WO1988006188A1

WO1988006188A1 - Process for preparing d-alanine

Info

Publication number: WO1988006188A1
Application number: PCT/JP1988/000139
Authority: WO
Inventors: Noriko Ito; Shinzo Imamura; Haruyo Sato
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 1987-02-13
Filing date: 1988-02-12
Publication date: 1988-08-25
Also published as: EP0301107A4; JPH088878B2; DE3851108T2; DE3851108D1; EP0301107A1; EP0301107B1; JPS63198997A

Description

明

D —ァラニンの製造法

技術分野

本発明は D—ァラニンを発酵法によって工業的に製造する方法に関するおのである。

北

冃技

グルコースなどと D L —ァラニンを含有する培地中で酵母を培養することにより D—ァラニンを製造する方法は、「発酵と代謝」第 Ί 5号 8 9 〜 9 4ページ（ 9 6 7年）に開示されている。また、グルコースなどと D L ーァラニンから L —ァラニン酸化能を有する微生物を用いて D —ァラニンとピルビン酸を同量程度併産する方法は特公昭 4 2— 2 0 6 8 3号公報に開示されている。

従来の方法はともに安価な D L — ァラニンから、高 i な D —ァラニンを高純度で得る方法として優れている。

しかしながら、前者には D L —ァラニン濃度を 2 0 2 Z J2以上にすると菡の生育が阻害されるばかりでなく選択的分解能も低下することが明示されている。つまり、原科の D Lーァラニン濃度が 2 0 3 Z i2以下に制限されるため、 D —ァラニンの収量は量論量とれたとしても高々 Ί 0 3 Z i2 に過ぎず、工業的に有利な方法とはいえない。

また、後者において-も D L —ァラニン濃度は高々 5 0 g Z j2であり、 D —ァラニンの収量も高々 1 と低い。しかも菌の培養およびし一ァラニンの酸化に要する時間は合計 7 2時間と長く、工業的に十分な方法とはいえない。

しかも、後者の方法では、 D —ァラニンを取得するためには大量のピルビン酸の分雛除去が不可避となり、ェ業的に不利である。

発明の開示

本発明者らは、上記問題点を解決することができ、ェ業的に有利な D —ァラニンの製造法を提供することを目的として鋭意研究した結果、特定の酵母を特定炭素源および特定窒素源の培地で培養することにより数 + j2 以上の睿積濃度で D —ァラニンが得られることを見出しナ一本発明のつの目的は、微生物を用いた選択資化法によ.り、 Dしーァラニンから D —ァラニンを高収率で、すなわち、ほぼ量論量で取得する方法を提供することにある。

本発明のもう 1 つの目的は、菌の生育を阻害することなくかつ選択的分解能も低下させることなぐ、高濃度の D L—ァラニンを培地に供給して高収量の D —ァラニンを取得する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、培養終了時の培地中に他の有機副生物およぴ有鏺不純物がほとんど存在しない方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、菌の培養および D L —ァラニンの半量資化に要する時間が短縮された効率のよい方法を提供することにある。 ―

本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細説明から明らかとなる。

これらの目的は実質的に D L—ァラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、卜ルロプシス属、クリプ卜コッカス属、ハンゼヌラ属または卜リコスポロン属に属しかつ Lーァラニンを資化し D —アラこ

10 ンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物から D—ァラニンを採取することを特徴とする D— ァラニンの製造法により達成される。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の構成を詳述する。

本発明で使用する酵母としては、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、卜ルロプシス属、クリブ卜コッカス属、ハンゼヌラ属または卜リコスポ口ン属に属する酵母が挙げられる。これらの酵母のうち実質的に D L —ァラニンを単一炭素源および単一窒素源とし

て含有する培地中で生育可能であって、かつ L 一ァラニン資化能を有し、 D —ァラニンを実質的に資化しない酵母が本発明では甩いられる。

ここで、 D —ァラニンを実質的に資化しない酵母とは、本発明の効果を実質的に阻害しない範囲において D —ァラニンを少曇のみ資化する酵 S、あるいはし一ァラニンの資化後、 L—ァラニンの不存在条件下では D—ァラニンを資化する酵母も含まれる。 - - - たとえば、キャンディダ♦ フミコーラ（ anciida

umicola) AT C C 3 699 2、キャンディダ · ルゴ一ザ（Candida rugosa) A T C C 1 057 1 、サヅカロマイコプシス ♦ リポリティ力（Sacciaromycopsis I i ρο I yt i ca)

