EA032896B1 - Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33 - Google Patents

Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33 Download PDF

Info

Publication number
EA032896B1
EA032896B1 EA201700300A EA201700300A EA032896B1 EA 032896 B1 EA032896 B1 EA 032896B1 EA 201700300 A EA201700300 A EA 201700300A EA 201700300 A EA201700300 A EA 201700300A EA 032896 B1 EA032896 B1 EA 032896B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aspartate
iron
aspartic acid
magnesium
cobalt
Prior art date
Application number
EA201700300A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201700300A1 (ru
Inventor
Игорь Николаевич Сингирцев
Татьяна Александровна Сингирцева
Андрей Анатольевич Синтин
Максим Константинович СИНОЛИЦКИЙ
Сергей Петрович ВОРОНИН
Владимир Георгиевич ДЕБАБОВ
Александр Степанович ЯНЕНКО
Original Assignee
Акционерное Общество "Биоамид"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное Общество "Биоамид" filed Critical Акционерное Общество "Биоамид"
Priority to EA201700300A priority Critical patent/EA032896B1/ru
Publication of EA201700300A1 publication Critical patent/EA201700300A1/ru
Publication of EA032896B1 publication Critical patent/EA032896B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается лабораторного и промышленного способа культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы. Способ культивирования предусматривает включение в среду культивирования источников анионов аспарагиновой кислоты, а также ионов металлов - железа, магния и кобальта. Изобретение включает также среду для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33, содержащую источник анионов аспарагиновой кислоты и источники ионов металлов: железа, магния и кобальта. Изобретение обеспечивает промышленное получение биомассы штаммов-продуцентов Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой нитрилгидратазной активностью.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается лабораторного и промышленного способа культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M33.
Уровень техники
В настоящее время широко используются полимеры и сополимеры акриламида. Однако мировая потребность в этих продуктах удовлетворена не полностью и ежегодно увеличивается на 4-5%. В отличие от традиционных химических способов, биокаталитический способ производства акриламида имеет ряд важных преимуществ: высокую специфичность и селективность, одностадийность, малую энергоемкость, отсутствие побочных продуктов синтеза, технологических стоков и вредных отходов. Всё более активно применяются технологии промышленного производства акриламида с использованием биокатализаторов на основе штаммов-продуцентов фермента нитрилгидратазы. Расширение исследований бактериальных штаммов, метаболизирующих нитрилы, обусловлено необходимостью улучшения способа производства акриламида, а также перспективой применения микроорганизмов для получения ряда других коммерчески значимых соединений.
Наряду с поиском новых штаммов, продуцирующих фермент нитрилгидратазу, большое внимание уделяется способу культивирования этих микроорганизмов. Это нужно для того, чтобы иметь возможность получать каталитически активную биомассу в промышленных масштабах. Для повышения выхода ферментативной активности на единицу объёма культуральной жидкости обычно используют два основных метода:
1) активация синтеза фермента бактериальной клеткой или, другими словами, повышение удельной ферментативной активности (Ед/мг сухой биомассы);
2) повышение выхода активных клеток (активной биомассы) на единицу объема культуральной жидкости.
В патенте GB2087926 описан способ культивирования штамма Corynebacterium N-774 (регистрационный номер FERM 4446 в Fermentation Research Institute). Штамм культивируется в питательной среде, содержащей водорастворимые соединения железа в концентрациях, как минимум, 0,2 мг/л вместе с 1% казеинового гидролизата (казаминовые кислоты). Недостатками этого способа являются высокая стоимость казеиновых гидролизатов и получаемая низкая нитрилгидратазная активность биомассы (специфическая активность = 53,3 Ед/мг, сухая биомасса = 5,66 мг/мл, общая активность = 301,7 Ед/мл).
Известно, что нитрилы и амиды органических кислот, в особенности пропионовой и изомасляной, вызывают индукцию синтеза нитрилгидратазы. Об этом можно сделать вывод на основании данных патента US4555487, в котором показано, что добавление веществ, известных в качестве индукторов синтеза нитрилгидратазы, к культуральной среде штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM ВР-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), делает возможным получение биомассы, обладающей нитрилгидратазной активностью (сухая биомасса - 5,36 г/л, специфическая активность - 62,65 Ед/мг, общая активность 335,8 Ед/мл).
Недостатки, присущие этому способу, связаны с использованием дорогостоящих индукторов и получением клеток с низкой нитрилгидратазной активностью.
