JPH088878B2 - D−アラニンの製造法 - Google Patents
D−アラニンの製造法Info
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- JPH088878B2 JPH088878B2 JP2970987A JP2970987A JPH088878B2 JP H088878 B2 JPH088878 B2 JP H088878B2 JP 2970987 A JP2970987 A JP 2970987A JP 2970987 A JP2970987 A JP 2970987A JP H088878 B2 JPH088878 B2 JP H088878B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
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Description
する方法に関するものである。
である。
培養することによりD−アラニンを製造する方法はすで
に知られている(「発酵と代謝」、15、89(1987))。
・ファスシアンスによる直接D−アラニン発酵法も知ら
れている(特公昭51−21076号公報)。
ラニンを高純度で得る方法として優れている。
菌の生育が阻止されるばかりでなく、L−アラニンの資
化能も低下すること、また、D−アラニンも資化されて
しまうために、残存D−アラニン回収率も低いことなど
のために工業的に有利な方法とはいえない。
と低いこと、培養時間が5日間と長いことなどのため
に、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
炭素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有
する酵素によってL−アラニンを他の物質に変換せしめ
ることにより、DL−アラニンからD−アラニンを製造す
る方法である。
素源および単一窒素源として生育可能な微生物をDL−ア
ラニンを含有する培地で培養することにより、L−アラ
ニンのみを資化せしめD−アラニンを製造する方法を検
討した。
めのエネルギーとして消費されるために、L−アラニン
を全量資化した時点では培地中にはD−アラニンのみが
蓄積され、他の副生物はほとんど存在しないこととな
る。加えて、選ばれた微生物がラセマーゼを保有しない
が、あるいは保有したとしても不活性化される条件下で
培養することにより、DL−アラニンに含まれるD−アラ
ニンは実質的に理論量蓄積されることとなる。
究した。
DL−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してL−ア
ラニンのみを資化し、D−アラニンを実質的に資化しな
い、すなわち選択的資化能を有する微生物について探究
した。
えば、アラニル−tRNAシンテターゼ〔EC6,1,1,7〕、ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ〔EC2,6,1,2〕、アラ
ニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ〔EC2,6,1,1
2〕、アラニンデヒドロゲナーゼ〔EC1,4,1,1〕などが知
られており、さらに、アラニンラセマーゼが知られてい
る。
ンディダ属、サッカロマイコプシス属、ラクトバチルス
属、バシリス属、トルロプシス属、ピキア属、デバリオ
マイセス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属、サ
ッカロマイセス属、アエロバクター属、ハンゼヌラ属、
クリプトコッカス属、トリコスポロン属などに属する微
生物に存在する。
変換する能力を有していても、D−アラニンをも変換す
る酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼ
が存在している場合には、残留アラニン中にL−アラニ
ンが混入するため、D−アラニンのみを蓄積することは
できない。
物をDL−アラニン培地で培養したとしても、D−アラニ
ンのみを残留せしめることが可能か否かは予測できな
い。
造法を提供することを目的として鋭意検討した結果、特
定の酵母を特定炭素源および特定窒素源の培地で培養す
ることにより、数十g/以上の蓄積濃度でD−アラニン
が得られることを見い出し、本発明を完成した。
源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンデ
ィダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプ
シス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリ
コスポロン属に属しかつL−アラニンを資化しD−アラ
ニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、
培養物からD−アラニンを採取することを特徴とするD
−アラニンの製造法に関するものである。
ッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、ク
リプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン
属に属する酵母が挙げられる。これらの酵母のうち実質
的にDL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として
含有する培地中で生育可能であって、かつL−アラニン
資化能を有し、D−アラニンを実質的に資化しない酵母
が本発明では用いられる。
は、本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてD
−アラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはL−アラ
ニンの資化後、L−アラニンの不存在条件下ではD−ア
ラニンを資化する酵母も含まれる。
la)ATCC36992、キャンディダ・ルゴーザ(Candida rug
osa)ATCC10571、サッカロマイコプシス・リポリティカ
(Saccharomycopsis lipolytica)ATCC20306、サッカロ
マイコプシス・リポリティカ(Sacharomycopsis lipoly
tica)IFO 0717、クリプトコッカス・ラウレンティ(C
ryptococcus laurentii)ATCC36832、、トルロプシス・
キャンディダ(Torulopsis candida)ATCC20284、トル
ロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)IFO 00
05、ピキア・ブルトニー(Pichia burtonii)ATCC2027
9、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)IFO 094
7、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorph
a)ATCC26012、ハンゼヌラ・カプスラータ(Hansenula
capsulata)ATCC16753、トリコスポロン・ベイゲリー
(Trichosporon beigelii)ATCC36993などが挙げられ
る。
び単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すな
わち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として
実質的にDL−アラニンを用いるが、本発明の効果を阻害
しない範囲内で他の炭素数および/または窒素源を少量
含有していてもよい。
−アラニンの資化速度が遅くなるので、グルコースはで
きるだけ含有させないようにすることが好ましい。
しくは、30〜120gである。DL−アラニン濃度が低いと生
産効率が悪く、逆に濃度が高いと培養時間が長くなり、
また、微生物の生育が阻害される傾向となる。
が、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間
が長くなるので、初濃度を20〜50g/にし、残りのDL−
アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい。
養開始時にpH5に調整するが、培養が進むにつれてpHが
上昇する。そのままで培養するとD−アラニンの回収率
が低下するのでpHを酸性側にコントロールする必要があ
る。pHがアルカリ側になるとD−アラニンの回収率が低
下する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化され
ること、またはD−アラニンアミノトランスフェラーゼ
が活性化されることなどにより、D−アラニンが資化さ
れるものと考えられる。
くは4.5〜6.5に調整する。調整用の酸としては、例え
ば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液が好まし
い。
る。
2.0vvm、好ましくは0.6〜1.2vvmである。通気量が少な
すぎるとL−アラニン資化速度が遅くなる傾向となり、
また、多くても効果に変わりなく、むしろ培養液の蒸発
を促進するために培養液濃度が高くなったり、発泡が激
しくなり好ましくない。
終了する。L−アラニンの全量資化はD−0をモニター
することにより、また、アラニンのD、Lを分析する
か、酸の添加量をモニターすることにより知ることがで
きる。
続けるとD−アラニンも徐々に資化される場合もあるの
で、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
したのち、通常の方法によってD−アラニンを単離すれ
ばよい。
てアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次いで
アンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮すれ
ばよい。ここで得られた粗D−アラニンを水で再結晶す
れば精製されたD−アラニンが得られる。
−アラニン含有粉末をメタノール−塩酸によりメチルエ
ステル化したのち、3,5−ジニトロフェニルイソシアネ
ートと反応させたのちこれを次の条件によりHPLCで分析
する方法によって行った。
0:8:1) 流速:1ml/min 検出:UV254nm 実施例1 乾燥ブイヨン30g/(pH6.0)を含む培地50mlを1
三角フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌し、種培養
培地とした。これにキャンディダ・フミコーラATCC3699
2を一白金耳植菌し、30℃で一日振とう培養した。一
方、DL−アラニン100g/、リン酸一カリウム2g/、硫
酸マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g/を含む
培地(pH5.0)1を3のミニジャーファーメンター
に仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の主培養
培地を接種し、30℃、1.0vvm通気撹拌培養をした。な
お、培養中は2N硫酸によりpH5.0±0.1に調整を行った。
約70時間で培地中のL−アラニンは全量資化され、D−
アラニン48g、硫酸アンモニウム35gを含む培養液約1.2
を得た。
いたのち、イオン交換樹脂SK−1B(H型)を充填したカ
ラムにとおし、D−アラニンを吸着させた。このカラム
を十分水洗したのち4%アンモニア水でD−アラニンを
溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾固してD−アラニ
ン45gを得た。HPLCにより分析したところ、光学純度は9
9.6%ee以上であった。化学純度は99.45%であった。
ラニン濃度を80g/し、他は同じ条件で培養を行った。
約35時間で培養は終了し、D−アラニン38g、硫酸アン
モニウム28gを含む培養液約1.2を得た。
カルシウム18.3gを加えて撹拌し、約2時間塩交換を行
った。この懸濁液を1/3量まで減圧濃縮したのち、濾過
して無機塩を除いた。濾液は、イオン交換樹脂SK−1B
(アンモニウム型)を充填したカラムにとおし、微量の
金属イオンを吸着させた、溶出液とカラムの洗浄液を合
せ、濃縮晶析させ、精D−アラニン32gを得た。
酵母エキスを抜いて行ったところ、培養に約100時間を
要した。培養終了後、得られたD−アラニンの収量、光
学純度は実施例2とほぼ同様であった。
マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g/を含む培
地(pH5.0)50mlを1三角フラスコに分注し、滅菌し
て種培養培地とした。これにキャンディダ・フミコーラ
ATCC36992を一白金菌耳植菌し、30℃で約24時間振とう
培養した。一方、上記培地組成のうち、DL−アラニンを
40g/とした培地1を3のミニジャーファーメンタ
ーに仕込み滅菌し主培養培地とした。これに先の種培養
液を接種し、30℃、1.0vvmで通気撹拌培養をした。培養
中は、2N硫酸によりpH5.0±0.1に調整を行った。約20時
間後、培地中のL−アラニンの約80%が資化されたとこ
ろで、この培養液を同じ構成成分の新しい主培養培地1
に5%シードで接種し、先ほどと同条件で通気撹拌培
養を行った。再び約20時間培養したところで、次にこの
培養液を、DL−アラニン80g/を含有し他成分は前回ま
でと同様である主培養培地1に、5%シードで接種し
た。同条件で通気撹拌培養を約60時間行うと、培地中の
L−アラニンが全量資化された。培養収量後実施例2に
示した操作により得られたD−アラニンの収量、光学純
度、化学純度は実施例2とほぼ同様であった。
ニン55g、リン酸−カリウム2g、硫酸マグネシウム0.5
g、粉末酵母エキス1gを含む培地700mlとし、実施例1と
同条件で培養を行った。約20時間後、DL−アラニン45g
を含む水溶液300mlを15ml/hrの流速で添加を始めた。約
20時間で添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培
養を始めてから約60時間で培養は終結した。
ニンは収量、光学純度、化学純度ともに実施例1と同様
であった。
×180mmの試験管に分注し、滅菌した。これに表1に示
した酵母を一白金菌耳植菌し、30℃で1〜2日振とう培
養した。一方、DL−アラニン10g/、リン酸−カリウム
2g/、硫酸マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g
/よりなる主培養培地(pH5.0)5ml5を18×180mm試験
管に分注して滅菌した。これに先の種培養液を5%シー
ドで接種し、30℃で振とう培養した。24時間後、遠心分
離して菌体を除いたのち減圧濃縮して乾固ののち乾燥し
た。得られた固形分についてHPLCにより残存したアラニ
ンのL体、D体の残存率を求めた。
ス10g/を加え他は同じ条件で培養を行った。培養は約
54時間で終了し、D−アラニン32g、硫酸アンモニウム2
9gを含む培養液約1.2を得た。この培養液の50mlを実
施例6と同様の処理をして得られた固形分をHPLCにより
分析した結果、D−アラニンの光学純度は99.6%ee以上
であった。
て酵母を培養することにより、L−アラニンを高選択的
に資化することができる。
得られる。
ガスと水にまで変換されて、培養液中にはD−アラニン
以外の副生物は実質的には存在しない。
る。
Claims (1)
- 【請求項1】実質的にDL−アラニンを単一炭素源および
単一窒素源として含有する培地中で、キャンディダ(Ca
ndida)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsi
s)属、ピキア(Pichia)属、トルロプシス(Torulopsi
s)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、ハンゼ
ヌラ(Hansenura)属またはトルコスポロン(Torycospo
ron)属に属しかつ、L−アラニンを資化しD−アラニ
ンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培
養物からD−アラニンを採取することを特徴とするD−
アラニンの製造法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2970987A JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | D−アラニンの製造法 |
DE3851108T DE3851108T2 (de) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Verfahren zur herstellung von d-alanin. |
PCT/JP1988/000139 WO1988006188A1 (en) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Process for preparing d-alanine |
EP88901636A EP0301107B1 (en) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Process for preparing d-alanine |
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US08/027,551 US5422255A (en) | 1987-02-13 | 1993-03-05 | Method for producing D-alanine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2970987A JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | D−アラニンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63198997A JPS63198997A (ja) | 1988-08-17 |
JPH088878B2 true JPH088878B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=12283636
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2970987A Expired - Lifetime JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | D−アラニンの製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0301107B1 (ja) |
JP (1) | JPH088878B2 (ja) |
DE (1) | DE3851108T2 (ja) |
WO (1) | WO1988006188A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0249598A (ja) * | 1988-08-11 | 1990-02-19 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 微生物を用いるd−アラニンの製法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5121076B2 (ja) * | 1972-07-28 | 1976-06-30 |
-
1987
- 1987-02-13 JP JP2970987A patent/JPH088878B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-02-12 DE DE3851108T patent/DE3851108T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 EP EP88901636A patent/EP0301107B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 WO PCT/JP1988/000139 patent/WO1988006188A1/ja active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS63198997A (ja) | 1988-08-17 |
EP0301107A1 (en) | 1989-02-01 |
EP0301107A4 (en) | 1991-04-10 |
DE3851108D1 (de) | 1994-09-22 |
DE3851108T2 (de) | 1995-03-02 |
EP0301107B1 (en) | 1994-08-17 |
WO1988006188A1 (en) | 1988-08-25 |
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