A T〇 C 20306、サッカロマイコプシス ♦ リポリティ力（Saccharomycopsi s 11 polyt ica) I 厂 0 07 1 1 , クリプ卜コッカス ♦ ラウレンティ（じ ryputococcus

!au rent i ί ) A T C C 3 683 2、卜ルロプシス ♦ キャンディダ（Toru lopsis Candida) A T C C 20284. 卜ルロプシス ♦ グラプラタ（Toru I opsi s g i abrata j I F 0

0ひ 05、ピキア ♦ プルトニ一（Pichia burton i i ) A T

C C 202 79、ピキア ♦ ノ\。ス卜リス（Pi eh i a pastoris) I F 0 0948、ハンゼヌラ · ボリモルファ

(Hansenu la polymorphs) A丁 G G 2 60 Ί 2、ハンゼヌラカプスラータ (Hansenu I a capsu I ata ) A T C C

67 53、卜リコスポロン ♦ ベィゲリ一（Trichosporon beige! i i ) A丁 C C 3 6993などが挙げられる。

本発明では、実質的に D L—ァラニンを阜一炭素源おょぴ単一-窒素源として含有する培地中で培養を行う _α すなわち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として、実質的に D L—ァラニンを用いるが、本発明の効杲を阻害しない範囲内で少たとえば、 Ί 0 gノ

の範囲内で、他の炭素源および /または窒素源を含有していてちょい · ' ：培養液中に炭素源としてグルコースを Ί 0 / ]2以上共存させると L—ァラニンの資化速度が遅くなるので、グルコースはできるだけ含有させないようにすることが好ましい。

また、培養液中には、使用する微生物に応じて、金属イオンの塩類を添加してもよい。金属イオンとしては、たとえば Ν & τ、 κ ^÷ C a ² M g ²\ F e ^L i ^{2 +}、 Z n ² C o M n^{2 +}などが挙げられ、これらの金属イオンの硫酸、塩酸、リン酸など各種の無機酸の塩を用いることができる。

培地中の D L—ァラニン濃度は. Ί ώ中に Ί〜 250 、好ましくは 60〜 200 ^である。 D L—ァラニン濃度が低いと生産効率が悪く、逆に濃度が高いと培養時問が長くなる。また、微生物によっては微生物の生育が阻害される場合もある。

D L—ァラニンは始めから培養液に全量仕込んでもよいが、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間が長くなることもあるので、初濃度を 20〜 50 /' なにし、残りの D L—アラこンを分割添加する流加培養法が好ましい。

培養は酸性で実施するのが好ましい。培養液は通常培養開始時に Ρ.Η 5に調整するが、培養が進むにつれて Ηが上昇する。そのままで培養すると D—ァラニンの回収率が低下するので ρ Ηを酸性側にコン卜口一ルする必要がある。 Ρ Ηがアルカリ側になると D —ァラニンの回収率が低下する原因として、ァラニン ♦ ラセマーゼが活性化されること、または D —ァラニンアミノ卜ランスフエラ一ゼが活性化されることなどにより、 D—ァラニンが資化されるものと考えられる。

これらの理由から、培養時の Ρ Ηは通常 4〜 6 . 5、好ましくは 4 . 5〜 6 . 0に調整する。調整用の酸としては、たとえば、リン酸、硫酸、塩酸などの無璣酸水溶液が好ましい。

前記「発酵と代謝」には、培養時の Ρ Ηが高い側で選択分解が行われ、低、側ではむしろ選択性が劣るものであることが、要約に、結論として記載されている _σ たとえば前記「発酵と代謝」図 4には卜ルロプシス ♦ ファメータによる選択分解が Ρト！ 8 . 5で完結した例が示されている。

本発明のごとく培養時の Ρ Ηが 6 . 5以下の場合には通常の細菌が生育しにくいため、培養中に錐菌に汚染されにくいという利点も生じる。

培養温度は通常 2 0〜 4 0 °C 好ましくは 2 5 3 0 Όである。

培養は通気しながら攛拌る通気きは通常 0 . 5〜 2 . 0 WH 、好ましくは 0 . 6 1 . 2 VVM である。通気量が少なすぎるとしーァラニン資化速度が遅くなる傾向となり、また、多くても効果に変わりなく、むしろ養液の蒸発を促進するために培養液濃度が高くなつたり発泡が激しくなり好ましくない。

—ァラニンがすべて資化された時点で通常、培養を終了する。 L —ァラニンの全量資化は溶存酸素（ D O ) をモニターすることにより、また、ァラニンの D、 Lを分析することにより知ることができる。また、 Lーァラニンの資化によって生じるアンモニアを中和するために、培養中に酸を添加するが、 Lーァラニンの資化終了とともに酸の添加は不要となるので、その酸の添加量をモニターすることにより知ることちできる。