Культуральная среда для инкубации штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM ВР-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188) содержит не только индукторы, но также одну или более α-аминокислот, таких как цистеин, аланин, валин, метионин и др., в концентрациях от 0,1 до 10,0 г/л в качестве агентов, повышающих ферментативную активность. Тем не менее, удельная активность биомассы, полученной этим способом по патенту ЕР0115781, не превышает 105,7 Ед/мг, а общая активность не превышает 428,1 Ед/мл.
Более высокая нитрилгидратазная активность была достигнута при инкубации штамма Rhodococcus rhodochrous M33 (патент DE4480132). В описании к патенту указано, что при культивировании штамма на синтетической питательной среде, содержащей глюкозу в концентрации 5 г/л, вполне возможно получить клетки, обладающие нитрилгидратазной активностью до 200 Ед/мг и общей активностью до 360 Ед/мл. Важным преимуществом предложенного способа является простота питательной среды, которая не содержит каких-либо дорогих компонентов. Однако повышение концентрации глюкозы до 20 г/л приводит к повышению общей активности до значения, не превышающего 1368 Ед/мл.
В патенте RU2223316 описан способ культивирования штамма Rhodococcus ruber GT, способного продуцировать нитрилгидратазу с активностью 330 Ед/мг. Культивирование осуществляется на среде, содержащей ионы Fe2+ и ацетонитрил в качестве индуктора. Недостатком этого способа является невозможность получать более или менее значительные выходы биомассы.
В патенте RU2403280 описан способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, показывающего нитрилгидратазную активность 323 Ед/мг при 30°С. Среда для его культивирования содержит ацетонитрил - как индуктор и дрожжевой экстракт - как источник ростовых факторов. Однако и этот способ культивирования предназначен только для лабораторных условий и не подходит для промышленности.
В патенте ЕР0362829 описан способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478). При культивировании клеток этого штамма на питательной среде, содержащей соединения
- 1 032896 двухвалентного кобальта и мочевину в концентрации 15 г/л, удалось получить биомассу, показывающую удельную активность 578 Ед/мг. Для повышения выхода клеток в питательную среду добавляли пептон и дрожжевой экстракт. Тем не менее, выход сухой биомассы составил всего лишь 4,3 г/л, и достигнутая общая активность не превышала 2480 Ед/мл. Масштабирование процесса культивирования до производственных условий повышало выход клеток до 28 г/л, но это сопровождалось снижением удельной нитрилгидратазной активности до 76 Ед/мг и уменьшением общей активности до 2100 Ед/мл (см. Yamada H., Kobayashi M., Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide, Biosci. Biotech. Biochem., 60(9), 1391-1400, 1996).
Другой способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M33 характеризуется тем, что клетки штамма культивируются в 5-тилитровом ферментёре на полностью синтетической среде, состоящей из KH2PO4, K2HPO4, FeSO4-7H2O, ЭДТА-2№1. MgSO4-7H2O, NaCl, CoCl2-6H2O, мочевины и глюкозы. Путем постоянного регулирования подачи 40% раствора глюкозы и трех периодических добавок CoCl2-6H2O (по 0,01 г/л каждая) были достигнуты выход клеток 24 г/л и удельная нитрилгидратазная активность 120 Ед/мг. Однако общая активность после относительно длительного времени ферментации (115 часов) не превышала 2880 Ед/мл (см. Kim B-Y, Kim J-C, Lee H-H., Hyun H-H., Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33, Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 1117, 2001).
Способ, отвечающий промышленным требованиям, описан в патенте RU2340667. Штамм Rhodococcus rhodochrous M33 культивировали в 15 м3 ферментёре на среде, содержащей кукурузный экстракт как источник факторов роста, мочевину и CoCl2-6H2O в качестве индукторов и глюкозу в качестве источника углерода. Через 24 - 36 часов после начала культивирования и потребления всей глюкозы в среду добавляли 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl2-6H2O; рН среды культивирования поддерживали на уровне 7,9 добавлением водного раствора уксусной кислоты. После 72 ч ферментации было получено 18,8 г/л сухой биомассы с нитрилгидратазной активностью 290 Ед/мг. Общая активность составила 5452 Ед/мл Однако, в связи со все возрастающей потребностью в биокатализаторах, гидролизующих нитрил акриловой кислоты до акриламида, проблема повышения нитрилгидратазной активности штаммов остается актуальной
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного промышленного способа получения большого количества биомассы штамма Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой общей нитрилгидратазной активностью.
Поставленная задача решается путем разработки способа культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающегося тем, что используемая среда культивирования включает анионы аспарагиновой кислоты, а также ионы металлов - железа, магния и кобальта.
В некоторых вариантах изобретения источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.
В некоторых частных вариантах изобретения источником, по меньшей мере, одного из ионов железа, магния или кобальта является, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).
В некоторых частных вариантах изобретения неорганическая соль металла представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.
В некоторых частных вариантах изобретения неорганическая соль представляет собой FeSO4, MgSO4, CoCl2 и/или их гидраты.
В некоторых вариантах изобретения источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния, и/или аспартат кобальта.
В некоторых вариантах изобретения источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником, по меньшей мере одного, из ионов металлов является его неорганическая соль.
В некоторых вариантах изобретения суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты в среде составляет 0,076-3,0 г/л.
В некоторых вариантах изобретения в процессе культивирования через 30-40 ч от начала культивирования в среду дополнительно вносят глюкозу так, чтобы суммарное количество глюкозы в среде не превышало 120,0 г/л.
В некоторых вариантах изобретения в среду культивирования дополнительно вносят ацетат натрия так, чтобы суммарное количество внесенного ацетата натрия не превышало 6,0 г/л.
В некоторых частных вариантах изобретения рН среды поддерживают на заданном уровне раствором уксусной кислоты.
Поставленная задача решается также путем разработки среды для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающейся тем, что среда включает источник анионов аспарагиновой кислоты, а также источники ионов металлов - железа, магния и кобальта.
В некоторых вариантах изобретения в среде культивирования источники ионов металлов представ
- 2 032896 ляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.
В некоторых частных вариантах изобретения в среде для культивирования, источником по меньшей мере, одного из ионов железа, магния или кобальта является, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).
В некоторых частных вариантах изобретения в среде для культивирования неорганическая соль представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.
В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования неорганическая соль представляет собой FeSO4, CoCl2-MgSO4 и/или их гидраты.
В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния, и/или аспартат кобальта.
В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником, по меньшей мере одного из ионов металлов является его неорганическая соль.
В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты составляет 0,076-3,0 г/л.
В некоторых частных вариантах изобретения среда для культивирования содержит, г/л:
Na2HPO4-12H2O - 2,2 - 13,4;
КН2РО4 - 0,5 — 3,1;
FeSO4-7H2O- 0,01 — 0,3;
ЭДТА Na (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) - 0,02 — 0,6;
СоС12-6Н2О - 0,01 - 0,08;
MgSO4-7H2O - 0,05 - 2,5;
мочевина- 4,0 — 20,0;
глюкоза -12,0 — 120,0;
аспарагиновая кислота - 0,076 — 3,0;
вода - остальное.
В некоторых других частных вариантах изобретения среда для культивирования содержит, г/л:
Na2HPO4 12Н2О - 2,2 -13,4;
КН2РО4-0,5 —3,1;
аспартат железа(Н) - 0,011—0,33;
ЭДТА Na - 0,02 — 0,6;
аспартат кобальта(П) - 0,014 - 0,11;
аспартат магния(П) - 0,06 - 2,9;
мочевина - 4,0 — 20,0;
глюкоза-12,0 — 120,0;
вода - остальное.
В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты: увеличены выход активной биомассы Rhodococcus rhodochrous M33 и нитрилгидратазная активность Rhodococcus rhodochrous M33;
разработана среда для Rhodococcus rhodochrous M33, позволяющая культивировать штаммпродуцент без внесения в среду ростовых факторов;
разработан способ промышленного культивирования Rhodococcus rhodochrous M33, обеспечивающий высокую ферментативную активность;
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на создание эффективного промышленного способа получения биомассы Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой общей нитрилгидратазной активностью.
Заявленный способ заключается в разработке условий культивирования, а также создании среды культивирования без использования ростовых факторов и дорогостоящих индукторов, обеспечивающих увеличение выхода биомассы и высокую общую нитрилгидратазную активность Rhodococcus rhodochrous M33.
Для получения биомассы штамма Rhodococcus rhodochrous M33 необходимо разработать среду культивирования, полностью удовлетворяющую ростовые потребности клеток. В процессе исследований было отдано предпочтение синтетической среде, не содержащей дорогостоящих индукторов и источников ростовых факторов, так как источники ростовых факторов отличаются по составу в зависимости от производителя, причём точный состав определить практически невозможно.
Способ заключается во внесении в среду культивирования продуцента нитрилгидратазы анионов (остатков) аспарагиновой кислоты (аспартат-ионов) и ионов металлов - железа, магния и кобальта.
Источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.
