer de 500 ml â esteriliza-se durante 30 minutos à temperatura de 121°C. Arrefecem-se os balães, inocula-se com cultura e agita-se à temperatura de 29 C (+1 C) num agitador rotativo com um curso de 38 mm, a 240 rpm durante 72 horas. 0 produto desenvolvido é utilizado para inocular dois recipientes de fermentação de vidro de 15 litros, contendo cada um 10 litros com meio de cultura de sementeira a 8 a 10# (em volume), para a preparação de uma segunda fase de cultura de sementeira. A fermentação é efectuada à temperatura de 29°C (+ Io C), agitando a 180-200 rpm e arejando a 6-7 litros/minutos - 29 -

durante 48 horas. A segunda fase da cultura de sementeiras Toem desenvolvida obtida é utilizada para inoculação do meio de produção.

Composição do meio de produção

Dextrina • · · 20,0 g Pior de farinha de soja • · · 10,0 g Extracto de levedura • · · 1,0 g PeS0^.7H20 • · · 0,1 g Água destilada • · · 1 litro pH • ♦ · 7,0

Adiciona-se Desmophen^ a 0,025$ ao conteúdo do recipiente de fermentação como agente anti--espuma.

Coloca-se 280 litros deste meio num reci piente de fermen$ação de 390 litros e esteriliza-se aquecendo indirectamente e direotamente com vapor à temperatura de 121°C durante 28 minutos. Arrefece-se o recipiente de fermentação?' e inocula-se com a segunda fase de cultura de sementeira (8$ em volume). A fermentação é efectuada à temperatura de 29°C (+ Io C), agitando a 100 - 120 rpm, durante 66 a 68 horas. 0 caudal de arejamento é de 170 litros por minuto. Quando termina a fermentação, apds 66-68 heras, o diâmetro da zona de inibição de Staphylocoocus auereus 209 P é de 16 mmm quando o filtrado da cultura é ensaiado pelo método da cavidade de agar (6 mm de diâmetro), estando o pH do líquido de cultura compreendido entre 6,5 e 7,0. 0 volume do enchimento celular ê de eerca de 20$. - 30 -

* X

Ο caldo da cultura colhido que contém o complexo antibiótico ê centrifugado para remover o micé-lio, e o líquido de cultura ê depois processado do modo desorito no Exemplo 4.

Exemplo 3

Desenvolvimento da cultura de actinomi-oeta nS Y - 86, 36910 para a preparação de Decaplanin por fermentação. 0 prooesso é o descrito no Exemplo 2 com as seguintes diferenças:

Composição do meio de produção:

Amido • 1 · 20,0 g Parinha de soja • · · 10,0 g CaC05 • · · 3,0 g laCl • · · 5,0 g PeS04.7H20 • · · 0,1 g Agua destilada • · · 1 litro pH • · · 7,0

Introduz-se 100 litros do meio referido anteriormente em Um recipiente de fermentação de 150 litros e esterilizou-se directamente e indirectamente com vapor à temperatura de 121°C durante 28 minutos. Arrefece-se o recipiente de fermentação e inocula-se com uma segunda fase de cultura de sementeira (8fo em volume), A fermertaçio 'é efectuada à temperatura de 20°C (+ Io C) agitando a 100 -- 120 rpm, com um caudal de arejamento de 70 a 90 litros por minuto, Após terminada a fermentação, ao fim de 66 a 68 horas, o pH d o Galdo de cultura é de 7,0 e o diâmetro • da zona de inibição do Staphylococcus aureus 209 P é de - 31 -

17 mm quando se ensais o filtrado da oultura pelo.Jiétodo da oavidade de agar (diâmetro de 6 mm). 0 volume do enchimento celular é de 20$. 0 caldo da cultura é processado do modo descrito no Exemplo 4.

Exemplo 4

Isolamento e purificação de DecaplaniE

Separa-se o micélio por centrifugação aproximadamente 645 litros do caldo colhido tal como se obteve nos Exemplos 2 e 3. 0 filtrado do caldo resultante (pH 6,5 - 7,0) é passado através de colunas com um total de 25 litros de Diaion^ HP-20. Lavam-se as colunas cuidadosamente com um total de 500 litros de água desmi-nerálizada e depois com 100 litros de uma mistura a 30$ de metanol em água. lluiu-se o Decaplanin das colunas com um total de 200 litros de metanol a 70$ em água, 100 litros de metanol e 200 litros de acetona a 5°$ em água e determina-se a aotividade biológica ensaiando os eluídos contra Staphyloooccus aureus 209, P, S, aureus 20240 e Micrococcus luteus. Reunem-se os eluídos activos e depois concentram-se sob pressão reduzida para eliminar os dissolventes orgânicos.

Descora-se a solução aquosa resultante (180 litros) contendo Decaplanin fazendo-se passar através duma coluna de 5 litros de Amberlite^^ IRA 68 (Cl") ajustada com água desmineralizada. Lava-se os efluentes e as lavagens de água e passam-se através duma coluna de 10 litros de Diaion^ HP-20 em água. Lava-se a coluna com 40 litros de água dismeneralizada até as lavagens de água estarem isentas de iães cloreto. Elui-se a seguir a coluna com 70 litros de acetona a 50$ em água e concentra-se os eluídos activos sob vazio para remover a acetona e a maior parte da água. Liofiliza-se os 700 ml de resultantes de solução aquosa para se obter 15 g de Decaplanin - 32 - 4

.«tf- eemi-puro sob a forma de um. pd ligeiramente amarelado. 0 Decaplanin semi-puro assim obtido é submetido a oromatografia líquida de média pressão (MPLC) numa ooluna de vidro Labomatic^ de 5,5 x 53 cm cheia oom gel de sílica dimetilootadecil-sililada (RP 18). A coluna foi inioialmente ajustada com solução 0,1 M de acetato de amdnio em água desmineralizada e depois eluída com misturas de OH^OU com a solução aquosa de acetato de amónio, sendo a quantidade de CH^OI de 2$ (1,2 litros), 4$ (5,6 litros), 6$ (2,4 litros), 10$ (2,4 litros) e 15$ (2,8 litros). Manteve-se o caudal em 30 ml/minuto e os eluí· dos recolhidos em fraeçães de 500 ml foram analizados por UV a 220 nm bem como pelo ensaio biológico microbiano. 0 Decaplanin eluiu da coluna com OH^OI a 2$ e 4$ em solução de acetato de amdnio aquoso, Reuniram-se os eluídos e concentraram-se sob pressão reduzida para eliminar o oh5cr.

Pez-se passar a solução aquosa resultante de Decaplanin através de uma coluna de 600 ml de Diaionv ' HP-20equilibrada em água destilada duas vezes. Lavou-se a coluna com 2 litros de água destilada duas vezes e depois eluiu-se com 4 litros de acetona a 50$ em água. Ooncentra-se os eluídos activos sob pressão reduzida para eliminar a acetona e depois liofilizou-se para se obter 8,4$ de Decaplanin sob a forma de um pd branco com uma coloração ligeiramente cor-de-rosa.

Exemplo 5

Preparação de sais de Eecaplanin; e sua reconversão na base livre. 0 Decaplanin, que é um composto básico, pode ser convertido nos seus sais de adição de ácido mediante reacção com ácidos fortes, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfárico, ácido trifluoroaoético. ^ 33 -

Claims (1)

1 i c- A 100 mg de Decaplanin (base livre) dissolvido em 10 ml de água destilada adiciona-se 64 ^1 de ácido clorídrico IN à temperatura de 0°C seguido de agitação à temperatura ambiente durante 3 horas, liofilizan-do-se a seguir para se obter 95 mg do sal cloridrato. A análise de cloro deste sal cloridrato de Decaplanin revela ser um monocloridrato. Os sais de Decaplanin podem ser reconvertidos a base livre mediante tratamento com resinas de permuta aniónica. Trata-se 200 mg do sal Decaplanin. CFgGOOH em 200 ml de água destilada com 5 g de Dowex 12 x (0Ac~) em água, agitando duraste 30 minutos à temperatura ambiente seguido de filtração. Liofiliza-se o filtrado para se obter 140 mg de Decaplanin:v sob a forma de base livre. REIVINDICAÇÕES - IS - Processo para a preparação de um novo antibiótico glicopeptido (Decaplanin) com a fórmula 34 - » i *-L-: ramnose

csracterizado por se cultivar em actinomicetes Y-86,36910 (DSM 4763) sob condições aerébicas, no seio de um meio nutritivo aquoso que contém fontes de carbono, fontes de azoto, fontes de nutritivos inorgânicos e sais minerais. - 2& - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cultura ser efectuada a uma temperatura compreendida entre 18° e 40°0. - 35 - 3« - Processo de acordo com a reivindica·* ção 1 ou 2, caracterizado por a cultura ser efectuada a um pH compreendido entre 5,5 e 8,5. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caractérizado por a cultura ser efectuada à temperatura de 29°C (+ 1° C) e a um pH de cerca de 6,5. _5s_ Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a cultura ser efectuada durante mais de 66 horas. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caractérizado por a cultura ser efectuada em condições de cultura submersa. - 7a - processo para a preparação de composições farmacêuticas com acção antibiótica# caracterizado por transformar-se conjuntamente um composto quando prepa- — 36 — * t I rado de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6# com adjuvantes e/ou veículos convencionais# numa forma apropriada para administração. A requerente reivindica a prioridade do pedido apresentado como pedido de Patente Europeia em 27 de Agosto de 1988# sob o ns 88114022.2. Lisboa# 24 de Agosto de 1989 ® ©A »3?MS® A©B BT© 13©MA&

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