Lーァラニンがすべて資化されたのち、さらに培養を続けると D —ァラニンも徐々に資化される場合もあるので、培養の終点を明確に知ることが好ましい。

かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去したのち、通常の方法によって D —ァラニンを単離すればよい。

たとえば、イオン交換樹脂 S K— Ί B (三菱化成製）に通液してァラニンを樹脂に吸着させたのちよく洗淨する。次いでアンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮すればよい。ここで得られた粗 D —ァラニンを水で再結晶すれば製された D -ァラニンが得られる。

本発明は次の効果を発揮する。

( 1 ) D L —ァラニンから D —ァラニンを高収率で、すなわち、ほぼ量論量で取得することができる。

( 2 ) さらに、菌の生育を阻害することなくかつ選択的分解能をも低下させることなく高濃度の D L —ァラニンを培地に供給して高収量の D—ァラニンを取椁することができる _。

加えて、湾費された L -ァラニンは、ほとんど炭酸ガスと水にまで変換されて、培養終了時の培地中に他の有機副生物およぴ有璣不純 ¾がほとんど存在しないため、 D—ァラニンの単離および精製が容易となる。

(4) さらに、菌の培養および D L—ァラニンの半量資化に要する時間が短縮され効率よく D—ァラニンを取得できる。

(5) 培養を P H 6. 5以下の酸性条件で実施するため、培養中に雜菌に汚染されにくい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明する実施例においてァラニンの D L分析は、濃縮乾燥した Dーァラニン含..有粉末をメタノール一塩酸よりメチル- エステル化したのち 3 , 5—ジニ卜口フエ二ルイソシァネー卜と反応させたのちこれを次の条件により H P L C で分析する方法によって行つた。

カラム： OA— Ί 000 (住友化学）

π—へキサン：ジクロルメタン：エタノール

( 20 ： 8 ： 1 )

ί I

検出じ V 254 nm

実施例 1

乾燥プイヨン 30 ?Zi2 ( P H 6, 0〉を含む培地 5 0 /H5を Ί il三角フラスコに分注し、 20 °C 20分問滅菌し、種培養培地としこ。'これにキャンディダ ♦ フミコーラ AT〇〇 36992を一白金耳植菌し、 30°Cで一日振とう培養した。一方、 D L—ァラニン Ί 00 ^ 、リン酸一カリウム 2 Z J2、硫酸マグネシウム◦ . 5 ^Ζ 、粉末酵母エキス〇 . 52 / J2を含む培地（ P H 5. 0 ) 1 i2を 3 ώのミニジャーフアーメンターに仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の種培養液を接種し、 30°C、 1 . 0 WH 通気攪拌培養をした。なお培養中は 2 N硫酸により P H 5. 0 ± 0. Ί に調整を行つた。約 70時間で培地中の L—ァラニンは全量資化され、 D—ァラニン 48 g、硫酸アンモニゥム 353を含む培養液約 Ί . 2 ]2を得た。

この培養液を— 1 〇， 000 rpm 1 0分間遠心分離して菌体を除いたのち、イオン交換樹脂 S K- - つ B ( H型〉を充塡したカラムにとおし、 D—ァラニンを吸着させた , このカラムを十分水洗したのち 4 %アンモニア水で D— ァラニンを溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾固して

D—ァラニン 452を得た。 H P L Cにより分析したところ、光学純度は 99. 6%ee以上であった。化学純度は 99. 4 %であった。

実施例 2

実施例 Ί に示した操作のうち、主培養培地中の D L— ァラニン濃度を 802 Z J2 とし、他は同じ条件で培養を行った。約 35時間で培養は終了し、 D—ァラニン 38 g、硫酸アンモニゥ厶を含む培養液約つ . 2 ώを得た。

この培養液を遠心分雛して菌体を除いたのち、水酸化カルシウム Ί 8. 3 ^を加えて攪拌し、約 2時間塩交換を行った。この懸濁液を Ί Z3量まで減圧濃縮したのち瀘過して無機塩を除いた。瀘液は、イオン交換樹脂 S K - 1 B (アンミニゥム型）を充塡したカラムにとおし、微量の金属イオンを吸着させた。溶出液とカラムの洗淨液を合せ、濃縮晶析させ、 D—ァラニン 323を得た。光学純度 99. 9%ee、化学純度 99 , 9%であった。実施例 3

D L—ァラニン 2 0 ^ ZJ 、リン酸一カリウム 2 3 J2、硫酸マグネシウム〇 . 5 gZi 、粉末酵母エキス 0 5 S ZJ2を含む培地（ Ρ H 5. 0〉を 1 J2三角フラスコに分注し、滅菌して種培養培地とした。これにキヤンディダ * フミコーラ ATCC36992を一白金耳植菌し、 3〇°Cで約 24時間振とう培養した。一方、上記培地組成のうち、 D L—ァラニンを 4 0 とした培地 Ί J2を 3 J2のミニジャーファーメンターに仕込み減菌し主培養培地とした。これに先の種倍溶液を接種し、 30°C、 Ί . で通気攪拌培養をした。培養中は、

2 硫酸により P H 5. 0 ± 0. に調整を行つた。約 20時間後、培地中の L—ァラニンの約 80 %が資化されたところで、この培養液を同じ構成成分の斩しい主培養培地 Ί ώに 5%シードで接種し、先ほどと同条件で通気攪拌培養を行った。再び約 20時間培養したところで次にこの垲養液を D L—ァラニン 802 /J2を含有し他成分は前回までと同様である主培養培地 Ί J2に 5 %シ一ドで接種した。同条件で通気 IS拌培養を約 6〇時間行うと、培地中の Lーァラニンが全量資化された。培養終了後実施例 2に示した操作により得られた D—ァラニンの収量、光学純度、化学純度は実施例 2とほぼ同様であつた。

実施例 4

実施例つに示した操作のうち、主培養培地を D L—ァラニン 553、リン酸一カリウム 22、硫酸マグネシゥム 0. 52、粉末酵母エキス Ί 3を含む培地 700/ ^とし、実施例 1 と同条件で培養を行った。約 20時間後、 D L—ァラニン 4 53を含む水溶液 300/ ^を 5 i / hrの流速で添加を始めた。約 20時^ Sで添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培養を始めてから約 6〇時間で培養は終結した。

培養液から実施例 Ί に示した操作で得られた D—ァラニンは収量、光学純度、化学純度ともに実施例 1 と同様であった。

実施例 5 Ί 4

乾燥ブイヨン 303 / Q,からなる種培地（ P H 5. 〇） 5 を Ί 8 X 1 80腿の試験管に分注し、滅菌した。これに表 1 に示した酵母を一白金耳植菌し、 3〇°Cで 1 2曰振とう培養した。一方、 D L—ァラニン 1 0 ^ / d リン酸— 力リゥム 2 ^ Z J2、硫酸マグネシウム〇 . 5 g 、粉末酵母エキス 0. 5 Ζώよりなる主培養培地 ( H 5. 0〉を Ί 8 Χ Ί 80腿試験管に分注して滅菌した。これに先の種培養液を 5 %シードで接種し、 30°Cで振とう培養した。 24時間後、遠心分離して菌体を除いたのち減圧濃縮して乾固ののち乾燥した。得られた固形分について H P L Cにより残存したァラニンの L体、 D体の残存率を求めた。

結果を表 1に示す。

「

比較例

実施例 2に示した操作のうち、主培養培地にダルコ一ス 1 0 ^ Z £を加え他は同じ条件で培養を行つた。培養は約 5 4時間で終了し、 D—ァラニン 3 2 、硫酸アンモニゥム 2 9 を含む培養液約 Ί . 2 J2を得た。この培養液の 5 ϋ /^を実施例 5〜 Ί 4 と同様の処理をして得られた固形分を H P L Cにより分析した結果、 D—ァラニンの光学純度は 9 9 . 6 以上であつた。

産業上の利用可能性

D—ァラニンは医薬品原料または甘味料ァリテームの原料として有用である。

Claims

請求の範囲

(1) 実質的に D L—ァラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンディダ（Candida) 属、サッカロマイコプシス（Saccdaromycops i s)属、ピキア（Pichia)属、卜ルロプシル（Toruiopsis)属、クリプトコッカス（C「yptococcus)属、ノ、ンゼヌラ（Hansenu ra) 属または卜リコスポ口ン（Torycosporon)属に属しかつ、 Lーァラニンを資化し D—ァラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物から D —ァラニンを採取することを特徴とする D—ァラニンの製造法。

(2) キャンディダ属に属する微生物がキャンディダ属フミコーラ種またはキヤンディダ属ルゴ一ザ種に属する微生物である請求項（1) 記載の方法。

(3) 培養を P H 4〜 6. 5で行う請求項（1) 記載の方法。