В частных вариантах воплощения изобретения источником по меньшей мере одного из ионов железа, магния или кобальта является, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат
- 3 032896 магния (II) или аспартат кобальта (II). В других вариантах воплощения изобретения источником, по меньшей мере, одного из ионов железа, магния или кобальта, является соответствующая неорганическая соль. Неорганические соли металлов могут представлять собой, в частности, сульфаты, хлориды или их гидраты. Примерами таких неорганических солей могут быть FeSO4, MgSO4, CoCl2, а также их гидраты, например: FeSO4-7^O, FeSO4-4H2O, FeSO4-H2O, CoCM^O, CoC^^O, CoCM^O, CoC^^O, CoCl2-H2O, MgSO4-12H2O, MgSO4-7^O, MgSO4-6^O, MgSO4-5H2O, MgSO4-4H2O, MgSO4-3H2O, MgSO4-2H2O, MgSO4-H2O. С целью воплощения изобретения возможно использование и других неорганических солей ионов железа, магния и кобальта, помимо вышеуказанных, при условии, что эти соли не будут оказывать негативного влияния на рост клеток штамма Rhodococcus rhodochrous M33 и синтез нитрилгидратазы. Например, FeCl2, MgCl2 и их гидраты, например, FeCl2-6H2O; FeCl2-4H2O; FeCl2-2H2O, FeCl2-H2O, MgCl2-6H2O, MgC^^O.
Изобретение также охватывает варианты, в которых источниками ионов металлов в среде культивирования являются одновременно и аспартаты металлов, и их неорганические соли, в различных комбинациях. Например, в среду культивирования вносится аспартат железа и неорганические соли кобальта и магния; аспартат кобальта и неорганические соли железа и магния; аспартат магния и неорганические соли кобальта и железа. Также возможно включение в среду культивирования одновременно и аспартата, и неорганической соли одного из необходимых источников ионов металлов (железа, кобальта или магния), например, железа в виде аспартата и железа в виде хлорида; или, например, магния в виде аспартата вместе с магнием в виде хлорида и в виде сульфата. Источники ионов металлов вносятся в виде железа (II), железа (III), магния (II) или кобальта (II). Таким образом изобретение обеспечивает возможность использования железа(П) и железа (III), а также присутствие всех указанных металлов в среде культивирования в виде катионов металлов Со2+; Fe2+ и Mg2+.
Источником анионов аспарагиновой кислоты в среде культивирования является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния и/или аспартат кобальта. В ряде случаев источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником по меньшей мере одного из ионов металла являются неорганические соли. Также возможно одновременное внесение в среду культивирования аспартатов металлов (железа, кобальта и магния), аспарагиновой кислоты и неорганических солей металлов (железа, кобальта и магния). Суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты в среде составляет 0,076-3,0 г/л.
При внесении ионов железа, магния и кобальта в виде солей аспарагиновой кислоты и/или неорганических солей с внесением аниона аспарагиновой кислоты, анион аспарагиновой кислоты выполняет функцию транспортёра (переносчика) ионов через клеточную стенку.
Другими обязательными компонентами среды культивирования являются источники углерода. В качестве источников углерода и энергии могут использоваться: глюкоза, уксусная кислота, ацетат натрия. В качестве источника азота и индуктора синтеза нитрилгидратазы использовали мочевину. Использование данных компонентов в среде культивирования известно из уровня техники, например, Kim B-Y, Kim J-C, Lee H-H., Hyun H-H., Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33, // Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 11-17, 2001; RU2340667. Источники углерода вводятся в среду культивирования одной или двумя частями (дробно) до конечной концентрации с определенным интервалом времени. В частности, в процессе культивирования через 30-40 ч от начала культивирования в среду дополнительно вносят глюкозу так, чтобы суммарное количество глюкозы в среде не превышало 120,0 г/л. В рамках данного изобретения предполагается также использование двухкомпонентной схемы внесения источников углерода, предполагающей использование первого источника углерода на первой стадии роста и внесение второго источника углерода после потребления первого источника углерода. В частности, в среду культивирования дополнительно вносят ацетат натрия так, чтобы суммарное количество внесенного ацетата натрия не превышало 6,0 г/л. При внесении ацетата натрия рН среды поддерживают на заданном уровне раствором уксусной кислоты.
В качестве основы среды для культивирования используется фосфатный буфер, который удовлетворяет потребности клеток штамма в фосфоре и поддерживает значение рН в заданном диапазоне.
Примером среды для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 по изобретению может быть среда следующего состава (г/л):
Na2HPO4-12H2O 2,2-13,4;
КН2РО4 0,5 —3,1;
FeSO4-7H2O 0,01—0,3;
ЭДТА Na 0,02 — 0,6;
CoCI2-6H20 0,01 -0,08;
MgSO4-7H2O 0,05-2,5;
Мочевина 4,0 — 20,0;
Глюкоза 12,0 — 120,0;
Аспарагиновая кислота 0,076 — 3,0;
Вода - остальное.
- 4 032896
Еще одним примером среды для культивирования может быть, например, среда следующего состава (г/л):
Na2HPO4-12H2O 2,2-13,4;
КН2РО4 0,5 —3,1;
Аспартат железа (II) 0,011 — 0,33;
ЭДТА Na 0,02 — 0,6;
Аспартат кобальта (II) 0,014 - 0,11;
Аспартат магния (II) 0,06 - 2,9;
Мочевина 4,0 — 20,0;
Глюкоза 12,0 —120,0;
Вода - остальное.
Предлагаемый способ культивирования может быть использован, предпочтительно, для культивирования микроорганизмов из рода Rhodococcus, более предпочтительно - для микроорганизмов видов Rhodococcus rhodochrous, наиболее предпочтительно - для штамма Rhodococcus rhodochrous, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Ac-1515D, далее именуемого Rhodococcus rhodochrous M33.
Способ осуществляют следующим образом.
В одном из вариантов осуществления изобретения за основу среды был взят фосфатный буфер в концентрации 10-60 мМ, который поддерживал значение рН в физиологическом диапазоне 5,0-9,0. Обычно культивирование проводили в 35,3 мМ фосфатном буфере.
Среда культивирования (сокращенно обозначаемая в дальнейшем в данном документе, как MS), содержащая источник ионов металлов в виде неорганических солей -железа, кобальта и магния, имела следующий состав (г/л):
1. Na2HPO4-12H2O 2,2-13,4;
2. КН2РО4 0,5 —3,1;
3. FeSO4-7H2O 0,01—0,3;
4. ЭДТА Na 0,02 — 0,6;
5. CoCI2-6H2O 0,01-0,08;
6. MgSO4-7H2O 0,05-2,5;
7. Мочевина 4,0 — 20,0;
8. Гпюкоза 12,0—120,0;
9. Ацетат натрия 2,0-6,0 (при выращивании по двухкомпонентной
схеме);
10. Вода - остальное.
Согласно изобретению, для хелатирования ионов железа, кобальта и магния в среду MS вводили аспарагиновую кислоту в концентрации 0,076 - 3,0 г/л.
Среда культивирования (сокращенно обозначаемая в дальнейшем в данном документе, как MS-1), содержащая источники ионов металлов - железа, кобальта и магния в виде солей аспарагиновой кислоты, имела следующий состав (г/л):
1. Na2HPO4-12H2O 2,2-13,4;
2. КН2РО4 0,5 —3,1;
3. Аспартат железа (II) 0,011 —0,33;
4. ЭДТА Na 0,02 — 0,6;
5. Аспартат кобальта (II) 0,014-0,11;
6. Аспартат магния (II) 0,06-2,9;
7. Мочевина 4,0 — 20,0;
8. Глюкоза 12,0—120,0;
9. Ацетат натрия 2,0-6,0 (п
выращивании по двухкомпонентной схеме);
10. Вода - остальное.
При выращивании штамма Rhodococcus rhodochrous M33 в условиях периодического культивирования в колбах в качестве источника углерода и энергии в среды MS и MS-1 добавляли глюкозу, поддерживая её концентрацию в диапазоне 12,0 -120,0 г/л. Глюкозу вносят в среду культивирования одной или двумя частями. При внесении двумя частями, глюкозу дополнительно (дробно) вносят через 30-40 часов от начала таким образом, чтобы суммарное количество внесенной глюкозы не превышало 120,0 г/л.
При культивировании в лабораторных или промышленных ферментёрах по двухкомпонентной схеме в качестве второго источника углерода может использоваться ацетат натрия, а также уксусная кислота. В этом случае на первой стадии роста процесс идёт с использованием глюкозы. Затем, когда глюкоза заканчивается, в аппарат добавляют ацетат натрия до конечной концентрации 2,0-6,0 г/л, с последующим поддержанием рН среды на заданном уровне (как правило, это 7,2-8,0) 50% водным раствором уксусной кислоты.
Измерение нитрилгидратазной активности производилось следующим образом.
мл раствора акрилонитрила с концентрацией 2% в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5) смешивался с 1 мл суспензии клеток Rhodococcus rhodochrous M33, полученной предварительным центрифугирова
- 5 032896 нием культуральной жидкости, промывкой и последующим ресуспендированием клеток в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5). Суспензия содержала от 0,08 до 0,16 мг клеток (сухой массы). Реакция протекала 10 минут при 20°С при постоянном перемешивании, после чего останавливалась добавлением 50 мкл концентрированной HCl. Концентрация образовавшегося акриламида определялась газовой хроматографией или фотометрией.
Нитрил гид ратазная активность приводится в следующих единицах:
удельная активность - в микромолях акриламида за 1 минуту на 1 миллиграмм сухой биомассы [Ед/мг];
общая активность - в микромолях акриламида за 1 минуту на миллилитр культуральной жидкости [Ед/мл].
Приготовление инокулята осуществлялось по следующей технологии.
Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous M33 выращивали на скошенном мясо-пептонном агаре при 30°С в течение 24 часов и суспендировали в 3 мл физиологического раствора. Полученной суспензией в объёме 1 мл инокулировали колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,01; MgSO4-7H2O - 1,0; мочевина - 4,0; глюкоза - 12,0. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе и 30°С в течение 48 ч. Полученную культуральную жидкость использовали для инокулирования колб и ферментёров во всех последующих экспериментах.
Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 при различных концентрациях источника углерода в лабораторных условиях.
Колбы Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащие 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 20,0-120,0, инокулировали 0,5 мл инокулята. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе при 180 об/мин и 30°С. Определяли суммарный выход биомассы и нитрилгидратазную активность клеток. Полученные данные приведены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, с увеличением концентрации глюкозы от 20 до 120 г/л в среде происходит увеличение выхода биомассы и общей нитрилгидратазной активности.
Таблица 1
Концентрация глюкозы (г/л) Выход сухой биомассы (г/л) Время роста (ч) Нитрилгидратазная активность
Специфическая активность (Ед/мл) Общая активность (Ед/мл)
20 7,6 72 241,2 1833,1
30 11,6 72 249,2 2890,1
40 15,8 72 258,9 4090,6
50 20 72 277,4 5548
60 24 96 312,5 7500
70 28,6 96 284,9 8148,1
............
Пример 2. Сравнительное культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 в лабо раторных условиях.
Колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7^O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoC^^O - 0,06; MgSO4-7^O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0, и колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS1 следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; аспартат Fe2+ - 0,11; ЭДТА Na - 0,2; аспартат Со2+ - 0,084; аспартат Mg2+ - 1,17; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0, инокулировали 0,5 мл инокулята. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе при 180 об/мин и 30°С в течение 96 часов. Определяли суммарный выход биомассы и нитрилгидратазную активность клеток. Полученные данные приведены в табл. 2.
Как видно из таблицы 2, замена неорганических солей железа, кобальта и магния на соответствующие аспартаты не только увеличивает общую нитрилгидратазную активность на 12%, но и предотвращает падение специфической нитрилгидратазной активности на стационарной фазе.
- 6 032896
Таблица 2
Время роста (ч) Среда MS Среда MS-1
Выход сухой биомассы (г/л) Нитрил гидратазная активность Выход сухой биомассы (г/л) Нитрилгидратазная активность
Специфическа я активность (Ед/мл) Общая активность (Ед/мл) Специфическа я активность (Ед/мл) Общая активность (Ед/мл)
24 1,8 88 158,4 1,8 86,6 155,9
48 12,6 122,7 1546 12,6 117,2 1476,7
72 15,8 258,9 4090,6 16 290,2 4643,2
96 14 179,4 2511,6 15 234,3 3514,5
Пример 3. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 на среде, содержащей аспарагиновую кислоту в лабораторных условиях.
В колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0, внесли 2 г/л аспарагиновой кислоты. Колбу инокулировали 0,5 мл инокулята. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе при 180 об/мин и 30°С. Через 72 ч культивирования было получено 16,2 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 290,3 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 4702,9 Ед/мл.
Таким образом, введение в среду культивирования аспарагиновой кислоты привело к увеличению нитрилгидратазной активности и урожаю сухих клеток на 12,1 и 2,5% соответственно. Общая нитрилгидратазная активность выросла на 15%.
Пример 4. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 на среде, содержащей аспарагиновую кислоту в лабораторном ферментере.
Трёхлитровый лабораторный ферментёр, содержащий 1,5 л среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 20,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 50 мл инокулята. Культивирование проводили при 30°С и аэрации 0,5 мин-1. Число оборотов мешалки регулировали так, чтобы концентрация растворённого кислорода поддерживалась на уровне 50%. Когда глюкоза в среде закончилась, в аппарат внесли 4 г/л ацетата натрия и стали поддерживать рН на уровне 7,8 50% водным раствором уксусной кислоты. Через 72 ч культивирования было получено 22,3 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 340,6 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 7595,4 Ед/мл.
Пример 5. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 с дробным внесением источника углерода в лабораторном ферментере.
Трёхлитровый лабораторный ферментёр, содержащий 1,5 л среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 50 мл инокулята. Культивирование проводили при 30°С и аэрации 0,5 мин-1. Число оборотов мешалки регулировали так, чтобы концентрация растворённого кислорода в среде поддерживалась на уровне 50%. На 30 и 40 ч роста в аппарат добавляли ещё по 40 г/л глюкозы в виде 40% раствора. Суммарная концентрация глюкозы составила 120 г/л. Через 72 ч культивирования было получено 45,1 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 189,8 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 8560 Ед/мл.
Пример 6. Культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 с дробным внесением источника углерода в промышленных условиях.
Промышленный ферментёр объёмом 50 м3, содержащий 35 м3 среды MS следующего состава (г/л): Н3РО4 (100%) - 3,45; KOH-0,7; NaOH - 2,0; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O - 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 1,0 м3 инокулята. Ферментацию проводили при 28 - 30°С и аэрации 0,5 мин-1.
На 30 ч роста в аппарат ввели ещё 20,0 г/л глюкозы. Через 64 ч культивирования было получено 23 г/л сухих клеток с удельной нитрилгидратазной активностью 296 Ед/мг. Общая активность составила 6808 Ед/мл.
Пример 7. Культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 с использованием двух источников углерода в промышленных условиях.
Промышленный ферментёр объёмом 50 м3, содержащий 35 м3 среды MS следующего состава (г/л): Н3РО4 (100%) - 3,45; KOH - 0,7; NaOH - 2,0; FeSO4-7H2O -0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O - 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 1,0 м3 инокулята. Ферментацию проводили при 28 - 30°С и аэрации 0,5 мин-1. На 26 ч роста в аппарат ввели ещё
- 7 032896
20,0 г/л глюкозы. Когда глюкоза в среде закончилась, в аппарат внесли 4 г/л ацетата натрия и в дальнейшем поддерживали рН на уровне 7,8 50% водным раствором уксусной кислоты. Через 72 ч культивирования было получено 24,0 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 304,2 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 7300,8 Ед/мл.
Предлагаемый способ обеспечивает более эффективное промышленное получение биомассы штаммов-продуцентов Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой общей нитрилгидратазной активностью. При этом исключается необходимость использования ростовых факторов и дорогостоящих индукторов.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающийся тем, что указанный микроорганизм культивируют в среде, включающей анионы аспарагиновой кислоты, а также ионы металлов - железа, магния и кобальта.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что источником ионов железа, магния или кобальта являются, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).
  4. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что неорганическая соль металла представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.
  5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что неорганическая соль представляет собой FeSO4, MgSO4, CoCl2 и/или их гидраты.
  6. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния и/или аспартат кобальта.
  7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником по меньшей мере одного из ионов металлов является его неорганическая соль.
  8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты в среде составляет 0,076-3,0 г/л.
  9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования через 30-40 ч от начала культивирования в среду дополнительно вносят глюкозу так, чтобы суммарное количество глюкозы в среде не превышало 120,0 г/л.
  10. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в среду культивирования дополнительно вносят ацетат натрия так, чтобы суммарное количество внесенного ацетата натрия не превышало 6,0 г/л.
  11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что рН среды поддерживают на заданном уровне раствором уксусной кислоты.
  12. 12. Среда для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающаяся тем, что включает источник анионов аспарагиновой кислоты, а также источники ионов металлов - железа, магния и кобальта.
  13. 13. Среда для культивирования по п.12, в которой источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.
  14. 14. Среда для культивирования по п.13, в которой источником ионов железа, магния или кобальта являются, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).
  15. 15. Среда для культивирования по п.13, в которой неорганическая соль представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.
  16. 16. Среда для культивирования по п.15, в которой неорганическая соль представляет собой FeSO4, MgSO4, CoCl2 и/или их гидраты.
  17. 17. Среда для культивирования по п.12, в которой источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния и/или аспартат кобальта.
  18. 18. Среда для культивирования по п.12, в которой источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником по меньшей мере одного из ионов металлов является его неорганическая соль.
  19. 19. Среда для культивирования по п.12, в которой суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты составляет 0,076-3,0 г/л.
  20. 20. Среда для культивирования по п.12, содержащая, г/л:
    Na2HPO4-12H2O - 2,2-13,4;
    - 8 032896
    KH2PO4 - 0,5-3,1;
    FeSO4-7H2O - 0,01-0,3;
    ЭДТА Na - 0,02-0,6;
    CoCl2-6H2O - 0,01-0,08;
    MgSO4-7H2O - 0,05-2,5;
    мочевина - 4,0-20,0;
    глюкоза - 12,0-120,0;
    аспарагиновая кислота - 0,076-3,0;
    вода - остальное.
  21. 21. Среда для культивирования по п.12, содержащая, г/л:
    Na2HPO4-12H2O - 2,2-13,4;
    KH2PO4 - 0,5-3,1;
    аспартат железа (II) - 0,011-0,33;
    ЭДТА Na - 0,02-0,6;
    аспартат кобальта (II) - 0,014-0,11;
    аспартат магния (II) - 0,06-2,9;
    мочевина - 4,0-20,0;
    глюкоза - 12,0-120,0;
    вода - остальное.
    Евразийская патентная организация, ЕАПВ
    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA201700300A 2017-06-15 2017-06-15 Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33 EA032896B1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201700300A EA032896B1 (ru) 2017-06-15 2017-06-15 Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201700300A EA032896B1 (ru) 2017-06-15 2017-06-15 Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201700300A1 EA201700300A1 (ru) 2018-12-28
EA032896B1 true EA032896B1 (ru) 2019-07-31

Family

ID=64948929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201700300A EA032896B1 (ru) 2017-06-15 2017-06-15 Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA032896B1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661456A (en) * 1983-10-13 1987-04-28 Nitto Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Method for cultivation of pseudomonas bacteria
US20070184543A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Georgia State University Research Foundation Induction and Stabilization of Enzymatic Activity in Microorganisms
RU2340667C2 (ru) * 2003-04-03 2008-12-10 ЭШЛЭНД ЛАЙСЕНСИНГ ЭНД ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ ПРОПЕРТИ ЭлЭлСи СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА Rhodococcus rhodochrous МЗЗ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО НИТРИЛГИДРАТАЗУ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661456A (en) * 1983-10-13 1987-04-28 Nitto Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Method for cultivation of pseudomonas bacteria
RU2340667C2 (ru) * 2003-04-03 2008-12-10 ЭШЛЭНД ЛАЙСЕНСИНГ ЭНД ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ ПРОПЕРТИ ЭлЭлСи СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА Rhodococcus rhodochrous МЗЗ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО НИТРИЛГИДРАТАЗУ
US20070184543A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Georgia State University Research Foundation Induction and Stabilization of Enzymatic Activity in Microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
EA201700300A1 (ru) 2018-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Bioproduction of glycolic acid from glycolonitrile with a new bacterial isolate of Alcaligenes sp. ECU0401
ES2376218T3 (es) Cepa de rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 y su uso como productor de nitrilo hidratasa.
Fu et al. Enhancement of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using a two-stage dissolved oxygen control strategy
CN1034129C (zh) 有机酸的生物生产方法
RU2520870C1 (ru) Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида
Chen et al. Effect of oxygen transfer on lipase production by Acinetobacter radioresistens
CN105378059B (zh) 产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法
CN103361389A (zh) 丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的好氧生产方法
Raj et al. Rhodococcus rhodochrous PA-34: a potential biocatalyst for acrylamide synthesis
Li et al. A novel strategy for acetonitrile wastewater treatment by using a recombinant bacterium with biofilm-forming and nitrile-degrading capability
KR101116451B1 (ko) 니트릴 수화효소-생산 균주 로도코쿠스 로도크로우스 ｍ３３의 배양 방법
Brandao et al. Nitrile hydrolysing activities of deep-sea and terrestrial mycolate actinomycetes
Gong et al. Isolation, identification, and culture optimization of a novel glycinonitrile-hydrolyzing fungus—Fusarium oxysporum H3
Naik et al. Studies on the production of enantioselective nitrilase in a stirred tank bioreactor by Pseudomonas putida MTCC 5110
EA032896B1 (ru) Способ культивирования штамма rhodococcus rhodochrous m33
JP2003210164A (ja) カプサイシン分解合成酵素及びその生産方法
Ravi Kant et al. Production and characterization of acyl transfer activity of amidase from Alcaligenes sp. MTCC 10674 for synthesis of hydroxamic acids
JP2670838B2 (ja) Ｌ―α―アミノ酸類の製造方法
JPH04320679A (ja) Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを生産する微生物、微生物学的に生産されたｌ‐カルニチン‐アミダーゼ、その取得方法およびｌ‐カルニチンへのｄｌ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方法
Maksimov et al. Effects of nitriles and amides on the growth and nitrile hydratase activity of the Rhodococcus sp. strain gt1
Su et al. High‐level production of Arthrobacter aurescens CYC705 nitrilase in Escherichia coli for biosynthesis of iminodiacetic acid
Pawlak et al. Feeding profile is not the sole factor influencing lovastatin production by Aspergillus terreus ATCC20542 in a continuous fed-batch stirred tank bioreactor
JPS6143998B2 (ru)
CA3109885A1 (en) Rhodococcus rhodochrous strain and use thereof in the production of acrylic acid
Kim et al. Fed-batch fermentation for production of nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM