EA032896B1 - Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33 - Google Patents

Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33 Download PDF

Info

Publication number
EA032896B1
EA032896B1 EA201700300A EA201700300A EA032896B1 EA 032896 B1 EA032896 B1 EA 032896B1 EA 201700300 A EA201700300 A EA 201700300A EA 201700300 A EA201700300 A EA 201700300A EA 032896 B1 EA032896 B1 EA 032896B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aspartate
iron
aspartic acid
magnesium
cobalt
Prior art date
Application number
EA201700300A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA201700300A1 (en
Inventor
Игорь Николаевич Сингирцев
Татьяна Александровна Сингирцева
Андрей Анатольевич Синтин
Максим Константинович СИНОЛИЦКИЙ
Сергей Петрович ВОРОНИН
Владимир Георгиевич ДЕБАБОВ
Александр Степанович ЯНЕНКО
Original Assignee
Акционерное Общество "Биоамид"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное Общество "Биоамид" filed Critical Акционерное Общество "Биоамид"
Priority to EA201700300A priority Critical patent/EA032896B1/en
Publication of EA201700300A1 publication Critical patent/EA201700300A1/en
Publication of EA032896B1 publication Critical patent/EA032896B1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to bio technologies and concerns a laboratory and commercial method for cultivating the Rhodococcus rhodochrous M33, a producer of nitrile hydratase. The cultivating method comprises addition of sources of asparagine acid anions and metal ions, i.e. iron, magnesium and cobalt ions, to the culture medium. The invention also includes a medium for cultivating the Rhodococcus rhodochrous M33 containing a source of asparagine acid anions and sources of metal ions of iron, magnesium and cobalt. The invention makes it possible to commercially produce a biomass of the Rhodococcus rhodochrous M33 producing strains having high nitrile hydratase activity.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается лабораторного и промышленного способа культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M33.The invention relates to the field of biotechnology and relates to a laboratory and industrial method of cultivating a strain of Rhodococcus rhodochrous M33.

Уровень техникиState of the art

В настоящее время широко используются полимеры и сополимеры акриламида. Однако мировая потребность в этих продуктах удовлетворена не полностью и ежегодно увеличивается на 4-5%. В отличие от традиционных химических способов, биокаталитический способ производства акриламида имеет ряд важных преимуществ: высокую специфичность и селективность, одностадийность, малую энергоемкость, отсутствие побочных продуктов синтеза, технологических стоков и вредных отходов. Всё более активно применяются технологии промышленного производства акриламида с использованием биокатализаторов на основе штаммов-продуцентов фермента нитрилгидратазы. Расширение исследований бактериальных штаммов, метаболизирующих нитрилы, обусловлено необходимостью улучшения способа производства акриламида, а также перспективой применения микроорганизмов для получения ряда других коммерчески значимых соединений.Currently, polymers and copolymers of acrylamide are widely used. However, the global demand for these products is not fully satisfied and is increasing annually by 4-5%. Unlike traditional chemical methods, the biocatalytic method for the production of acrylamide has several important advantages: high specificity and selectivity, one-stage, low energy consumption, the absence of synthesis by-products, technological effluents, and hazardous waste. Technologies for the industrial production of acrylamide using biocatalysts based on strains producing nitrile hydratase enzyme are increasingly being applied. The expansion of studies of bacterial strains metabolizing nitriles is due to the need to improve the method of acrylamide production, as well as the prospect of using microorganisms to obtain a number of other commercially significant compounds.

Наряду с поиском новых штаммов, продуцирующих фермент нитрилгидратазу, большое внимание уделяется способу культивирования этих микроорганизмов. Это нужно для того, чтобы иметь возможность получать каталитически активную биомассу в промышленных масштабах. Для повышения выхода ферментативной активности на единицу объёма культуральной жидкости обычно используют два основных метода:Along with the search for new strains producing the nitrile hydratase enzyme, much attention is paid to the method of cultivation of these microorganisms. This is necessary in order to be able to obtain catalytically active biomass on an industrial scale. To increase the yield of enzymatic activity per unit volume of culture fluid, two main methods are usually used:

1) активация синтеза фермента бактериальной клеткой или, другими словами, повышение удельной ферментативной активности (Ед/мг сухой биомассы);1) activation of the synthesis of the enzyme by a bacterial cell or, in other words, an increase in the specific enzymatic activity (U / mg dry biomass);

2) повышение выхода активных клеток (активной биомассы) на единицу объема культуральной жидкости.2) increasing the yield of active cells (active biomass) per unit volume of culture fluid.

В патенте GB2087926 описан способ культивирования штамма Corynebacterium N-774 (регистрационный номер FERM 4446 в Fermentation Research Institute). Штамм культивируется в питательной среде, содержащей водорастворимые соединения железа в концентрациях, как минимум, 0,2 мг/л вместе с 1% казеинового гидролизата (казаминовые кислоты). Недостатками этого способа являются высокая стоимость казеиновых гидролизатов и получаемая низкая нитрилгидратазная активность биомассы (специфическая активность = 53,3 Ед/мг, сухая биомасса = 5,66 мг/мл, общая активность = 301,7 Ед/мл).GB2087926 describes a method for culturing a strain of Corynebacterium N-774 (registration number FERM 4446 at the Fermentation Research Institute). The strain is cultivated in a nutrient medium containing water-soluble iron compounds in concentrations of at least 0.2 mg / l, together with 1% casein hydrolyzate (casamic acids). The disadvantages of this method are the high cost of casein hydrolysates and the resulting low nitrile hydratase activity of the biomass (specific activity = 53.3 U / mg, dry biomass = 5.66 mg / ml, total activity = 301.7 U / ml).

Известно, что нитрилы и амиды органических кислот, в особенности пропионовой и изомасляной, вызывают индукцию синтеза нитрилгидратазы. Об этом можно сделать вывод на основании данных патента US4555487, в котором показано, что добавление веществ, известных в качестве индукторов синтеза нитрилгидратазы, к культуральной среде штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM ВР-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), делает возможным получение биомассы, обладающей нитрилгидратазной активностью (сухая биомасса - 5,36 г/л, специфическая активность - 62,65 Ед/мг, общая активность 335,8 Ед/мл).It is known that nitriles and amides of organic acids, in particular propionic and isobutyric, induce the synthesis of nitrile hydratase. This can be concluded on the basis of the data of US4555487, which shows that the addition of substances known as nitrile hydratase synthesis inducers to the culture medium of the strain Pseudomonas chlororaphis B 23 (FERM BP-187) and the strain Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), makes it possible to obtain biomass with nitrile hydratase activity (dry biomass - 5.36 g / l, specific activity - 62.65 U / mg, total activity 335.8 U / ml).

Недостатки, присущие этому способу, связаны с использованием дорогостоящих индукторов и получением клеток с низкой нитрилгидратазной активностью.The disadvantages inherent in this method are associated with the use of expensive inducers and obtaining cells with low nitrile hydratase activity.

Культуральная среда для инкубации штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM ВР-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188) содержит не только индукторы, но также одну или более α-аминокислот, таких как цистеин, аланин, валин, метионин и др., в концентрациях от 0,1 до 10,0 г/л в качестве агентов, повышающих ферментативную активность. Тем не менее, удельная активность биомассы, полученной этим способом по патенту ЕР0115781, не превышает 105,7 Ед/мг, а общая активность не превышает 428,1 Ед/мл.The culture medium for incubation of the strain Pseudomonas chlororaphis B 23 (FERM BP-187) and the strain Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188) contains not only inducers, but also one or more α-amino acids, such as cysteine, alanine, valine, methionine, etc., in concentrations from 0.1 to 10.0 g / l as agents that increase enzymatic activity. However, the specific activity of the biomass obtained by this method according to patent EP0115781 does not exceed 105.7 U / mg, and the total activity does not exceed 428.1 U / ml.

Более высокая нитрилгидратазная активность была достигнута при инкубации штамма Rhodococcus rhodochrous M33 (патент DE4480132). В описании к патенту указано, что при культивировании штамма на синтетической питательной среде, содержащей глюкозу в концентрации 5 г/л, вполне возможно получить клетки, обладающие нитрилгидратазной активностью до 200 Ед/мг и общей активностью до 360 Ед/мл. Важным преимуществом предложенного способа является простота питательной среды, которая не содержит каких-либо дорогих компонентов. Однако повышение концентрации глюкозы до 20 г/л приводит к повышению общей активности до значения, не превышающего 1368 Ед/мл.Higher nitrile hydratase activity was achieved by incubating the strain Rhodococcus rhodochrous M33 (patent DE4480132). In the description of the patent it is indicated that when cultivating the strain on a synthetic nutrient medium containing glucose at a concentration of 5 g / l, it is quite possible to obtain cells with nitrile hydratase activity of up to 200 U / mg and a total activity of up to 360 U / ml. An important advantage of the proposed method is the simplicity of the nutrient medium, which does not contain any expensive components. However, an increase in glucose concentration to 20 g / l leads to an increase in total activity to a value not exceeding 1368 U / ml.

В патенте RU2223316 описан способ культивирования штамма Rhodococcus ruber GT, способного продуцировать нитрилгидратазу с активностью 330 Ед/мг. Культивирование осуществляется на среде, содержащей ионы Fe2+ и ацетонитрил в качестве индуктора. Недостатком этого способа является невозможность получать более или менее значительные выходы биомассы.RU2223316 describes a method for culturing a strain of Rhodococcus ruber GT capable of producing nitrile hydratase with an activity of 330 U / mg. Cultivation is carried out on a medium containing Fe 2+ ions and acetonitrile as an inductor. The disadvantage of this method is the inability to obtain more or less significant biomass yields.

В патенте RU2403280 описан способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, показывающего нитрилгидратазную активность 323 Ед/мг при 30°С. Среда для его культивирования содержит ацетонитрил - как индуктор и дрожжевой экстракт - как источник ростовых факторов. Однако и этот способ культивирования предназначен только для лабораторных условий и не подходит для промышленности.Patent RU2403280 describes a method for culturing a strain of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 showing nitrile hydratase activity of 323 U / mg at 30 ° C. The medium for its cultivation contains acetonitrile - as an inducer and yeast extract - as a source of growth factors. However, this method of cultivation is intended only for laboratory conditions and is not suitable for industry.

В патенте ЕР0362829 описан способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478). При культивировании клеток этого штамма на питательной среде, содержащей соединенияEP0362829 describes a method for cultivating a strain of Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478). When culturing cells of this strain on a nutrient medium containing compounds

- 1 032896 двухвалентного кобальта и мочевину в концентрации 15 г/л, удалось получить биомассу, показывающую удельную активность 578 Ед/мг. Для повышения выхода клеток в питательную среду добавляли пептон и дрожжевой экстракт. Тем не менее, выход сухой биомассы составил всего лишь 4,3 г/л, и достигнутая общая активность не превышала 2480 Ед/мл. Масштабирование процесса культивирования до производственных условий повышало выход клеток до 28 г/л, но это сопровождалось снижением удельной нитрилгидратазной активности до 76 Ед/мг и уменьшением общей активности до 2100 Ед/мл (см. Yamada H., Kobayashi M., Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide, Biosci. Biotech. Biochem., 60(9), 1391-1400, 1996).- 1 032896 of bivalent cobalt and urea at a concentration of 15 g / l, it was possible to obtain a biomass showing a specific activity of 578 U / mg. To increase the yield of cells in the nutrient medium, peptone and yeast extract were added. Nevertheless, the yield of dry biomass was only 4.3 g / l, and the achieved total activity did not exceed 2480 U / ml. Scaling the cultivation process to production conditions increased the yield of cells to 28 g / l, but this was accompanied by a decrease in specific nitrile hydratase activity to 76 U / mg and a decrease in total activity to 2100 U / ml (see Yamada H., Kobayashi M., Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide, Biosci. Biotech. Biochem., 60 (9), 1391-1400, 1996).

Другой способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M33 характеризуется тем, что клетки штамма культивируются в 5-тилитровом ферментёре на полностью синтетической среде, состоящей из KH2PO4, K2HPO4, FeSO4-7H2O, ЭДТА-2№1. MgSO4-7H2O, NaCl, CoCl2-6H2O, мочевины и глюкозы. Путем постоянного регулирования подачи 40% раствора глюкозы и трех периодических добавок CoCl2-6H2O (по 0,01 г/л каждая) были достигнуты выход клеток 24 г/л и удельная нитрилгидратазная активность 120 Ед/мг. Однако общая активность после относительно длительного времени ферментации (115 часов) не превышала 2880 Ед/мл (см. Kim B-Y, Kim J-C, Lee H-H., Hyun H-H., Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33, Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 1117, 2001).Another method of cultivating the strain Rhodococcus rhodochrous M33 is characterized in that the cells of the strain are cultured in a 5-liter fermenter on a fully synthetic medium consisting of KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , FeSO 4 -7H 2 O, EDTA-2 No. 1. MgSO 4 -7H 2 O, NaCl, CoCl 2 -6H 2 O, urea and glucose. By continuously regulating the supply of a 40% glucose solution and three periodic additions of CoCl 2 -6H 2 O (0.01 g / l each), a cell yield of 24 g / l and a specific nitrile hydratase activity of 120 U / mg were achieved. However, the total activity after a relatively long fermentation time (115 hours) did not exceed 2880 U / ml (see Kim BY, Kim JC, Lee HH., Hyun HH., Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33, Biotechnol Bioprocess Eng., 6: 1117, 2001).

Способ, отвечающий промышленным требованиям, описан в патенте RU2340667. Штамм Rhodococcus rhodochrous M33 культивировали в 15 м3 ферментёре на среде, содержащей кукурузный экстракт как источник факторов роста, мочевину и CoCl2-6H2O в качестве индукторов и глюкозу в качестве источника углерода. Через 24 - 36 часов после начала культивирования и потребления всей глюкозы в среду добавляли 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl2-6H2O; рН среды культивирования поддерживали на уровне 7,9 добавлением водного раствора уксусной кислоты. После 72 ч ферментации было получено 18,8 г/л сухой биомассы с нитрилгидратазной активностью 290 Ед/мг. Общая активность составила 5452 Ед/мл Однако, в связи со все возрастающей потребностью в биокатализаторах, гидролизующих нитрил акриловой кислоты до акриламида, проблема повышения нитрилгидратазной активности штаммов остается актуальнойA method that meets industry requirements is described in patent RU2340667. The strain Rhodococcus rhodochrous M33 was cultured in a 15 m 3 fermenter in a medium containing corn extract as a source of growth factors, urea and CoCl 2 -6H 2 O as inducers and glucose as a carbon source. After 24 to 36 hours after the start of cultivation and consumption of all glucose, 6 g / L of urea, 3 g / L of sodium acetate and 0.03 g / L of CoCl 2 -6H 2 O were added to the medium; The pH of the culture medium was maintained at 7.9 by the addition of an aqueous solution of acetic acid. After 72 hours of fermentation, 18.8 g / L dry biomass with a nitrile hydratase activity of 290 U / mg was obtained. The total activity was 5452 U / ml. However, due to the increasing need for biocatalysts hydrolyzing acrylate nitrile to acrylamide, the problem of increasing the nitrile hydratase activity of the strains remains relevant

Раскрытие изобретенияDisclosure of Invention

Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного промышленного способа получения большого количества биомассы штамма Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой общей нитрилгидратазной активностью.The objective of the present invention is to develop an effective industrial method for producing a large amount of biomass of the strain Rhodococcus rhodochrous M33 with high total nitrile hydratase activity.

Поставленная задача решается путем разработки способа культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающегося тем, что используемая среда культивирования включает анионы аспарагиновой кислоты, а также ионы металлов - железа, магния и кобальта.The problem is solved by developing a method for the cultivation of Rhodococcus rhodochrous M33, a producer of nitrile hydratase, characterized in that the cultivation medium used includes anions of aspartic acid, as well as metal ions - iron, magnesium and cobalt.

В некоторых вариантах изобретения источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.In some embodiments of the invention, the sources of metal ions are metal aspartates and / or inorganic metal salts.

В некоторых частных вариантах изобретения источником, по меньшей мере, одного из ионов железа, магния или кобальта является, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).In some particular embodiments, the source of at least one of the iron, magnesium, or cobalt ions is, respectively, iron (II) aspartate, iron (III) aspartate, magnesium (II) aspartate, or cobalt (II) aspartate.

В некоторых частных вариантах изобретения неорганическая соль металла представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.In some particular embodiments, the inorganic metal salt is sulfate, chloride, and / or hydrates thereof.

В некоторых частных вариантах изобретения неорганическая соль представляет собой FeSO4, MgSO4, CoCl2 и/или их гидраты.In some particular embodiments, the inorganic salt is FeSO 4 , MgSO 4, CoCl 2, and / or their hydrates.

В некоторых вариантах изобретения источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния, и/или аспартат кобальта.In some embodiments of the invention, the source of aspartic acid anions is aspartic acid, iron aspartate, magnesium aspartate, and / or cobalt aspartate.

В некоторых вариантах изобретения источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником, по меньшей мере одного, из ионов металлов является его неорганическая соль.In some embodiments of the invention, the source of anions of aspartic acid is aspartic acid, and the source of at least one of the metal ions is its inorganic salt.

В некоторых вариантах изобретения суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты в среде составляет 0,076-3,0 г/л.In some embodiments of the invention, the total concentration of anions of aspartic acid in the medium is 0.076-3.0 g / L.

В некоторых вариантах изобретения в процессе культивирования через 30-40 ч от начала культивирования в среду дополнительно вносят глюкозу так, чтобы суммарное количество глюкозы в среде не превышало 120,0 г/л.In some embodiments of the invention, in the course of cultivation, after 30-40 hours from the start of cultivation, glucose is additionally added to the medium so that the total amount of glucose in the medium does not exceed 120.0 g / l.

В некоторых вариантах изобретения в среду культивирования дополнительно вносят ацетат натрия так, чтобы суммарное количество внесенного ацетата натрия не превышало 6,0 г/л.In some embodiments of the invention, sodium acetate is additionally added to the culture medium so that the total amount of sodium acetate added does not exceed 6.0 g / L.

В некоторых частных вариантах изобретения рН среды поддерживают на заданном уровне раствором уксусной кислоты.In some particular embodiments of the invention, the pH of the medium is maintained at a predetermined level by an acetic acid solution.

Поставленная задача решается также путем разработки среды для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающейся тем, что среда включает источник анионов аспарагиновой кислоты, а также источники ионов металлов - железа, магния и кобальта.The problem is also solved by developing a culture medium for the cultivation of Rhodococcus rhodochrous M33, a producer of nitrile hydratase, characterized in that the medium includes a source of aspartic acid anions, as well as sources of metal ions - iron, magnesium and cobalt.

В некоторых вариантах изобретения в среде культивирования источники ионов металлов представIn some embodiments of the invention, in a culture medium, metal ion sources are provided

- 2 032896 ляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.- 2 032896 are metal aspartates and / or inorganic metal salts.

В некоторых частных вариантах изобретения в среде для культивирования, источником по меньшей мере, одного из ионов железа, магния или кобальта является, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).In some particular embodiments of the invention, in a culture medium, the source of at least one of the iron, magnesium, or cobalt ions is, respectively, iron (II) aspartate, iron (III) aspartate, magnesium (II) aspartate, or cobalt (II) aspartate .

В некоторых частных вариантах изобретения в среде для культивирования неорганическая соль представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.In some particular embodiments of the invention, in the culture medium, the inorganic salt is sulfate, chloride and / or hydrates thereof.

В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования неорганическая соль представляет собой FeSO4, CoCl2-MgSO4 и/или их гидраты.In some embodiments of the invention in a culture medium, the inorganic salt is FeSO 4 , CoCl 2 — MgSO 4 and / or their hydrates.

В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния, и/или аспартат кобальта.In some embodiments of the invention, in a culture medium, the source of aspartic acid anions is aspartic acid, iron aspartate, magnesium aspartate, and / or cobalt aspartate.

В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником, по меньшей мере одного из ионов металлов является его неорганическая соль.In some embodiments of the invention, in the culture medium, the source of aspartic acid anions is aspartic acid, and the source of at least one of the metal ions is its inorganic salt.

В некоторых вариантах изобретения в среде для культивирования суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты составляет 0,076-3,0 г/л.In some embodiments of the invention, in the culture medium, the total concentration of anions of aspartic acid is 0.076-3.0 g / L.

В некоторых частных вариантах изобретения среда для культивирования содержит, г/л:In some particular embodiments of the invention, the culture medium comprises, g / l:

Na2HPO4-12H2O - 2,2 - 13,4;Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 2.2 - 13.4;

КН2РО4 - 0,5 — 3,1;KN 2 RO 4 - 0.5 - 3.1;

FeSO4-7H2O- 0,01 — 0,3;FeSO 4 -7H 2 O- 0.01-0.3;

ЭДТА Na (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) - 0,02 — 0,6;EDTA Na (sodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid) - 0.02 - 0.6;

СоС12-6Н2О - 0,01 - 0,08;CoCl 2 -6H 2 O - 0.01 - 0.08;

MgSO4-7H2O - 0,05 - 2,5;MgSO 4 -7H 2 O - 0.05 - 2.5;

мочевина- 4,0 — 20,0;urea - 4.0 - 20.0;

глюкоза -12,0 — 120,0;glucose -12.0 - 120.0;

аспарагиновая кислота - 0,076 — 3,0;aspartic acid - 0.076 - 3.0;

вода - остальное.water is the rest.

В некоторых других частных вариантах изобретения среда для культивирования содержит, г/л:In some other particular embodiments of the invention, the culture medium comprises, g / l:

Na2HPO4 12Н2О - 2,2 -13,4;Na 2 HPO 4 12H 2 O - 2.2 -13.4;

КН2РО4-0,5 —3,1;KH 2 PO 4 -0.5-3.1;

аспартат железа(Н) - 0,011—0,33;iron aspartate (H) - 0.011-0.33;

ЭДТА Na - 0,02 — 0,6;EDTA Na - 0.02 - 0.6;

аспартат кобальта(П) - 0,014 - 0,11;cobalt aspartate (P) - 0.014 - 0.11;

аспартат магния(П) - 0,06 - 2,9;magnesium aspartate (P) - 0.06 - 2.9;

мочевина - 4,0 — 20,0;urea - 4.0 - 20.0;

глюкоза-12,0 — 120,0;glucose-12.0 - 120.0;

вода - остальное.water is the rest.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты: увеличены выход активной биомассы Rhodococcus rhodochrous M33 и нитрилгидратазная активность Rhodococcus rhodochrous M33;As a result of the invention, the following technical results are achieved: the yield of the active biomass of Rhodococcus rhodochrous M33 and the nitrile hydratase activity of Rhodococcus rhodochrous M33 are increased;

разработана среда для Rhodococcus rhodochrous M33, позволяющая культивировать штаммпродуцент без внесения в среду ростовых факторов;a medium was developed for Rhodococcus rhodochrous M33, which allows cultivating strain producer without introducing growth factors into the medium;

разработан способ промышленного культивирования Rhodococcus rhodochrous M33, обеспечивающий высокую ферментативную активность;a method of industrial cultivation of Rhodococcus rhodochrous M33 has been developed, providing high enzymatic activity;

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение направлено на создание эффективного промышленного способа получения биомассы Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой общей нитрилгидратазной активностью.The present invention is directed to an effective industrial method for producing biomass of Rhodococcus rhodochrous M33 with high total nitrile hydratase activity.

Заявленный способ заключается в разработке условий культивирования, а также создании среды культивирования без использования ростовых факторов и дорогостоящих индукторов, обеспечивающих увеличение выхода биомассы и высокую общую нитрилгидратазную активность Rhodococcus rhodochrous M33.The claimed method consists in the development of cultivation conditions, as well as the creation of a culture medium without the use of growth factors and expensive inductors that provide increased biomass yield and high total nitrile hydratase activity of Rhodococcus rhodochrous M33.

Для получения биомассы штамма Rhodococcus rhodochrous M33 необходимо разработать среду культивирования, полностью удовлетворяющую ростовые потребности клеток. В процессе исследований было отдано предпочтение синтетической среде, не содержащей дорогостоящих индукторов и источников ростовых факторов, так как источники ростовых факторов отличаются по составу в зависимости от производителя, причём точный состав определить практически невозможно.To obtain the biomass of the strain Rhodococcus rhodochrous M33, it is necessary to develop a culture medium that fully meets the growth needs of the cells. In the research process, preference was given to a synthetic medium that does not contain expensive inductors and sources of growth factors, since the sources of growth factors differ in composition depending on the manufacturer, and it is almost impossible to determine the exact composition.

Способ заключается во внесении в среду культивирования продуцента нитрилгидратазы анионов (остатков) аспарагиновой кислоты (аспартат-ионов) и ионов металлов - железа, магния и кобальта.The method consists in introducing into the culture medium of the nitrile hydratase producer anions (residues) of aspartic acid (aspartate ions) and metal ions - iron, magnesium and cobalt.

Источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.Sources of metal ions are metal aspartates and / or inorganic metal salts.

В частных вариантах воплощения изобретения источником по меньшей мере одного из ионов железа, магния или кобальта является, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартатIn private embodiments of the invention, the source of at least one of the ions of iron, magnesium or cobalt is, respectively, iron (II) aspartate, iron (III) aspartate, aspartate

- 3 032896 магния (II) или аспартат кобальта (II). В других вариантах воплощения изобретения источником, по меньшей мере, одного из ионов железа, магния или кобальта, является соответствующая неорганическая соль. Неорганические соли металлов могут представлять собой, в частности, сульфаты, хлориды или их гидраты. Примерами таких неорганических солей могут быть FeSO4, MgSO4, CoCl2, а также их гидраты, например: FeSO4-7^O, FeSO4-4H2O, FeSO4-H2O, CoCM^O, CoC^^O, CoCM^O, CoC^^O, CoCl2-H2O, MgSO4-12H2O, MgSO4-7^O, MgSO4-6^O, MgSO4-5H2O, MgSO4-4H2O, MgSO4-3H2O, MgSO4-2H2O, MgSO4-H2O. С целью воплощения изобретения возможно использование и других неорганических солей ионов железа, магния и кобальта, помимо вышеуказанных, при условии, что эти соли не будут оказывать негативного влияния на рост клеток штамма Rhodococcus rhodochrous M33 и синтез нитрилгидратазы. Например, FeCl2, MgCl2 и их гидраты, например, FeCl2-6H2O; FeCl2-4H2O; FeCl2-2H2O, FeCl2-H2O, MgCl2-6H2O, MgC^^O.- 3 032896 magnesium (II) or cobalt (II) aspartate. In other embodiments, the source of at least one of the ions of iron, magnesium, or cobalt is the corresponding inorganic salt. Inorganic metal salts may be, in particular, sulfates, chlorides or their hydrates. Examples of such inorganic salts are FeSO 4 , MgSO 4 , CoCl 2 , as well as their hydrates, for example: FeSO4-7 ^ O, FeSO4-4H2O, FeSO4-H2O, CoCM ^ O, CoC ^^ O, CoCM ^ O, CoC ^^ O, CoCl2-H2O, MgSO4-12H2O, MgSO4-7 ^ O, MgSO4-6 ^ O, MgSO4-5H2O, MgSO4-4H2O, MgSO4-3H2O, MgSO 4 -2H 2 O, MgSO 4 -H 2 O. In order to implement the invention, it is possible to use other inorganic salts of iron, magnesium and cobalt ions, in addition to the above, provided that these salts will not adversely affect the growth of cells of the strain Rhodococcus rhodochrous M33 and the synthesis of nitrile hydratase. For example, FeCl 2 , MgCl 2 and their hydrates, for example, FeCl 2 -6H 2 O; FeCl 2 -4H 2 O; FeCl 2 -2H 2 O, FeCl2-H2O, MgCl2-6H2O, MgC ^^ O.

Изобретение также охватывает варианты, в которых источниками ионов металлов в среде культивирования являются одновременно и аспартаты металлов, и их неорганические соли, в различных комбинациях. Например, в среду культивирования вносится аспартат железа и неорганические соли кобальта и магния; аспартат кобальта и неорганические соли железа и магния; аспартат магния и неорганические соли кобальта и железа. Также возможно включение в среду культивирования одновременно и аспартата, и неорганической соли одного из необходимых источников ионов металлов (железа, кобальта или магния), например, железа в виде аспартата и железа в виде хлорида; или, например, магния в виде аспартата вместе с магнием в виде хлорида и в виде сульфата. Источники ионов металлов вносятся в виде железа (II), железа (III), магния (II) или кобальта (II). Таким образом изобретение обеспечивает возможность использования железа(П) и железа (III), а также присутствие всех указанных металлов в среде культивирования в виде катионов металлов Со2+; Fe2+ и Mg2+.The invention also encompasses variants in which metal aspartates and their inorganic salts, in various combinations, are simultaneously sources of metal ions in the culture medium. For example, iron aspartate and inorganic cobalt and magnesium salts are introduced into the culture medium; cobalt aspartate and inorganic salts of iron and magnesium; magnesium aspartate and inorganic salts of cobalt and iron. It is also possible to include in the cultivation medium both aspartate and an inorganic salt of one of the necessary sources of metal ions (iron, cobalt or magnesium), for example, iron in the form of aspartate and iron in the form of chloride; or, for example, magnesium in the form of aspartate together with magnesium in the form of chloride and in the form of sulfate. Sources of metal ions are introduced in the form of iron (II), iron (III), magnesium (II) or cobalt (II). Thus, the invention provides the possibility of using iron (P) and iron (III), as well as the presence of all these metals in the culture medium in the form of metal cations Co 2+ ; Fe 2+ and Mg 2+ .

Источником анионов аспарагиновой кислоты в среде культивирования является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния и/или аспартат кобальта. В ряде случаев источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником по меньшей мере одного из ионов металла являются неорганические соли. Также возможно одновременное внесение в среду культивирования аспартатов металлов (железа, кобальта и магния), аспарагиновой кислоты и неорганических солей металлов (железа, кобальта и магния). Суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты в среде составляет 0,076-3,0 г/л.The source of aspartic acid anions in the culture medium is aspartic acid, iron aspartate, magnesium aspartate and / or cobalt aspartate. In some cases, the source of anions of aspartic acid is aspartic acid, and the source of at least one of the metal ions is inorganic salts. It is also possible to simultaneously add metal aspartates (iron, cobalt and magnesium), aspartic acid and inorganic metal salts (iron, cobalt and magnesium) to the culture medium. The total concentration of anions of aspartic acid in the medium is 0.076-3.0 g / l.

При внесении ионов железа, магния и кобальта в виде солей аспарагиновой кислоты и/или неорганических солей с внесением аниона аспарагиновой кислоты, анион аспарагиновой кислоты выполняет функцию транспортёра (переносчика) ионов через клеточную стенку.When iron, magnesium and cobalt ions are introduced in the form of salts of aspartic acid and / or inorganic salts with the addition of an anion of aspartic acid, the anion of aspartic acid acts as a transporter (carrier) of ions through the cell wall.

Другими обязательными компонентами среды культивирования являются источники углерода. В качестве источников углерода и энергии могут использоваться: глюкоза, уксусная кислота, ацетат натрия. В качестве источника азота и индуктора синтеза нитрилгидратазы использовали мочевину. Использование данных компонентов в среде культивирования известно из уровня техники, например, Kim B-Y, Kim J-C, Lee H-H., Hyun H-H., Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33, // Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 11-17, 2001; RU2340667. Источники углерода вводятся в среду культивирования одной или двумя частями (дробно) до конечной концентрации с определенным интервалом времени. В частности, в процессе культивирования через 30-40 ч от начала культивирования в среду дополнительно вносят глюкозу так, чтобы суммарное количество глюкозы в среде не превышало 120,0 г/л. В рамках данного изобретения предполагается также использование двухкомпонентной схемы внесения источников углерода, предполагающей использование первого источника углерода на первой стадии роста и внесение второго источника углерода после потребления первого источника углерода. В частности, в среду культивирования дополнительно вносят ацетат натрия так, чтобы суммарное количество внесенного ацетата натрия не превышало 6,0 г/л. При внесении ацетата натрия рН среды поддерживают на заданном уровне раствором уксусной кислоты.Other essential components of the culture medium are carbon sources. As sources of carbon and energy can be used: glucose, acetic acid, sodium acetate. Urea was used as a nitrogen source and an inducer of nitrile hydratase synthesis. The use of these components in a culture medium is known in the art, for example, Kim B-Y, Kim J-C, Lee H-H., Hyun H-H., Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous M33, // Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 11-17, 2001; RU2340667. Carbon sources are introduced into the culture medium in one or two parts (fractionally) to a final concentration with a certain time interval. In particular, in the course of cultivation, after 30-40 hours from the start of cultivation, glucose is additionally added to the medium so that the total amount of glucose in the medium does not exceed 120.0 g / l. It is also contemplated within the framework of the present invention to use a two-component carbon source application scheme involving the use of a first carbon source in a first growth step and introducing a second carbon source after consuming the first carbon source. In particular, sodium acetate is additionally added to the culture medium so that the total amount of sodium acetate introduced does not exceed 6.0 g / l. When sodium acetate is added, the pH of the medium is maintained at a predetermined level by an acetic acid solution.

В качестве основы среды для культивирования используется фосфатный буфер, который удовлетворяет потребности клеток штамма в фосфоре и поддерживает значение рН в заданном диапазоне.A phosphate buffer is used as the basis for the cultivation medium, which satisfies the phosphorus needs of the strain cells and maintains the pH value in a given range.

Примером среды для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 по изобретению может быть среда следующего состава (г/л):An example of a culture medium for Rhodococcus rhodochrous M33 according to the invention can be a medium of the following composition (g / l):

Na2HPO4-12H2ONa 2 HPO 4 -12H 2 O 2,2-13,4; 2.2-13.4; КН2РО4 KN 2 RO 4 0,5 —3,1; 0.5-3.1; FeSO4-7H2OFeSO 4 -7H 2 O 0,01—0,3; 0.01-0.3; ЭДТА Na EDTA Na 0,02 — 0,6; 0.02 - 0.6; CoCI2-6H20CoCI 2 -6H 2 0 0,01 -0,08; 0.01-0.08; MgSO4-7H2OMgSO 4 -7H 2 O 0,05-2,5; 0.05-2.5; Мочевина Urea 4,0 — 20,0; 4.0 to 20.0; Глюкоза Glucose 12,0 — 120,0; 12.0 - 120.0; Аспарагиновая кислота Aspartic acid 0,076 — 3,0; 0.076-3.0; Вода - остальное. Water is the rest.

- 4 032896- 4 032896

Еще одним примером среды для культивирования может быть, например, среда следующего состава (г/л):Another example of a culture medium may be, for example, a medium of the following composition (g / l):

Na2HPO4-12H2O 2,2-13,4;Na 2 HPO 4 -12H 2 O 2.2-13.4;

КН2РО4 0,5 —3,1;KH2RO4 0.5-3.1;

Аспартат железа (II) 0,011 — 0,33;Aspartate of iron (II) 0.011-0.33;

ЭДТА Na 0,02 — 0,6;EDTA Na 0.02 - 0.6;

Аспартат кобальта (II) 0,014 - 0,11;Aspartate of cobalt (II) 0.014 - 0.11;

Аспартат магния (II) 0,06 - 2,9;Aspartate of magnesium (II) 0.06 - 2.9;

Мочевина 4,0 — 20,0;Urea 4.0 - 20.0;

Глюкоза 12,0 —120,0;Glucose 12.0-120.0;

Вода - остальное.Water is the rest.

Предлагаемый способ культивирования может быть использован, предпочтительно, для культивирования микроорганизмов из рода Rhodococcus, более предпочтительно - для микроорганизмов видов Rhodococcus rhodochrous, наиболее предпочтительно - для штамма Rhodococcus rhodochrous, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Ac-1515D, далее именуемого Rhodococcus rhodochrous M33.The proposed cultivation method can be used, preferably, for the cultivation of microorganisms from the genus Rhodococcus, more preferably for microorganisms of the species Rhodococcus rhodochrous, most preferably for the strain Rhodococcus rhodochrous deposited in the All-Russian collection of microorganisms under the number VKM Ac-1515D, hereinafter referred to as Rhodococcus rhodochrous .

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

В одном из вариантов осуществления изобретения за основу среды был взят фосфатный буфер в концентрации 10-60 мМ, который поддерживал значение рН в физиологическом диапазоне 5,0-9,0. Обычно культивирование проводили в 35,3 мМ фосфатном буфере.In one embodiment of the invention, phosphate buffer at a concentration of 10-60 mM was taken as the basis of the medium, which maintained the pH value in the physiological range of 5.0-9.0. Typically, cultivation was carried out in 35.3 mm phosphate buffer.

Среда культивирования (сокращенно обозначаемая в дальнейшем в данном документе, как MS), содержащая источник ионов металлов в виде неорганических солей -железа, кобальта и магния, имела следующий состав (г/л):The cultivation medium (abbreviated hereinafter as MS), containing a source of metal ions in the form of inorganic salts of iron, cobalt and magnesium, had the following composition (g / l):

1. 1. Na2HPO4-12H2ONa 2 HPO 4 -12H 2 O 2,2-13,4; 2.2-13.4; 2. 2. КН2РО4 KN 2 RO 4 0,5 —3,1; 0.5-3.1; 3. 3. FeSO4-7H2OFeSO 4 -7H 2 O 0,01—0,3; 0.01-0.3; 4. 4. ЭДТА Na EDTA Na 0,02 — 0,6; 0.02 - 0.6; 5. 5. CoCI2-6H2OCoCI 2 -6H 2 O 0,01-0,08; 0.01-0.08; 6. 6. MgSO4-7H2OMgSO 4 -7H 2 O 0,05-2,5; 0.05-2.5; 7. 7. Мочевина Urea 4,0 — 20,0; 4.0 to 20.0; 8. 8. Гпюкоза Gpukoza 12,0—120,0; 12.0-120.0; 9. 9. Ацетат натрия Sodium Acetate 2,0-6,0 (при выращивании по двухкомпонентной 2.0-6.0 (when growing in two-component

схеме);scheme);

10. Вода - остальное.10. Water - the rest.

Согласно изобретению, для хелатирования ионов железа, кобальта и магния в среду MS вводили аспарагиновую кислоту в концентрации 0,076 - 3,0 г/л.According to the invention, for the chelation of iron, cobalt and magnesium ions, aspartic acid at a concentration of 0.076-3.0 g / l was introduced into the MS medium.

Среда культивирования (сокращенно обозначаемая в дальнейшем в данном документе, как MS-1), содержащая источники ионов металлов - железа, кобальта и магния в виде солей аспарагиновой кислоты, имела следующий состав (г/л):The cultivation medium (abbreviated hereinafter as MS-1) containing sources of metal ions - iron, cobalt and magnesium in the form of salts of aspartic acid, had the following composition (g / l):

1. 1. Na2HPO4-12H2ONa 2 HPO 4 -12H 2 O 2,2-13,4; 2.2-13.4; 2. 2. КН2РО4 KN 2 RO 4 0,5 —3,1; 0.5-3.1; 3. 3. Аспартат железа (II) Aspartate of iron (II) 0,011 —0,33; 0.011-0.33; 4. 4. ЭДТА Na EDTA Na 0,02 — 0,6; 0.02 - 0.6; 5. 5. Аспартат кобальта (II) Cobalt Aspartate (II) 0,014-0,11; 0.014-0.11; 6. 6. Аспартат магния (II) Magnesium Aspartate (II) 0,06-2,9; 0.06-2.9; 7. 7. Мочевина Urea 4,0 — 20,0; 4.0 to 20.0; 8. 8. Глюкоза Glucose 12,0—120,0; 12.0-120.0; 9. 9. Ацетат натрия Sodium Acetate 2,0-6,0 (п 2.0-6.0 (p

выращивании по двухкомпонентной схеме);cultivation according to a two-component scheme);

10. Вода - остальное.10. Water - the rest.

При выращивании штамма Rhodococcus rhodochrous M33 в условиях периодического культивирования в колбах в качестве источника углерода и энергии в среды MS и MS-1 добавляли глюкозу, поддерживая её концентрацию в диапазоне 12,0 -120,0 г/л. Глюкозу вносят в среду культивирования одной или двумя частями. При внесении двумя частями, глюкозу дополнительно (дробно) вносят через 30-40 часов от начала таким образом, чтобы суммарное количество внесенной глюкозы не превышало 120,0 г/л.When growing the strain Rhodococcus rhodochrous M33 under conditions of periodic cultivation in flasks, glucose was added to the MS and MS-1 media as a carbon and energy source, maintaining its concentration in the range 12.0–120.0 g / L. Glucose is introduced into the culture medium in one or two parts. When applied in two parts, glucose is additionally (fractionally) added after 30-40 hours from the start so that the total amount of glucose added does not exceed 120.0 g / l.

При культивировании в лабораторных или промышленных ферментёрах по двухкомпонентной схеме в качестве второго источника углерода может использоваться ацетат натрия, а также уксусная кислота. В этом случае на первой стадии роста процесс идёт с использованием глюкозы. Затем, когда глюкоза заканчивается, в аппарат добавляют ацетат натрия до конечной концентрации 2,0-6,0 г/л, с последующим поддержанием рН среды на заданном уровне (как правило, это 7,2-8,0) 50% водным раствором уксусной кислоты.When cultured in laboratory or industrial fermenters according to a two-component scheme, sodium acetate and acetic acid can be used as the second carbon source. In this case, at the first stage of growth, the process proceeds using glucose. Then, when glucose ends, sodium acetate is added to the apparatus to a final concentration of 2.0-6.0 g / l, followed by maintaining the pH of the medium at a given level (usually 7.2-8.0) with a 50% aqueous solution acetic acid.

Измерение нитрилгидратазной активности производилось следующим образом.Measurement of nitrile hydratase activity was carried out as follows.

мл раствора акрилонитрила с концентрацией 2% в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5) смешивался с 1 мл суспензии клеток Rhodococcus rhodochrous M33, полученной предварительным центрифугироваml of a solution of acrylonitrile with a concentration of 2% in 10 mm phosphate buffer (pH 7.5) was mixed with 1 ml of a suspension of Rhodococcus rhodochrous M33 cells obtained by preliminary centrifugation

- 5 032896 нием культуральной жидкости, промывкой и последующим ресуспендированием клеток в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5). Суспензия содержала от 0,08 до 0,16 мг клеток (сухой массы). Реакция протекала 10 минут при 20°С при постоянном перемешивании, после чего останавливалась добавлением 50 мкл концентрированной HCl. Концентрация образовавшегося акриламида определялась газовой хроматографией или фотометрией.- 5 032896 lowering the culture fluid, washing and then resuspending the cells in 10 mM phosphate buffer (pH 7.5). The suspension contained from 0.08 to 0.16 mg of cells (dry weight). The reaction proceeded for 10 minutes at 20 ° C with constant stirring, after which it was stopped by the addition of 50 μl of concentrated HCl. The concentration of acrylamide formed was determined by gas chromatography or photometry.

Нитрил гид ратазная активность приводится в следующих единицах:Nitrile hydratase activity is given in the following units:

удельная активность - в микромолях акриламида за 1 минуту на 1 миллиграмм сухой биомассы [Ед/мг];specific activity - in micromoles of acrylamide per 1 minute per 1 milligram of dry biomass [U / mg];

общая активность - в микромолях акриламида за 1 минуту на миллилитр культуральной жидкости [Ед/мл].total activity - in micromoles of acrylamide per 1 minute per milliliter of culture fluid [U / ml].

Приготовление инокулята осуществлялось по следующей технологии.Inoculum preparation was carried out according to the following technology.

Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous M33 выращивали на скошенном мясо-пептонном агаре при 30°С в течение 24 часов и суспендировали в 3 мл физиологического раствора. Полученной суспензией в объёме 1 мл инокулировали колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,01; MgSO4-7H2O - 1,0; мочевина - 4,0; глюкоза - 12,0. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе и 30°С в течение 48 ч. Полученную культуральную жидкость использовали для инокулирования колб и ферментёров во всех последующих экспериментах.Rhodococcus rhodochrous M33 strain cells were grown on beveled meat-peptone agar at 30 ° C for 24 hours and suspended in 3 ml of physiological saline. The resulting suspension in a volume of 1 ml was inoculated with a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of MS medium of the following composition (g / l): Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 7.9; KH 2 PO 4 - 1.8; FeSO 4 -7H 2 O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.01; MgSO 4 -7H 2 O - 1.0; urea - 4.0; glucose - 12.0. The cultivation was carried out with stirring on a circular shaker and 30 ° C for 48 hours. The resulting culture liquid was used to inoculate flasks and fermenters in all subsequent experiments.

Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.It should be understood that these and all examples cited in the application materials are not limiting and are provided merely to illustrate the present invention.

Пример 1. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 при различных концентрациях источника углерода в лабораторных условиях.Example 1. Cultivation of a bacterial strain of Rhodococcus rhodochrous M33 at various concentrations of a carbon source under laboratory conditions.

Колбы Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащие 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 20,0-120,0, инокулировали 0,5 мл инокулята. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе при 180 об/мин и 30°С. Определяли суммарный выход биомассы и нитрилгидратазную активность клеток. Полученные данные приведены в табл. 1.250 ml Erlenmeyer flasks containing 50 ml of MS medium of the following composition (g / l): Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 7.9; KH 2 PO 4 - 1.8; FeSO 4 -7H 2 O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.06; MgSO 4 -7H 2 O 1.0; urea - 16.0; glucose - 20.0-120.0, inoculated with 0.5 ml of inoculum. The cultivation was carried out with stirring on a circular shaker at 180 rpm and 30 ° C. The total yield of biomass and nitrile hydratase activity of the cells were determined. The data obtained are given in table. 1.

Как видно из табл. 1, с увеличением концентрации глюкозы от 20 до 120 г/л в среде происходит увеличение выхода биомассы и общей нитрилгидратазной активности.As can be seen from the table. 1, with an increase in glucose concentration from 20 to 120 g / l in the medium, an increase in the yield of biomass and total nitrile hydratase activity occurs.

Таблица 1Table 1

Концентрация глюкозы (г/л) Glucose concentration (g / l) Выход сухой биомассы (г/л) The yield of dry biomass (g / l) Время роста (ч) Growth time (h) Нитрилгидратазная активность Nitrile hydratase activity Специфическая активность (Ед/мл) Specific Activity (U / ml) Общая активность (Ед/мл) Total activity (U / ml) 20 20 7,6 7.6 72 72 241,2 241.2 1833,1 1833.1 30 thirty 11,6 11.6 72 72 249,2 249.2 2890,1 2890.1 40 40 15,8 15.8 72 72 258,9 258.9 4090,6 4090.6 50 fifty 20 20 72 72 277,4 277.4 5548 5548 60 60 24 24 96 96 312,5 312.5 7500 7500 70 70 28,6 28.6 96 96 284,9 284.9 8148,1 8148.1

........................

Пример 2. Сравнительное культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 в лабо раторных условиях.Example 2. Comparative cultivation of the bacterial strain Rhodococcus rhodochrous M33 under laboratory conditions.

Колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7^O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoC^^O - 0,06; MgSO4-7^O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0, и колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS1 следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; аспартат Fe2+ - 0,11; ЭДТА Na - 0,2; аспартат Со2+ - 0,084; аспартат Mg2+ - 1,17; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0, инокулировали 0,5 мл инокулята. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе при 180 об/мин и 30°С в течение 96 часов. Определяли суммарный выход биомассы и нитрилгидратазную активность клеток. Полученные данные приведены в табл. 2.A 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of MS medium of the following composition (g / l): Na2HPO4-12H2O - 7.9; KH2PO4 - 1.8; FeSO4-7 ^ O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoC ^^ O - 0.06; MgSO4-7 ^ O 1.0; urea - 16.0; glucose - 40.0, and a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of MS1 medium of the following composition (g / l): Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 7.9; KH 2 PO 4 - 1.8; aspartate Fe 2+ - 0.11; EDTA Na - 0.2; aspartate Co 2+ - 0.084; aspartate Mg 2+ 1.17; urea - 16.0; glucose - 40.0, inoculated with 0.5 ml of inoculum. The cultivation was carried out with stirring on a circular shaker at 180 rpm and 30 ° C for 96 hours. The total yield of biomass and nitrile hydratase activity of the cells were determined. The data obtained are given in table. 2.

Как видно из таблицы 2, замена неорганических солей железа, кобальта и магния на соответствующие аспартаты не только увеличивает общую нитрилгидратазную активность на 12%, но и предотвращает падение специфической нитрилгидратазной активности на стационарной фазе.As can be seen from table 2, the replacement of inorganic salts of iron, cobalt and magnesium with the corresponding aspartates not only increases the total nitrile hydratase activity by 12%, but also prevents the decrease in specific nitrile hydratase activity in the stationary phase.

- 6 032896- 6 032896

Таблица 2table 2

Время роста (ч) Growth time (h) Среда MS MS environment Среда MS-1 MS-1 environment Выход сухой биомассы (г/л) The yield of dry biomass (g / l) Нитрил гидратазная активность Nitrile hydratase activity Выход сухой биомассы (г/л) The yield of dry biomass (g / l) Нитрилгидратазная активность Nitrile hydratase activity Специфическа я активность (Ед/мл) Specific Activity (U / ml) Общая активность (Ед/мл) Total activity (U / ml) Специфическа я активность (Ед/мл) Specific Activity (U / ml) Общая активность (Ед/мл) Total activity (U / ml) 24 24 1,8 1.8 88 88 158,4 158.4 1,8 1.8 86,6 86.6 155,9 155.9 48 48 12,6 12.6 122,7 122.7 1546 1546 12,6 12.6 117,2 117.2 1476,7 1476.7 72 72 15,8 15.8 258,9 258.9 4090,6 4090.6 16 16 290,2 290.2 4643,2 4643,2 96 96 14 14 179,4 179.4 2511,6 2511.6 15 fifteen 234,3 234.3 3514,5 3514.5

Пример 3. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 на среде, содержащей аспарагиновую кислоту в лабораторных условиях.Example 3. The cultivation of the bacterial strain Rhodococcus rhodochrous M33 on a medium containing aspartic acid in laboratory conditions.

В колбу Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащую 50 мл среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0, внесли 2 г/л аспарагиновой кислоты. Колбу инокулировали 0,5 мл инокулята. Культивирование проводили при перемешивании на круговом встряхивателе при 180 об/мин и 30°С. Через 72 ч культивирования было получено 16,2 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 290,3 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 4702,9 Ед/мл.Into an Erlenmeyer flask with a volume of 250 ml containing 50 ml of MS medium of the following composition (g / l): Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 7.9; KH 2 PO 4 - 1.8; FeSO 4 -7H 2 O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.06; MgSO 4 -7H 2 O 1.0; urea - 16.0; glucose - 40.0, 2 g / l of aspartic acid were added. The flask was inoculated with 0.5 ml of inoculum. The cultivation was carried out with stirring on a circular shaker at 180 rpm and 30 ° C. After 72 hours of cultivation, 16.2 g / L dry cells with a nitrile hydratase activity of 290.3 U / mg were obtained. The total nitrile hydratase activity was 4702.9 U / ml.

Таким образом, введение в среду культивирования аспарагиновой кислоты привело к увеличению нитрилгидратазной активности и урожаю сухих клеток на 12,1 и 2,5% соответственно. Общая нитрилгидратазная активность выросла на 15%.Thus, the introduction of aspartic acid into the culture medium led to an increase in nitrile hydratase activity and yield of dry cells by 12.1 and 2.5%, respectively. Total nitrile hydratase activity increased by 15%.

Пример 4. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 на среде, содержащей аспарагиновую кислоту в лабораторном ферментере.Example 4. Cultivation of the bacterial strain Rhodococcus rhodochrous M33 on a medium containing aspartic acid in a laboratory fermenter.

Трёхлитровый лабораторный ферментёр, содержащий 1,5 л среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 20,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 50 мл инокулята. Культивирование проводили при 30°С и аэрации 0,5 мин-1. Число оборотов мешалки регулировали так, чтобы концентрация растворённого кислорода поддерживалась на уровне 50%. Когда глюкоза в среде закончилась, в аппарат внесли 4 г/л ацетата натрия и стали поддерживать рН на уровне 7,8 50% водным раствором уксусной кислоты. Через 72 ч культивирования было получено 22,3 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 340,6 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 7595,4 Ед/мл.A three-liter laboratory fermenter containing 1.5 l of MS medium of the following composition (g / l): Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 7.9; KH 2 PO 4 - 1.8; FeSO 4 -7H 2 O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.06; MgSO 4 -7H 2 O 1.0; urea - 16.0; glucose - 20.0; Aspartic acid 2.0, inoculated with 50 ml of inoculum. Cultivation was carried out at 30 ° C and aeration of 0.5 min -1 . The number of revolutions of the mixer was adjusted so that the concentration of dissolved oxygen was maintained at 50%. When glucose in the medium was over, 4 g / l sodium acetate was introduced into the apparatus and pH was maintained at 7.8 with a 50% aqueous solution of acetic acid. After 72 hours of cultivation, 22.3 g / L dry cells with a nitrile hydratase activity of 340.6 U / mg were obtained. The total nitrile hydratase activity was 7595.4 U / ml.

Пример 5. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 с дробным внесением источника углерода в лабораторном ферментере.Example 5. Cultivation of a bacterial strain Rhodococcus rhodochrous M33 with fractional introduction of a carbon source in a laboratory fermenter.

Трёхлитровый лабораторный ферментёр, содержащий 1,5 л среды MS следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 7,9; KH2PO4 - 1,8; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 50 мл инокулята. Культивирование проводили при 30°С и аэрации 0,5 мин-1. Число оборотов мешалки регулировали так, чтобы концентрация растворённого кислорода в среде поддерживалась на уровне 50%. На 30 и 40 ч роста в аппарат добавляли ещё по 40 г/л глюкозы в виде 40% раствора. Суммарная концентрация глюкозы составила 120 г/л. Через 72 ч культивирования было получено 45,1 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 189,8 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 8560 Ед/мл.A three-liter laboratory fermenter containing 1.5 l of MS medium of the following composition (g / l): Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 7.9; KH 2 PO 4 - 1.8; FeSO 4 -7H 2 O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.06; MgSO 4 -7H 2 O 1.0; urea - 16.0; glucose - 40.0; Aspartic acid 2.0, inoculated with 50 ml of inoculum. Cultivation was carried out at 30 ° C and aeration of 0.5 min -1 . The number of revolutions of the mixer was adjusted so that the concentration of dissolved oxygen in the medium was maintained at 50%. For 30 and 40 hours of growth, another 40 g / L of glucose in the form of a 40% solution was added to the apparatus. The total glucose concentration was 120 g / l. After 72 hours of cultivation, 45.1 g / L dry cells with a nitrile hydratase activity of 189.8 U / mg were obtained. The total nitrile hydratase activity was 8560 U / ml.

Пример 6. Культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 с дробным внесением источника углерода в промышленных условиях.Example 6. Cultivation of the bacterial strain Rhodococcus rhodochrous M33 with fractional introduction of a carbon source in an industrial environment.

Промышленный ферментёр объёмом 50 м3, содержащий 35 м3 среды MS следующего состава (г/л): Н3РО4 (100%) - 3,45; KOH-0,7; NaOH - 2,0; FeSO4-7H2O - 0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O - 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 1,0 м3 инокулята. Ферментацию проводили при 28 - 30°С и аэрации 0,5 мин-1.An industrial fermenter with a volume of 50 m 3 containing 35 m 3 of MS medium of the following composition (g / l): H 3 PO 4 (100%) - 3.45; KOH-0.7; NaOH - 2.0; FeSO 4 -7H 2 O - 0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.06; MgSO 4 -7H 2 O - 1.0; urea - 16.0; glucose - 40.0; Aspartic acid 2.0, inoculable 1.0 m 3 inoculum. Fermentation was carried out at 28-30 ° C and aeration of 0.5 min -1 .

На 30 ч роста в аппарат ввели ещё 20,0 г/л глюкозы. Через 64 ч культивирования было получено 23 г/л сухих клеток с удельной нитрилгидратазной активностью 296 Ед/мг. Общая активность составила 6808 Ед/мл.For 30 hours of growth, another 20.0 g / l glucose was introduced into the apparatus. After 64 hours of cultivation, 23 g / L dry cells with a specific nitrile hydratase activity of 296 U / mg were obtained. Total activity was 6808 U / ml.

Пример 7. Культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous M33 с использованием двух источников углерода в промышленных условиях.Example 7. Cultivation of the bacterial strain Rhodococcus rhodochrous M33 using two carbon sources in an industrial environment.

Промышленный ферментёр объёмом 50 м3, содержащий 35 м3 среды MS следующего состава (г/л): Н3РО4 (100%) - 3,45; KOH - 0,7; NaOH - 2,0; FeSO4-7H2O -0,1; ЭДТА Na - 0,2; CoCl2-6H2O - 0,06; MgSO4-7H2O - 1,0; мочевина - 16,0; глюкоза - 40,0; аспарагиновая кислота - 2,0, инокулировали 1,0 м3 инокулята. Ферментацию проводили при 28 - 30°С и аэрации 0,5 мин-1. На 26 ч роста в аппарат ввели ещёAn industrial fermenter with a volume of 50 m 3 containing 35 m 3 of MS medium of the following composition (g / l): H 3 PO 4 (100%) - 3.45; KOH - 0.7; NaOH - 2.0; FeSO 4 -7H 2 O -0.1; EDTA Na - 0.2; CoCl 2 -6H 2 O - 0.06; MgSO 4 -7H 2 O - 1.0; urea - 16.0; glucose - 40.0; Aspartic acid 2.0, inoculable 1.0 m 3 inoculum. Fermentation was carried out at 28-30 ° C and aeration of 0.5 min -1 . For 26 hours of growth, they introduced another

- 7 032896- 7 032896

20,0 г/л глюкозы. Когда глюкоза в среде закончилась, в аппарат внесли 4 г/л ацетата натрия и в дальнейшем поддерживали рН на уровне 7,8 50% водным раствором уксусной кислоты. Через 72 ч культивирования было получено 24,0 г/л сухих клеток с нитрилгидратазной активностью 304,2 Ед/мг. Общая нитрилгидратазная активность составила 7300,8 Ед/мл.20.0 g / l glucose. When the glucose in the medium was over, 4 g / L sodium acetate was added to the apparatus and the pH was further maintained at 7.8 with a 50% aqueous solution of acetic acid. After 72 hours of cultivation, 24.0 g / L dry cells with nitrile hydratase activity of 304.2 U / mg were obtained. The total nitrile hydratase activity was 7300.8 U / ml.

Предлагаемый способ обеспечивает более эффективное промышленное получение биомассы штаммов-продуцентов Rhodococcus rhodochrous M33 с высокой общей нитрилгидратазной активностью. При этом исключается необходимость использования ростовых факторов и дорогостоящих индукторов.The proposed method provides a more efficient industrial production of biomass of producer strains of Rhodococcus rhodochrous M33 with high total nitrile hydratase activity. This eliminates the need for the use of growth factors and expensive inductors.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are for illustrative purposes only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the gist of the present invention.

Claims (21)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способ культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающийся тем, что указанный микроорганизм культивируют в среде, включающей анионы аспарагиновой кислоты, а также ионы металлов - железа, магния и кобальта.1. The method of cultivation of Rhodococcus rhodochrous M33 - a producer of nitrile hydratase, characterized in that the microorganism is cultured in a medium including anions of aspartic acid, as well as metal ions - iron, magnesium and cobalt. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.2. The method according to claim 1, characterized in that the sources of metal ions are metal aspartates and / or inorganic metal salts. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что источником ионов железа, магния или кобальта являются, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).3. The method according to claim 2, characterized in that the source of iron, magnesium or cobalt ions are, respectively, iron (II) aspartate, iron (III) aspartate, magnesium (II) aspartate or cobalt (II) aspartate. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что неорганическая соль металла представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.4. The method according to claim 2, characterized in that the inorganic metal salt is sulfate, chloride and / or their hydrates. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что неорганическая соль представляет собой FeSO4, MgSO4, CoCl2 и/или их гидраты.5. The method according to claim 4, characterized in that the inorganic salt is FeSO 4 , MgSO 4 , CoCl 2 and / or their hydrates. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния и/или аспартат кобальта.6. The method according to claim 1, characterized in that the source of anions of aspartic acid is aspartic acid, iron aspartate, magnesium aspartate and / or cobalt aspartate. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником по меньшей мере одного из ионов металлов является его неорганическая соль.7. The method according to claim 1, characterized in that the source of anions of aspartic acid is aspartic acid, and the source of at least one of the metal ions is its inorganic salt. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты в среде составляет 0,076-3,0 г/л.8. The method according to claim 1, characterized in that the total concentration of anions of aspartic acid in the medium is 0.076-3.0 g / L. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования через 30-40 ч от начала культивирования в среду дополнительно вносят глюкозу так, чтобы суммарное количество глюкозы в среде не превышало 120,0 г/л.9. The method according to claim 1, characterized in that in the process of cultivation, after 30-40 hours from the start of cultivation, glucose is additionally added to the medium so that the total amount of glucose in the medium does not exceed 120.0 g / l. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в среду культивирования дополнительно вносят ацетат натрия так, чтобы суммарное количество внесенного ацетата натрия не превышало 6,0 г/л.10. The method according to claim 1, characterized in that sodium acetate is additionally added to the culture medium so that the total amount of sodium acetate added does not exceed 6.0 g / l. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что рН среды поддерживают на заданном уровне раствором уксусной кислоты.11. The method according to claim 10, characterized in that the pH of the medium is maintained at a predetermined level by a solution of acetic acid. 12. Среда для культивирования Rhodococcus rhodochrous M33 - продуцента нитрилгидратазы, отличающаяся тем, что включает источник анионов аспарагиновой кислоты, а также источники ионов металлов - железа, магния и кобальта.12. The culture medium for Rhodococcus rhodochrous M33 is a nitrile hydratase producer, characterized in that it includes a source of aspartic acid anions, as well as sources of metal ions - iron, magnesium and cobalt. 13. Среда для культивирования по п.12, в которой источники ионов металлов представляют собой аспартаты металлов и/или неорганические соли металлов.13. The cultivation medium of claim 12, wherein the metal ion sources are metal aspartates and / or inorganic metal salts. 14. Среда для культивирования по п.13, в которой источником ионов железа, магния или кобальта являются, соответственно, аспартат железа (II), аспартат железа (III), аспартат магния (II) или аспартат кобальта (II).14. The culture medium of claim 13, wherein the source of iron, magnesium or cobalt ions are, respectively, iron (II) aspartate, iron (III) aspartate, magnesium (II) aspartate or cobalt (II) aspartate. 15. Среда для культивирования по п.13, в которой неорганическая соль представляет собой сульфат, хлорид и/или их гидраты.15. The culture medium according to item 13, in which the inorganic salt is a sulfate, chloride and / or their hydrates. 16. Среда для культивирования по п.15, в которой неорганическая соль представляет собой FeSO4, MgSO4, CoCl2 и/или их гидраты.16. The culture medium according to clause 15, in which the inorganic salt is FeSO 4 , MgSO4, CoCl2 and / or their hydrates. 17. Среда для культивирования по п.12, в которой источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, аспартат железа, аспартат магния и/или аспартат кобальта.17. The culture medium of claim 12, wherein the source of aspartic acid anions is aspartic acid, iron aspartate, magnesium aspartate and / or cobalt aspartate. 18. Среда для культивирования по п.12, в которой источником анионов аспарагиновой кислоты является аспарагиновая кислота, а источником по меньшей мере одного из ионов металлов является его неорганическая соль.18. The cultivation medium according to claim 12, wherein the source of aspartic acid anions is aspartic acid and the source of at least one of the metal ions is its inorganic salt. 19. Среда для культивирования по п.12, в которой суммарная концентрация анионов аспарагиновой кислоты составляет 0,076-3,0 г/л.19. The culture medium according to item 12, in which the total concentration of anions of aspartic acid is 0.076-3.0 g / L. 20. Среда для культивирования по п.12, содержащая, г/л:20. The culture medium according to item 12, containing, g / l: Na2HPO4-12H2O - 2,2-13,4;Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 2.2-13.4; - 8 032896- 8 032896 KH2PO4 - 0,5-3,1;KH 2 PO 4 - 0.5-3.1; FeSO4-7H2O - 0,01-0,3;FeSO 4 -7H 2 O - 0.01-0.3; ЭДТА Na - 0,02-0,6;EDTA Na - 0.02-0.6; CoCl2-6H2O - 0,01-0,08;CoCl 2 -6H 2 O - 0.01-0.08; MgSO4-7H2O - 0,05-2,5;MgSO 4 -7H 2 O - 0.05-2.5; мочевина - 4,0-20,0;urea - 4.0-20.0; глюкоза - 12,0-120,0;glucose - 12.0-120.0; аспарагиновая кислота - 0,076-3,0;aspartic acid - 0.076-3.0; вода - остальное.water is the rest. 21. Среда для культивирования по п.12, содержащая, г/л:21. The culture medium according to item 12, containing, g / l: Na2HPO4-12H2O - 2,2-13,4;Na 2 HPO 4 -12H 2 O - 2.2-13.4; KH2PO4 - 0,5-3,1;KH 2 PO 4 - 0.5-3.1; аспартат железа (II) - 0,011-0,33;iron (II) aspartate - 0.011-0.33; ЭДТА Na - 0,02-0,6;EDTA Na - 0.02-0.6; аспартат кобальта (II) - 0,014-0,11;cobalt (II) aspartate - 0.014-0.11; аспартат магния (II) - 0,06-2,9;magnesium aspartate (II) - 0.06-2.9; мочевина - 4,0-20,0;urea - 4.0-20.0; глюкоза - 12,0-120,0;glucose - 12.0-120.0; вода - остальное.water is the rest. Евразийская патентная организация, ЕАПВEurasian Patent Organization, EAPO Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2Russia, 109012, Moscow, Maly Cherkassky per., 2
EA201700300A 2017-06-15 2017-06-15 Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33 EA032896B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201700300A EA032896B1 (en) 2017-06-15 2017-06-15 Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201700300A EA032896B1 (en) 2017-06-15 2017-06-15 Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201700300A1 EA201700300A1 (en) 2018-12-28
EA032896B1 true EA032896B1 (en) 2019-07-31

Family

ID=64948929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201700300A EA032896B1 (en) 2017-06-15 2017-06-15 Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA032896B1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661456A (en) * 1983-10-13 1987-04-28 Nitto Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Method for cultivation of pseudomonas bacteria
US20070184543A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Georgia State University Research Foundation Induction and Stabilization of Enzymatic Activity in Microorganisms
RU2340667C2 (en) * 2003-04-03 2008-12-10 ЭШЛЭНД ЛАЙСЕНСИНГ ЭНД ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ ПРОПЕРТИ ЭлЭлСи METHOD OF CULTURING STRAIN Rhodococcus rhodochrous M33, WHICH PRODUCES NITRILEHYDRASE

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661456A (en) * 1983-10-13 1987-04-28 Nitto Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Method for cultivation of pseudomonas bacteria
RU2340667C2 (en) * 2003-04-03 2008-12-10 ЭШЛЭНД ЛАЙСЕНСИНГ ЭНД ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ ПРОПЕРТИ ЭлЭлСи METHOD OF CULTURING STRAIN Rhodococcus rhodochrous M33, WHICH PRODUCES NITRILEHYDRASE
US20070184543A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Georgia State University Research Foundation Induction and Stabilization of Enzymatic Activity in Microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
EA201700300A1 (en) 2018-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Bioproduction of glycolic acid from glycolonitrile with a new bacterial isolate of Alcaligenes sp. ECU0401
Fu et al. Enhancement of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using a two-stage dissolved oxygen control strategy
RU2520870C1 (en) Bacterial strain rhodococcus aetherivorans of russian classification of microorganisms bkm ac-2610d - producer of nitrile hydrase, method of its cultivation and method of production of acrylamide
Chen et al. Effect of oxygen transfer on lipase production by Acinetobacter radioresistens
CN105378059B (en) Produce l-Isoleucine microorganism and the method using the micro-organisms l-Isoleucine
Raj et al. Rhodococcus rhodochrous PA-34: a potential biocatalyst for acrylamide synthesis
CN103361389A (en) Method for aerobic production of alanine or a compound arising using alanine
Li et al. A novel strategy for acetonitrile wastewater treatment by using a recombinant bacterium with biofilm-forming and nitrile-degrading capability
KR101116451B1 (en) Method for culturing the nitrile hydratase-producing strain rodococcus rhodochrous m33
Brandao et al. Nitrile hydrolysing activities of deep-sea and terrestrial mycolate actinomycetes
Gong et al. Isolation, identification, and culture optimization of a novel glycinonitrile-hydrolyzing fungus—Fusarium oxysporum H3
Naik et al. Studies on the production of enantioselective nitrilase in a stirred tank bioreactor by Pseudomonas putida MTCC 5110
EA032896B1 (en) Method for cultivating the strain rhodococcus rhodochrous m33
JPS594987B2 (en) Method for producing bacterial cells with high nitrilase activity
JP3154646B2 (en) Microbial production of glycolic acid
JP2003210164A (en) Hydrolyzing and synthesizing enzyme for capsaicin and method for producing the same
Ravi Kant et al. Production and characterization of acyl transfer activity of amidase from Alcaligenes sp. MTCC 10674 for synthesis of hydroxamic acids
JP2670838B2 (en) Method for producing L-α-amino acids
JPH04320679A (en) Micro-organism producing l-carnitine amidase, l-carnitine-amidase produced microbiologically, acquiring process therefor, and process of enzymatically transforming dl-and/or carnitine amide to l-carnitine
Maksimov et al. Effects of nitriles and amides on the growth and nitrile hydratase activity of the Rhodococcus sp. strain gt1
Pawlak et al. Feeding profile is not the sole factor influencing lovastatin production by Aspergillus terreus ATCC20542 in a continuous fed-batch stirred tank bioreactor
JPS6143998B2 (en)
Thitiprasert et al. Correlative effect of dissolved oxygen and key enzyme inhibitors responsible for L-lactate production by immobilized Rhizopus oryzae NRRL395 cultivated in a static bed bioreactor
Unissa et al. Condition optimization and production of extracellular l-Arginine deiminase from Vibrio alginolyticus 1374
Malaka et al. Optimization of Growth for Nitrilase Producing Bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM