DE102021134081A1

DE102021134081A1 - Rekombinanter mikroorganismus in welchen das glutarsäure-transporter-gen eingeführt wurde und verfahren zur herstellung von glutarsäure unter verwendung desselben

Info

Publication number: DE102021134081A1
Application number: DE102021134081.0A
Authority: DE
Inventors: Sang Yup Lee; Tae Hee Han
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2022-06-30
Also published as: KR20220091889A; US20220205000A1; US11965200B2; CN114736839A; KR102661294B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Mikroorganismus, dem eine erhöhte Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure verliehen wurde, indem ein Gen, das für ein Polypeptid mit Glutarsäure-Transporteraktivität kodiert, in einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure eingeführt wurde, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Glutarsäure unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Glutarsäure, die für die Herstellung verschiedener Verbindungen wie Polyamid, Polyurethan, 1,5-Pentandiol und 5-Hydroxyvaleriansäure verwendet wird, mit hoher Ausbeute biosynthetisiert werden.

Description

[Technischer Bereich]
Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Mikroorganismus mit verbesserter Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure und insbesondere einen rekombinanten Mikroorganismus, dem eine erhöhte Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure verliehen wurde, indem ein Gen, das für ein Polypeptid mit Glutarsäure-Transporteraktivität kodiert, in einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure eingeführt wurde, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Glutarsäure unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus.
[Stand der Technik]
Angesichts der zunehmenden Besorgnis über den Klimawandel und die Abhängigkeit von fossilen Ressourcen wird die biobasierte Herstellung von Chemikalien, Kraftstoffen und Materialien aus erneuerbaren Ressourcen intensiv erforscht. Unter den verschiedenen hochwertigen Verbindungen erhalten biobasierte Polymere und Monomere große Aufmerksamkeit als umweltfreundliche Alternativen zu aus Erdöl gewonnenen Kunststoffen. Glutarsäure, auch bekannt als Pentandisäure, ist ein Material, das für die Herstellung verschiedener Verbindungen wie Polyester, Polyamid, Polyurethan, 1,5-Pentandiol und 5-Hydroxyvaleriansäure verwendet wird. Glutarsäure wird durch verschiedene chemische Verfahren auf Erdölbasis hergestellt, darunter die Oxidation von 2-Cyanocyclopentanon mit Salpetersäure als Katalysator und die Kondensation von Ethylmalonat und Acrylnitril. Diese Verfahren sind jedoch aufgrund des Einsatzes von nicht erneuerbaren und giftigen Stoffen nachteilig. Daher wurden verschiedene Ansätze für die biologische Herstellung von Glutarsäure aus erneuerbaren Ressourcen vorgeschlagen.
Glutarsäure ist ein natürlich vorkommender Metabolit des Lysinkatabolismus in Pseudomonas-Arten, bei dem Lysin über einen 5-Aminovaleriansäure (AVA)-Weg in Glutarsäure umgewandelt wird (Fothergill et al., J. Gen. Microbiol. 99, 139-155, 1977). Zuvor wurde erstmals über die Produktion von Glutarsäure in E. coli über diesen Weg berichtet, der die Gene davB, davA, davT und davD umfasst, die für L-Lysin-2-Monooxygenase (DavB), 5-Aminovaleramid-Amidohydrolase (DavA), Aminovalerat-Aminotransferase (DavT) bzw. Glutarat-Semialdehyd-Dehydrogenase (DavD) kodieren (Park et al, Metab. Eng. 16, 42-47, 2013). Darüber hinaus wurde in E. coli zwar versucht, einen Weg zu nutzen, der die Kondensation von α-Ketoglutarat und Acetyl-CoA einschließt, aber der Titer der in der Kolbenkultur erhaltenen Glutarsäure betrug nur 0,42 g/L (Wang et al. , ACS Synth. Biol. 6, 1922-1930, 2017). Über die Produktion von Glutarsäure mit dem metabolisch veränderten Corynebacterium glutamicum wurde ebenfalls in mehreren Studien berichtet (Shin et al. , Microb. Cell Fact. 15, 174, 2016, Rohres et al. , Green Chem. 20, 4662-4674, 2018, Kim et al. , Metab. Eng. 51, 99-109, 2019). Es wurde über einen rekombinanten Corynebacterium glutamicum-Stamm berichtet, der durch Manipulation des Produktionsstamms von AVA, einem Glutarsäurevorläufer, Glutarsäure in großen Mengen produziert (Rohres et al. , Green Chem. 20, 4662-4674, 2018). Dieser rekombinante Stamm, der die Gene, die für 5-Aminovalerat-Aminotransferase (GabT), Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (GabD) und AVA-Transporter (Ncg10464) kodieren, überexprimiert, produzierte 90 g/L Glutarsäure.
Bei der Überproduktion einer gewünschten Verbindung mit Hilfe eines rekombinanten Mikroorganismus ist ein effizienter Transport unerlässlich, damit die Verbindung kontinuierlich in der Zelle synthetisiert werden kann. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Überexpression eines Transporters eines Zielstoffs dessen biologische Produktion erhöht (Rohres et al. , Green Chem. 20, 4662-4674, 2018, Lubitz et al. , J. Appl. Microbiol. 100, 8465-8474, 2016, Youn et al. , J. Bacteriol. 191, 5480-5488, 2009). Allerdings wurde bisher kein Glutarsäuretransporter für Corynebacterium glutamicum beschrieben.
Dementsprechend haben die gegenwärtigen Erfinder große Anstrengungen unternommen, um Verfahren für den effizienten Transport von Glutarsäure zu entwickeln, die von rekombinantem Corynebacterium glutamicum produziert wird, und folglich die Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure zu verbessern, und so ein Gen neu identifiziert, das für ein Polypeptid mit Glutarsäure-Transporteraktivität kodiert, und festgestellt, dass die Produktion von Glutarsäure in dem rekombinanten Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure, in den das oben genannte Gen eingeführt wird, verbessert wird, was zu der vorliegenden Erfindung führt.
[Offenbarung]
[Technisches Problem]
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Mikroorganismus mit verbesserter Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Glutarsäure unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus bereitzustellen.
[Technische Lösung]
Um die oben genannten Ziele zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Mikroorganismus zur Verfügung, dem eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von Glutarsäure verliehen wurde, indem ein ynfM-Gen in einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von Glutarsäure eingeführt wurde.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glutarsäure bereit, das Folgendes umfasst:

(a) Herstellung von Glutarsäure durch Kultivieren des oben beschriebenen rekombinanten Mikroorganismus; und
(b) Gewinnung der hergestellten Glutarsäure.

[Vorteilhafte Effekte]
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Glutarsäure, die für die Herstellung verschiedener Verbindungen wie Polyester, Polyamid, Polyurethan, 1,5-Pentandiol und 5-Hydroxyvaleriansäure verwendet wird, mit hoher Ausbeute biosynthetisiert werden.
Figurenliste

1 zeigt schematisch einen Weg zur Biosynthese von Glutarsäure aus Lysin.
2 zeigt eine genetische Karte eines rekombinanten Vektors pGA1, der ein Gen für die Herstellung von 5-α-Aminovaleriansäure (AVA) aus Lysin enthält, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde.
3 zeigt eine genetische Karte eines rekombinanten Vektors pGA4, der ein Gen für die Herstellung von Glutarsäure aus 5-α-Aminovaleriansäure (AVA) enthält.
4 zeigt eine genetische Karte eines rekombinanten Vektors pEK_GAex5 für die Überexpression eines Gens, das für einen Glutarsäuretransporter kodiert.
5 zeigt die Ergebnisse der Bestätigung der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure in einem rekombinanten Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure, in den der Vektor zur Überexpression eines Gens, das für einen Glutarsäuretransporter kodiert, eingeführt wurde.
6 zeigt die Ergebnisse der Bestätigung der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure in Corynebacterium glutamicum, bei dem das Gen, das für den Glutarsäuretransporter kodiert, aus dem Genom entfernt wurde.

[Ausführung der Erfindung]
Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie vom Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung typischerweise verstanden wird. Im Allgemeinen ist die hier verwendete Nomenklatur typisch für das Fachgebiet.
Glutarsäure ist eine Verbindung, die für die Herstellung verschiedener Verbindungen wie Polyurethan, 1,5-Pentandiol und 5-Hydroxyvaleriansäure verwendet wird. Chemische Synthesemethoden wurden üblicherweise dafür verwendet, und vor kurzem wurde Glutarsäure unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus durch einen Glutarsäure-Biosyntheseweg (1) hergestellt, aber der Transporter von Glutarsäure, der sich in Zellen ansammelt, wurde nicht identifiziert, so dass die Fähigkeit des rekombinanten Mikroorganismus, Glutarsäure zu produzieren, gering ist. In der vorliegenden Erfindung wird ein Gen mit Glutarsäure-Transporter-Aktivität identifiziert, und es wird auch bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus, der das Gen mit Glutarsäure-Transporter-Aktivität und den Glutarsäure-Biosyntheseweg verwendet, im Vergleich zu einem rekombinanten Mikroorganismus, in den kein Gen mit Glutarsäure-Transporter-Aktivität eingeführt wird, eine hohe Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure aufweist.
Dementsprechend betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung einen rekombinanten Mikroorganismus mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure, bei dem ein Gen, das für ein Polypeptid mit Glutarsäure-Transporteraktivität kodiert, zusätzlich in einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure eingeführt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Glutarsäuretransporter als eine Glutarsäurepermease definiert, die in der Lage ist, Glutarsäure nach außerhalb der Zelle zu transportieren.
In der vorliegenden Erfindung kann das Gen, das für das Polypeptid kodiert, aus der Gruppe bestehend aus einem ynfM-Gen, einem yjjP-Gen, einem yjjB-Gen, einem yeeA-Gen und einem sucE1-Gen ausgewählt werden.
In der vorliegenden Erfindung kann das ynfM-Gen ein Gen sein, das für ein Polypeptid kodiert, das durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, und das ynfM-Gen kann durch SEQ ID NO: 2 dargestellt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Stamm GA16ΔynfM konstruiert, in dem das ynfM-Gen aus der chromosomalen DNA von Corynebacterium glutamicum GA16 ausgeschaltet ist, und ein pEK_GAex5-Vektor zur Überexpression des ynfM-Gens und ein pGA4-Vektor in den GA16ΔynfM-Stamm eingeführt werden, in dem das ynfM-Gen ausgeschaltet ist, so dass ein GA16ΔynfMI(pGA4, pEK_GAex5)-Stamm konstruiert wird, in dem der rekombinante Mikroorganismus, bei dem das Gen ausgeschaltet wurde, mit dem Vektor pEK_GAex5 transformiert wird, um die Wirkung der Wiederherstellung der Expression des ynfM-Gens zu bestätigen. Ausgehend von den Ergebnissen der Messung der Fähigkeit der so konstruierten rekombinanten Stämme, Glutarsäure zu produzieren, wurde in dem rekombinanten Stamm, in dem das ynfM-Gen ausgeschaltet wurde, überhaupt keine Glutarsäure produziert, während der rekombinante Stamm, in dem die Expression des ynfM-Gens durch Einführung des rekombinanten Vektors wiederhergestellt wurde, nachweislich 4,6 g/L Glutarsäure produzierte (6). Somit wurde nachgewiesen, dass das Gen von Corynebacterium glutamicum Ncg12828 (ynfM) eine Glutarsäure-Transporteraktivität besitzt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure ein Mikroorganismus mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von Lysin sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann als Mikroorganismus mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von Lysin ein rekombinanter Mikroorganismus verwendet werden, in dem das Startcodon des icd-Gens verändert ist, das ddh-Gen weiter eingeführt ist, die Promotoren des dapB-Gens, des dapA-Gens, des ppc-Gens und des lysA-Gens durch starke Promotoren ersetzt sind und das lysE-Gen deletiert ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure ein Gen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem davA-Gen, einem davB-Gen, einem gabT-Gen und einem gabD-Gen, umfassen.
Beispiele für Mikroorganismenstämme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Bakterien, Archaeen, Hefen, Schimmelpilze, Protozoen (Flagellaten, Amöben, Choanoflagellaten, Rhizaria, Chromalveolata), tierische Zellen, Mikroalgen, Pflanzenzellen und dergleichen. Bevorzugte Beispiele hierfür umfassen Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Pseudomonas sp., Anacystis sp., Anabaena sp., Chlorobium sp., Chloroflexus sp, Clostridium sp., Methanobacterium sp., Propionibacterium sp., Rhodopseudomonas sp., Rhodobacter sp., Rhodovulum sp., Streptococcus sp., Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Arabidopsis sp, Glycine sp., Nicotiana sp., Zea sp. und dergleichen, und besonders bevorzugte Beispiele dafür umfassen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactococcus lactis, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe und dergleichen, aber die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren der Kultivierung des mutierten Mikroorganismus unter Verwendung einer allgemein bekannten Kulturmethode durchgeführt werden, und zusätzlich zu dem spezifischen Medium und der spezifischen Kulturmethode, die bei der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Molke, Verzuckerungslösungen wie CSL (corn steep liquor) usw. und andere Medien verwendet werden, und es können verschiedene Methoden wie Fed-Batch-Kultur, kontinuierliche Kultur und dergleichen durchgeführt werden (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001).
Der hier verwendete Begriff „Vektor“ bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine DNA-Sequenz enthält, die funktionell mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die zur Expression von DNA in einem geeigneten Wirt fähig ist. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder eine potenzielle genomische Insertion sein. Nach der Transformation in einen geeigneten Wirt kann sich der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom funktionieren, oder er kann in einigen Fällen in das Genom selbst integriert werden.
Da ein Plasmid derzeit die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist, werden „Plasmid“ und „Vektor“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung manchmal synonym verwendet. Die vorliegende Erfindung umfasst jedoch auch andere Formen von Vektoren mit Funktionen, die denen entsprechen, die auf dem Gebiet der Technik bekannt sind oder bekannt werden. Typische Expressionsvektoren für die Expression in Säugetierzellkulturen basieren beispielsweise auf pRK5 (EP 307,247), pSV16B ( WO 91/08291 ) und pVL1392 (Pharmingen).
Der Ausdruck „Expressionskontrollsequenz“ bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für die Expression einer funktionell verknüpften kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus wesentlich ist. Eine solche Kontrollsequenz umfasst einen Promotor für die Transkription, eine beliebige Operatorsequenz zur Regulierung einer solchen Transkription, eine Sequenz, die für eine geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstelle kodiert, und eine Sequenz zur Regulierung der Terminierung von Transkription und Translation. Eine für Prokaryonten geeignete Kontrollsequenz umfasst beispielsweise einen Promotor, eine beliebige Operatorsequenz und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Eine eukaryotische Zelle enthält einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und einen Enhancer. Der Faktor, der das Expressionsniveau eines Gens im Plasmid am meisten beeinflusst, ist ein Promotor. Bevorzugte Beispiele für einen Promotor mit hoher Expression umfassen einen SRα-Promotor und einen vom Cytomegalovirus abgeleiteten Promotor.
Um die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, kann eine beliebige Expressionskontrollsequenz aus einer Vielzahl von Sequenzen im Vektor verwendet werden. Beispiele für nützliche Expressionskontrollsequenzen umfassen frühe und späte Promotoren des SV40- oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, die T3- und T7-Promotoren, die Hauptoperator- und Promotorregionen des Phagen Lambda, die Kontrollregionen für das kodierende Protein fd, Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, Phosphatase-Promotoren wie Pho5, Promotoren von Hefe-Alpha-Paarungssystemen und andere konstitutive und induzierbare Sequenzen, die dafür bekannt sind, die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder deren Viren zu kontrollieren, sowie verschiedene Kombinationen davon. Der T7-RNA-Polymerase-Promotor Φ10 kann für die Expression von Proteinen in E. coli nützlich sein.
Eine Nukleinsäure wird als „funktionell verknüpft“ bezeichnet, wenn sie in einer funktionellen Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz steht. Dabei kann es sich um ein Gen und eine oder mehrere Kontrollsequenzen handeln, die so miteinander verbunden sind, dass ein geeignetes Molekül (z. B. ein Transkriptionsaktivierungsprotein), wenn es an die Kontrollsequenz(en) gebunden ist, die Genexpression ermöglicht. Beispielsweise ist die DNA für eine Prä-Sequenz oder einen sekretorischen Leader funktionell mit der DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn es als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist, ein Promotor oder Enhancer ist funktionell mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst, eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionell mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn sie die Transkription der Sequenz beeinflusst, oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionell mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „funktionell verknüpft“, dass die verknüpfte DNA-Sequenz mit ihr in Kontakt steht und dass auch der sekretorische Leader mit ihr in Kontakt steht und im Leseraster vorhanden ist. Der Enhancer muss jedoch nicht damit in Kontakt stehen. Die Verknüpfung dieser Sequenzen wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsenzymstellen erreicht. Wenn keine solche Stelle vorhanden ist, wird ein synthetischer Oligonukleotid-Adapter oder Linker nach einer typischen Methode verwendet.
Der hier verwendete Begriff „Expressionsvektor“ bezieht sich im Allgemeinen auf ein doppelsträngiges DNA-Fragment als rekombinanten Träger, in den ein heterologes DNA-Fragment eingefügt wird. Heterologe DNA ist hier Hetero-DNA, also DNA, die in einer Wirtszelle nicht natürlich vorkommt. Ein Expressionsvektor kann sich, sobald er sich in der Wirtszelle befindet, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA replizieren, und es können mehrere Kopien des Vektors und der eingefügten (heterologen) DNA hergestellt werden.
Um die Expression eines transfizierten Gens in einer Wirtszelle zu erhöhen, muss das entsprechende Gen bekanntermaßen mit der Transkriptions- und Translationsexpressionskontrollsequenz, die in dem ausgewählten Expressionswirt funktioniert, funktionell verknüpft sein. Vorzugsweise sind die Expressionskontrollsequenz und das entsprechende Gen in einem einzigen Expressionsvektor enthalten, der sowohl den bakteriellen Selektionsmarker als auch den Replikationsursprung enthält. Handelt es sich bei dem Expressionswirt um eine eukaryotische Zelle, muss der Expressionsvektor außerdem einen Expressionsmarker enthalten, der in dem eukaryotischen Expressionswirt verwendbar ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Expressionswirts-/Vektor-Kombinationen verwendet werden, um die DNA-Sequenz des gewünschten Proteins zu exprimieren. Zu den Expressionsvektoren, die für eukaryotische Wirte geeignet sind, gehören beispielsweise Expressionskontrollsequenzen, die von SV40, Rinderpapillomavirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertem Virus, Cytomegalovirus und Retrovirus stammen. Zu den Expressionsvektoren, die in bakteriellen Wirten verwendet werden können, gehören bakterielle Plasmide, z. B. solche, die aus E. coli gewonnen werden, wie pBlueScript, pGEX2T, pUC-Vektor, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und Derivate davon, Plasmide, die in einem breiten Wirtsspektrum verwendet werden können, wie RP4, Phagen-DNA, die durch eine Vielzahl von Phagen-Lambda-Derivaten beispielhaft dargestellt wird, wie λgt10, λgt11 und NM989, und andere DNA-Phagen, wie M13 und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen. Die für Hefezellen nützlichen Expressionsvektoren sind 2µ-Plasmide und Derivate davon. Ein nützlicher Vektor für Insektenzellen ist pVL 941.
Eine mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte oder transfizierte Wirtszelle ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Der hier verwendete Begriff „Transformation“ bezieht sich auf die Einführung von DNA in einen Wirt, so dass die DNA entweder als extrachromosomaler Faktor oder durch chromosomale Integration replizierbar wird. Der hier verwendete Begriff „Transfektion“ bedeutet, dass ein Expressionsvektor von einer Wirtszelle akzeptiert wird, unabhängig davon, ob eine kodierende Sequenz tatsächlich exprimiert wird oder nicht.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Darüber hinaus wird üblicherweise eine Wirtszelle verwendet, die eine hohe DNA-Einführungseffizienz und eine hohe Expressionseffizienz der eingeführten DNA aufweist. Beispiele für Wirtszellen, die verwendet werden können, umfassen bekannte eukaryotische und prokaryotische Wirte wie E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze und Hefe, Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda (SF9), tierische Zellen wie CHO- und Mäusezellen, afrikanische grüne Affenzellen wie COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 und BMT 10 sowie menschliche Zellen in Gewebekultur. Bei der Klonierung von cDNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, wird vorzugsweise eine tierische Zelle als Wirt verwendet. In der vorliegenden Erfindung sind CHSE-214, FHM, RTG-2 und EPC fischlichen Ursprungs Beispiele, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Im Falle der Verwendung von COS-Zellen liegt das Plasmid mit dem Replikationsursprung von SV40 als Mehrfachkopie eines Episoms in der Zelle vor, und eine höhere Expression ist zu erwarten, da das große T-Antigen von SV40 in COS-Zellen exprimiert wird. Die eingeführte DNA-Sequenz kann von derselben Spezies wie die Wirtszelle stammen, von einer anderen Spezies als die Wirtszelle sein oder eine hybride DNA-Sequenz sein, die eine heterologe oder homologe DNA enthält.
Es versteht sich von selbst, dass nicht alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen gleichermaßen bei der Expression der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung funktionieren. Ebenso funktionieren nicht alle Wirte in demselben Expressionssystem gleich gut. Der Fachmann kann jedoch eine geeignete Auswahl aus verschiedenen Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten treffen, ohne vom Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen, ohne dass dies einen übermäßigen experimentellen Aufwand bedeutet. Bei der Auswahl eines Vektors muss zum Beispiel der Wirt berücksichtigt werden. Dies liegt daran, dass der Vektor in ihm repliziert werden muss. Die Anzahl der Kopien des Vektors, seine Fähigkeit, die Anzahl der Kopien zu kontrollieren, und die Expression anderer Proteine, für die der Vektor kodiert, z. B. Antibiotikamarker, müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Bei der Auswahl der Expressionskontrollsequenz müssen verschiedene Faktoren berücksichtigt werden. So sind beispielsweise die relative Stärke der Sequenzen, die Wahrscheinlichkeit ihrer Kontrolle und die Kompatibilität mit DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung usw. zu berücksichtigen, insbesondere im Hinblick auf mögliche Sekundärstrukturen. Bei der Auswahl des Einzel-Zellen-Wirts sollten Faktoren wie der gewählte Vektor, die Toxizität des Produkts, für das die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung kodiert, die sekretorischen Eigenschaften, die Fähigkeit zur korrekten Faltung des Proteins, die Kultur- und Fermentationsanforderungen und die einfache Reinigung des Produkts, für das die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung kodiert, aus dem Wirt berücksichtigt werden. Im Rahmen dieser Faktoren kann der Fachmann verschiedene Kombinationen von Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten auswählen, die in der Lage sind, die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in der Fermentation oder in einer groß angelegten Tierkultur zu exprimieren. Als Screening-Methode für die Klonierung der cDNA des Proteins durch Expressionsklonierung können eine Bindungsmethode, eine Schwenkmethode, eine Filmemulsionsmethode usw. angewendet werden.
Die Begriffe „Gen-Codon-optimierte Sequenz“ und „Codon-Optimierung“, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beziehen sich auf die Substitution einiger Aminosäure-Codons unter den Aminosäure-Codons, die für ein Zielmaterial kodieren, so dass das Expressionsniveau eines Materials, für das ein bestimmtes Gen kodiert, in Abhängigkeit von der Art der Wirtszelle steigt. Verschiedene Kombinationen und Anwendungen von Substitutionen einiger Aminosäurecodons sind für den Fachmann möglich.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Glutarsäure, einschließlich:

(a) Herstellung von Glutarsäure durch Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung; und
(b) Gewinnung der hergestellten Glutarsäure.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Corynebacterium glutamicum GA16-Stamm konstruiert, in den ein pGA4-Vektor, bei dem es sich um einen rekombinanten Vektor für die Glutarsäure-Biosynthese einschließlich eines davA-Gens, eines davB-Gens, eines gabT-Gens und eines gabD-Gens handelt, und ein pEK_GAex5-Vektor, bei dem es sich um einen rekombinanten Vektor für die Überexpression eines ynfM-Gens handelt, eingeführt wurden, und die Fähigkeit des Stamms zur Produktion von Glutarsäure wurde gemessen. Das Ergebnis war, dass der rekombinante Kontrollstamm, der mit dem leeren Vektor transformiert wurde, 6,5 g/L Glutarsäure produzierte, während der rekombinante Stamm, der mit dem pEK_GAex5-Vektor, der das ynfM-Gen enthält, transformiert wurde, 7,6 g/L Glutarsäure produzierte, was darauf hindeutet, dass die Produktion von Glutarsäure durch die Überexpression des Glutarsäuretransporter-Gens erhöht wurde.
[Beispiele]
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann anhand der folgenden Beispiele gewonnen werden. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu verstehen, wie für den Fachmann offensichtlich ist.
Beispiel 1: Konstruktion eines rekombinanten Stammes mit erhöhter Fähigkeit zur Lysinproduktion
In diesem Beispiel wurde ein rekombinanter Corynebacterium glutamicum-Stamm mit erhöhter Fähigkeit zur Produktion von Lysin als Glutarsäurevorläufer untersucht.
Im Genom des Stammes Corynebacterium glutamicum BE (C. glutamicum KCTC 12390BP) wurden folgende genetische Manipulationen vorgenommen: Änderung des Startcodons des icd-Gens, weitere Einführung des ddh-Gens, Substitution des Promotors des dapB-Gens, des dapA-Gens, des ppc-Gens und des lysA-Gens sowie Deletierung des lysE-Gens.
1-1: Änderung des Startcodons des icd-Gens
Die Gene wurden mit zuvor beschriebenen Methoden manipuliert (Park S. H. et al., Nat. Commun. 5, 4618, 2018). Um das Startcodon des icd-Gens von atg in gtg zu ändern, wurde der stromaufwärts gelegene Teil, der der homologe Arm ist, im C. glutamicum BE-Genom mit den Primern von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 amplifiziert, und der stromabwärts gelegene Teil wurde im C. glutamicum BE-Genom unter Verwendung der Primer von SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 amplifiziert. Anschließend wurden die amplifizierten Sequenzen in pK19mob-sacB eingefügt, das mit BamHI und PstI durch Gibson-Assemblierung gespalten wurde, wodurch ein endgültiger Vektor psacB_icd konstruiert wurde.

SEQ ID NO: 3: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGAATCTGCAGACCACTCGCC
SEQ ID NO: 4: AAGGAGACTCGTGGCTAAGATCATCTGGACCC SEQ ID NO: 5: TCTTAGCCACGAGTCTCCTTGGTTGATGGGC
SEQ ID NO: 6: ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGCACGCATCCTCGAAGACC

1-2: Weitere Einführung des ddh-Gens
Zur weiteren Einführung des ddh-Gens wurde der stromaufwärts gelegene Teil, d.h. der homologe Arm, im C. glutamicum BE-Genom mit den Primern von SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 amplifiziert, und der stromabwärts gelegene Teil wurde im C. glutamicum BE-Genom unter Verwendung der Primer von SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 amplifiziert. Anschließend wurden die amplifizierten Sequenzen in pK19mob-sacB eingefügt, das mit BamHI und PstI durch Gibson-Assemblierung gespalten wurde, wodurch ein endgültiger Vektor psacB_icd konstruiert wurde.

SEQ ID NO: 7: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTCGTGGTCTGGTCCACGG
SEQ ID NO: 8: CAGACCACGACATCCAAACCCAACCGCG
SEQ ID NO: 9: GGTTTGGATGTCGTGGTCTGGTCCACGG
SEQ ID NO: 10: ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCATCCAAACCCAACCGCG

1-3: Substitution des Promotors von dapB-Gen, dapA-Gen, ppc-Gen und lysA-Gen
Für die Promotorsubstitution der dapB-, dapA-, ppc- und lysA-Gene wurde der stromaufwärts gelegene Teil, d. h. der homologe Arm, im C. glutamicum BE-Genom mit den Primerpaaren SEQ ID NO: 11 und 12, SEQ ID NO: 17 und 18, SEQ ID NO: 23 und 24 bzw. SEQ ID NO: 29 und 30 amplifiziert, und der stromabwärts gelegene Teil wurde im C. glutamicum BE-Genom unter Verwendung der Primerpaare SEQ ID NO: 15 und 16, SEQ ID NO: 21 und 22, SEQ ID NO: 27 und 28 bzw. SEQ ID NO: 33 und 34 amplifiziert. Ein zu ersetzender H36-Promotor wurde im pCES208s-Vektor mit den Primerpaaren SEQ ID NO: 13 und 14, SEQ ID NO: 19 und 20, SEQ ID NO: 25 und 26 und SEQ ID NO: 31 und 32 amplifiziert. Dann wurden die amplifizierten Sequenzen in pK19mob-sacB eingefügt, das mit BamHI und PstI durch Gibson-Assemblierung gespalten wurde, wodurch die endgültigen Vektoren psacB_36dapB, psacB_36dapA, psacB_36ppc und psacB_361ysA konstruiert wurden.
Primer für die Konstruktion von psacB_36dapB

SEQ ID NO: 11: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTCTGGCTGTGCGTCCATG
SEQ ID NO: 12: CATGGGATCCATGGGAATCAAGGTTGGCGTTC
SEQ ID NO: 13: CTTGATTCCCATGGATCCCATGCTACTCCTACC
SEQ ID NO: 14: CTTAAGTCTCATGGTACCTCTATCTGGTGCCC
SEQ ID NO: 15: TAGAGGTACCATGAGACTTAAGTTGCCCTTCACC
SEQ ID NO: 16: ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCTTGAATATTGACGTTGAGGAAGGAAT C

Primer für die Konstruktion von psacB_36dapA

SEQ ID NO: 17: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGACGAGGTCACCCTTGGCG
SEQ ID NO: 18: CATGGGATCCATGAGCACAGGTTTAACAGCTAAGAC
SEQ ID NO: 19: ACCTGTGCTCATGGATCCCATGCTACTCCTACC
SEQ ID NO: 20: ATGGACTTTTAAGGTACCTCTATCTGGTGCCC
SEQ ID NO: 21: TAGAGGTACCTTAAAAGTCCATGACATACGGGCTTG
SEQ ID NO: 22: ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCGAGGCATTTCTCGGTCC

Primer für die Konstruktion von psacB_36ppc

SEQ ID NO: 23: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGGTAGGCTCCGCAGACTG
SEQ ID NO: 24: CATGGGATCCATGACTGATTTTTTACGCGATGACATC
SEQ ID NO: 25: AAAATCAGTCATGGATCCCATGCTACTCCTAC
SEQ ID NO: 26: GTAGAAGTGCGGGGTACCTCTATCTGGTGCC
SEQ ID NO: 27: TAGAGGTACCCCGCACTTCTACAGTGCTTG
SEQ ID NO: 28: ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCTGCTCTTGGGTTGTCGTTG

Primer für die Konstruktion von psacB_361ysA

SEQ ID NO: 29: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGCGTTCCTCCGTGGATTCCTC
SEQ ID NO: 30: TAGAGGTACCTGTTACATCTTCTCCGGTGCG
SEQ ID NO: 31: GAAGATGTAACAGGTACCTCTATCTGGTGCCC
SEQ ID NO: 32: AACTGTAGCCATGGATCCCATGCTACTCCTACC
SEQ ID NO: 33: CATGGGATCCATGGCTACAGTTGAAAATTTCAATGAACTTCC
SEQ ID NO: 34: AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGCTTTACGCGGATCAACAC

1-4: Deletion des lysE-Gens
Für die Deletion des lysE-Gens wurde der stromaufwärts gelegene Teil, d. h. der homologe Arm, im C. glutamicum BE-Genom mit dem Primerpaar SEQ ID NO: 35 und 36 amplifiziert, und der stromabwärts gelegene Teil wurde im C. glutamicum BE-Genom mit dem Primerpaar SEQ ID NO: 37 und 38 amplifiziert. Dann wurden die amplifizierten Sequenzen in pK19mob-sacB eingefügt, das mit BamHI und PstI durch Gibson-Assemblierung gespalten wurde, wodurch ein endgültiger Vektor psacB_lysE2 konstruiert wurde.

SEQ ID NO: 35: GCTTGCATGCCTGCAATCTGCTGCAGTCAGCTGCC
SEQ ID NO: 36: GTCTGCTTTGCGACACCGGACGGTGGATTTTC
SEQ ID NO: 37: GGTGTCGCAAAGCAGACCTGTAATGAAGATTTCCATG
SEQ ID NO: 38: AGCTCGGTACCCGGGCATCAACCATGTAGGCATCCCG

Der rekombinante Stamm mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von Lysin, der wie oben beschrieben konstruiert wurde, erhielt den Namen GA16 und wurde als rekombinanter Mikroorganismus für die Herstellung von Glutarsäure in den Beispielen 4 und 5 verwendet.
Beispiel 2: Konstruktion eines Genexpressionsvektors, der an der Herstellung von Glutarsäure beteiligt ist
p36davAB3 (Shin et al. , Microb. Cell Fact. 15, 174, 2016), das durch Codon-Optimierung der chromosomalen DNA-Sequenzen des davA-Gens und des davB-Gens eines Pseudomonas putida-Stamms konstruiert wurde, wurde als Matrize verwendet, und die PCR wurde unter Verwendung des Primerpaars der SEQ ID NO: 39 und 40 (36davAB_p208s_F und 36davAB_p208s_R) durchgeführt, um ein PCR-Produkt zu erhalten, das das davA-Gen und das davB-Gen enthält, und dieses Fragment wurde in einen pCES208s-Vektor (Laborbestand) kloniert, der mit einem Restriktionsenzym Ncol gespalten wurde, wodurch ein pGA1-Vektor konstruiert wurde, der ein Gen für die Umwandlung von Lysin in 5-α-Aminovaleriansäure (AVA) exprimiert (2).

36davAB_p208s_F: GCTTCCAGCTCTGTGACGACGGTACCTCTATCTGGTGC (SEQ ID NO: 39)
36davAB_p208s_R: CGTCCCCCGAGCGAAATTTTGGCTTAATGATGGTGATGGTGATG (SEQ ID NO: 40)
SEQ ID NO: 41: Codon-optimierte davA-Gensequenz
SEQ ID NO: 42: Codon-optimierte davB-Gensequenz

Anschließend wurden die Chromosomen des gabT-Gens und des gabD-Gens des Corynebacterium glutamicum-Genoms als Matrize verwendet, und es wurde eine PCR unter Verwendung des Primerpaars SEQ ID NO: 43 und 44 (gabTD_p208s_F und gabTD_p208s_R) durchgeführt, um ein PCR-Produkt zu erhalten, das dann in den pGA1-Vektor kloniert wurde, der mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten wurde, wodurch pGA4 konstruiert wurde (3).

gabTD_p208s_F: TAGGAGTAGCATGGGATCCTATGGAAGATCTCTCATACCGCATCC (SEQ ID NO: 43)
gabTD_p208s_R: TATAATGGCCGGCTGGGCCTTCACGGCAAAGCGAGGTAAC (SEQ ID NO: 44)
SEQ ID NO: 45: gabT-Gensequenz
SEQ ID NO: 46: gabD-Gensequenz

Beispiel 3: Konstruktion eines Vektors, der das Glutarsäuretransporter-Gen exprimiert
Die chromosomale DNA des Gens Ncg12828 (ynfM) (SEQ ID NO: 2) von Corynebacterium glutamicum wurde als Matrize verwendet, und die PCR wurde mit dem Primerpaar SEQ ID NO: 47 und 48 (GAex5_F und GAex5_R) durchgeführt, wodurch ein Genfragment konstruiert wurde, das für einen Glutarsäuretransporter kodiert.

GAex5-F: TTTCACACAGGAAACAGATGATGAACTCCATGAGCCAAGC (SEQ ID NO: 47)
GAex5_R: CCAAGCTTGGCTGCATTAATTGGCGTTGCGGGCAAG (SEQ ID NO: 48)

Das so konstruierte Fragment wurde in einen pEKEx1-Vektor kloniert, der mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI gespalten wurde (Eikmanns B. J. et al., Gene. 102, 93-98, 1991), wodurch ein rekombinanter Vektor pEK_GAex5 konstruiert wurde (4).
Beispiel 4: Bestätigung der Fähigkeit zur Produktion von Glutarsäure in rekombinanten Mikroorganismen, in die ein Vektor eingeführt wurde, der das Glutarsäuretransporter-Gen exprimiert
In den in Beispiel 1 konstruierten Corynebacterium glutamicum GA16-Stamm wurden der in Beispiel 2 konstruierte pGA4-Vektor und der in Beispiel 3 konstruierte pEK_GAex5-Vektor eingeführt, und seine Fähigkeit, Glutarsäure zu produzieren, wurde bewertet. Ein Corynebacterium glutamicum GA16-Stamm, in den der pGA1-Vektor und der leere Vektor pEKEx1 eingeführt wurden, wurde als Kontrollstamm verwendet.
Die mutierten Mikroorganismen, die wie oben beschrieben konstruiert wurden, wurden in einem BHIS-Plattenmedium selektiert, das mit 25 mg/L Kanamycin und 200 mg/L Spectinomycin ergänzt wurde (einschließlich 37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L Sorbit und 15 g/L Agar). Der ausgewählte transformierte Stamm wurde in 5 mL eines BHIS-Mediums (einschließlich 37 g/L Brain Heart Infusion (BHI) und 91 g/L Sorbit) beimpft und 18 Stunden lang bei 30°C vorkultiviert. Anschließend wurden 0,4 mL der vorkultivierten Lösung in einen 300-mL-Kolben mit 25 mL eines Mediums zur Herstellung von Glutarsäure beimpft und kultiviert.
Die Zusammensetzung des Mediums zur Herstellung von Glutarsäure war wie folgt:

auf der Grundlage von 1 Liter destilliertem Wasser, 80 g/L Glucose, 1 g/L K₂HPO₄, 1 g/L KH₂PO₄, 1 g/L Harnstoff, 20 g/L (NH₄)₂SO₄, 10 g/L eines Hefeextrakts, 1 g/L MgSO₄, 50 mg/L CaCl₂, 100 µg/L Biotin, 10 mg/L β-Alanin, 10 mg/L Thiamin HCl, 10 mg/L Nikotinsäure, 1,3 mg/L (NH₄)₆MoO₂₄, 10 mg/L FeSO₄, 10 mg/L MnSO₄, 5 mg/L CuSO₄, 10 mg/L ZnSO₄, und 5 mg/L NiCl₂.

Der rekombinante Stamm wurde 48 Stunden lang unter Schütteln bei 30 °C und 200 U/min kultiviert. Nach Abschluss der Kultur wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang bei 13.200 U/min zentrifugiert, nur der Überstand wurde gesammelt und die Produktion von Glutarsäure durch HPLC-Analyse bestätigt.
Wie in 5 gezeigt, wurden in dem rekombinanten Kontrollstamm, der mit dem leeren Vektor transformiert wurde, 6,5 g/L Glutarsäure produziert, und in dem mutierten Mikroorganismus, der mit dem pEK_GAex5 Vektor, der das ynfM-Gen enthält, transformiert wurde, 7,6 g/L Glutarsäure produziert, was darauf hindeutet, dass die Produktion von Glutarsäure aufgrund der Überexpression des Glutarsäuretransportergens erhöht wurde.
Beispiel 5: Bestätigung der Fähigkeit zur Produktion von Glutarsäure in rekombinanten Mikroorganismen, bei denen das Glutarsäuretransporter-Gen ausgeschaltet wurde
Um zu bestätigen, dass das Ncg12828 (ynfM)-Gen von Corynebacterium glutamicum Glutarsäure-Transporter-Aktivität besitzt, wurde GA16ΔynfM konstruiert, ein rekombinanter Stamm, bei dem das oben genannte Gen aus der chromosomalen DNA des in Beispiel 1 konstruierten Corynebacterium glutamicum GA16 ausgeschaltet wurde.
Für den Knockout bzw. die Ausschaltung des ynfM-Gens wurde der stromaufwärts gelegene Teil, d. h. der homologe Arm, im C. glutamicum BE-Genom mit dem Primerpaar SEQ ID NO: 49 und 50 amplifiziert, und der stromabwärts gelegene Teil wurde im C. glutamicum BE-Genom mit dem Primerpaar SEQ ID NO: 51 und 52 amplifiziert. Dann wurden die amplifizierten Sequenzen in pK19mob-sacB eingefügt, das mit BamHI und PstI durch Gibson-Assemblierung gespalten wurde, wodurch der endgültige Vektor psacB_ynfMKO konstruiert wurde.

SEQ ID NO: 49: GCTTGCATGCCTGCAATGCGAGGTCAGTTTCATCAGC
SEQ ID NO: 50: CAGGTCCCCACAGCGCGCTTGTAATTGC
SEQ ID NO: 51: GCGCTGTGGGGACCTGGAGTTCCACC
SEQ ID NO: 52: AGCTCGGTACCCGGGCCACACCACAATCGAATTGGTG

Um die Wirkung der Wiederherstellung der Expression des ynfM-Gens durch Einführung des pEK_GAex5-Vektors für die Überexpression des ynfM-Gens und des pGA4-Vektors in den GA16ΔynfM-Stamm, in dem das ynfM-Gen ausgeschaltet wurde, zu bestätigen, wurde außerdem ein GA16 ΔynfM(pGA4, pEK_GAex5)-Stamm konstruiert, in dem der rekombinante Mikroorganismus, bei dem das Gen ausgeschaltet wurde, mit dem pEK_GAex5-Vektor transformiert wurde. Die rekombinanten Stämme, die wie oben beschrieben konstruiert wurden, wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 kultiviert, und ihre Fähigkeit, Glutarsäure zu produzieren, wurde bewertet.
Wie in 6 gezeigt, wurde in dem rekombinanten Stamm, in dem das ynfM-Gen ausgeschaltet war, überhaupt keine Glutarsäure produziert, während in dem rekombinanten Stamm, in dem die Expression des ynfM-Gens durch Einführung des rekombinanten Vektors wiederhergestellt wurde, 4,6 g/L Glutarsäure produziert wurden. Somit wurde nachgewiesen, dass das Gen von Corynebacterium glutamicum Ncg12828 (ynfM) Glutarsäuretransporter-Aktivität besitzt.
Obwohl spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail wie oben beschrieben offenbart worden sind, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass die Beschreibung lediglich bevorzugte beispielhafte Ausführungsformen beschreibt und nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu verstehen ist. Daher wird der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 91/08291 [0024]

Claims

Rekombinanter Mikroorganismus mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure, bei dem ein Gen, das für ein Polypeptid mit Glutarsäure-Transporteraktivität kodiert, in einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure eingeführt wird.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Gen, das für das Polypeptid mit Glutarsäure-Transporteraktivität kodiert, ein Gen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem ynfM-Gen, einem yjjP-Gen, einem yjjB-Gen, einem yeeA-Gen und einem sucE1-Gen besteht.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 2, wobei das ynfM-Gen ein Gen ist, das ein Polypeptid kodiert, das durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 3, wobei das ynfM-Gen durch SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure ein Mikroorganismus mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von Lysin ist.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von Glutarsäure ein Gen umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem davA-Gen, einem davB-Gen, einem gabT-Gen und einem gabD-Gen.
Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der rekombinante Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactococcus lactis, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces pombe.
Verfahren zur Herstellung von Glutarsäure, umfassend: (a) Herstellen von Glutarsäure durch Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7; und (b) Gewinnung der hergestellten Glutarsäure.