CN115820578A - 突变体组合物、融合酶及胶原三肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及突变体组合物、融合酶及胶原三肽的制备方法。本发明提供了突变体组合物，包括突变体1和突变体2；所述突变体1具有：如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和所述突变体2具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明提供的制备方法，利用廉价的氨基酸作为原料，在三磷酸腺苷(ATP)以及对应的连接酶作用下高收率的转化成相应的二肽或三肽产物。在反应体系中引入ATP循环再生系统可以大大降低其使用量；同时通过构建融合酶减少实际生产过程中酶的用量；利用固定化酶催化进一步优化反应及纯化工艺，制备方案非常精简、收率高、产品品质好，易规模化。

Description

突变体组合物、融合酶及胶原三肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及突变体组合物、融合酶及胶原三肽的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是在人体各种结缔组织中发现的细胞外基质中的主要结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，它是哺乳动物中含量最多的蛋白质。现胶原蛋白被广泛应用于整容手术、骨头移植、组织再生等，胶原蛋白在国际美容膳食补充剂市场份额从2014年的1％到2019年的9％。

胶原蛋白最主要的活性成分是胶原三肽(Gly-Pro-Hyp)，胶原三肽分子量小(平均分子量为280左右)，因而容易被人体充分吸收，于此同时，胶原三肽还能够极有效的渗入角质层、真皮层，因此被广泛用于皮肤保湿、防皱、修复、丰胸等材料。

胶原三肽的传统制备方法，包括：(1)生物原料提取并采用相应的水解酶降解法，该方法是市面上在售胶原三肽的常见方法。由于动物皮(例如猪皮、鱼皮、鱼鳞)中含有大量的胶原蛋白，通过对这些原材料进行加工提取便可得到胶原蛋白粗品，然后利用特定的蛋白水解酶则可以将之切割成富含胶原三肽的多肽混合物。此外，胶原蛋白的来源也可以利用工程菌发酵而来，再通过提取纯化及精准的类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。

(2)化学合成法：与其它多肽制备方案类似，胶原三肽也可以氨基酸为原料，通过化学法合成制备。在该制备过程中首先需要对不希望参与反应的氨基酸官能团进行保护基保护，然后依次进行两分子化学偶联，最后再脱保护。化学法制备反应步骤较多，整体收率低；同时在化学耦合过程中不可避免的会产生外消旋体，由于该消旋体与产物性质很像而无法有效分离，从而极大的增加了纯化成本。

现阶段胶原蛋白主要生产工艺是从动物皮中提取胶原蛋白粗品，然后进行相应的酶切割。该方法虽然简便、便宜但是动物源原料中不可避免的会夹杂过敏源，从而影响其后续使用；同时该方法得到的是各种短肽的混合物，具有实际活性的三肽Gly-Pro-Hyp含量太低，因此在某些需要添加高活性三肽的特殊应用场景(如医美)，该方法制备的胶原三肽无法满足要求。而化学合成胶原三肽纯品工艺复杂，环境污染大，成本太高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了突变体组合物、融合酶及胶原三肽的制备方法。本发明提供的制备方法，利用廉价的氨基酸作为原料，在三磷酸腺苷(ATP)以及对应的连接酶作用下高收率的转化成相应的二肽或三肽产物。为了进一步节省成本，反应体系中引入ATP循环再生系统可以大大降低其使用量；同时通过构建融合酶(GPHSynAB)则可以减少实际生产过程中酶的用量；利用固定化酶催化则可以进一步优化反应及纯化工艺，因此总的来说该制备方案非常精简、收率高、产品品质好，易规模化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了突变体组合物，包括突变体1和突变体2；

所述突变体1具有：

(1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列；和

所述突变体2具有：

(4)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

(5)、在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(6)、与如(4)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

在本发明的一些实施方案中，上述突变体组合物中所述突变体1为连接酶(GPSynA):母板来源于肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,Uniprot ID:A0A756LAZ2)，在以下位点突变：S11L,L81M,S83A,L85F,D238T,M241I,Q242E,G287Y,T289A,I291Q,L337W。

在本发明的一些实施方案中，上述突变体组合物中所述突变体2为连接酶(GPHSynB):母板来源于德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii,Uniprot ID:G9A034)，在以下位点突变：D126Q,E140V,N142E,I144L,S147N,E218Y,N220E,D223S,R275Q,G377I,I435L。

在本发明的一些实施方案中，上述突变体组合物中的SEQ ID NO:1的序列为：MKKYIVVVEALFLGVEYVAKAIRKIGYEPVFLTNYRSQEGDALVQLATERAIFCETTETKDIISVIDLLGRSNIVGVTTFMDARFSIIASVNKLLGLPGVSESLLKLKDKSYVNGIIPEFVPKSLAVEWGKTPKDKIEDFLLNSDANKYIAKPSFTAGAIGTFVFKKYEELSNGIDSSVDKIPKHLEPNKYVVQEFFDGNLVSIEGYTYKDRIEFIGATLRYKFDNTEVKHKFPYQDTMGIENYEKCKSIICKLINRSNYEYGFFHVEFMVSDNEVRLIDANMGRPYGANQMELISFSYEIDPVLMFEHAISIAVFQKPTIDSQFFIDTPCVEMTGVWYGQKETARLLRFESPTLKSTHHLAVNMGTTVPKLGESNWSVIGTLTGRPNDVFTDLKNIKLITDKGVCSAVISE。

在本发明的一些实施方案中，上述突变体组合物的SEQ ID NO:2的序列为：MVSAYPQLSERARDAILPEVHQWALTNGLIMYPRNFTSEQATIAPTTLYPTLLPRSSVESVVSLQKAYNELYARIIRGENDDWLAKETVKLASYDTEFTGKLWSLYLKTKELGTTQNLRLGIFRSQYLIDKKNSQAKQVVFETLSVNFGGSSTKTGELHNYLNNSGKYCPDSGMPFYQTQIPVSKSSSLLAKGIAEAVNYYQGLNDERIVAFIVQENYREAFSQRIIEYALLQNHGIKSVRVTLGDVPHLTVVEGKSKRLFYKKTGQEIAVVYYQAGYSPTEYKDEKDWDSRLLLETSYAIKAPDLLTQLSGTKKIQQLLTNENILTRFVPDSDTRSKLISTFVEIYPLDDSPLGQEGKKLAFESPSKFVLKPQREIGGNNIYKENIPSFLKEIDEKDWSAYILMELIQPFETTENVVIRGNESFNEPITSELGLFGCILFDDSKIHFNEYSGWLLRSKFSRSDEGGVAAGFGCVDSFVLY。

本发明还提供了融合酶，包括上述突变体组合物和Linker。

在本发明的一些实施方案中，上述融合酶为连接酶(GPHSynAB)：将上述GPSynA酶与GPHSynB在基因层面进行融合表达，两个酶之间连接的氨基酸肽链是:GGGGSLVPRGSGGGGS。

在本发明的一些实施方案中，上述融合酶的所述Linker具有：

(7)、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或

(8)、在如(7)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(9)、与如(7)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

在本发明的一些实施方案中，上述融合酶中上述SEQ ID NO:3的序列为：GGGGSLVPRGSGGGGS。

在本发明的一些实施方案中，上述融合酶具有：

(10)、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

(11)、在如(10)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(12)、与如(10)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

在本发明的一些实施方案中，上述融合酶中上述SEQ ID NO:4的序列为：MKKYIVVVEALFLGVEYVAKAIRKIGYEPVFLTNYRSQEGDALVQLATERAIFCETTETKDIISVIDLLGRSNIVGVTTFMDARFSIIASVNKLLGLPGVSESLLKLKDKSYVNGIIPEFVPKSLAVEWGKTPKDKIEDFLLNSDANKYIAKPSFTAGAIGTFVFKKYEELSNGIDSSVDKIPKHLEPNKYVVQEFFDGNLVSIEGYTYKDRIEFIGATLRYKFDNTEVKHKFPYQDTMGIENYEKCKSIICKLINRSNYEYGFFHVEFMVSDNEVRLIDANMGRPYGANQMELISFSYEIDPVLMFEHAISIAVFQKPTIDSQFFIDTPCVEMTGVWYGQKETARLLRFESPTLKSTHHLAVNMGTTVPKLGESNWSVIGTLTGRPNDVFTDLKNIKLITDKGVCSAVISEGGGGSLVPRGSGGGGSMVSAYPQLSERARDAILPEVHQWALTNGLIMYPRNFTSEQATIAPTTLYPTLLPRSSVESVVSLQKAYNELYARIIRGENDDWLAKETVKLASYDTEFTGKLWSLYLKTKELGTTQNLRLGIFRSQYLIDKKNSQAKQVVFETLSVNFGGSSTKTGELHNYLNNSGKYCPDSGMPFYQTQIPVSKSSSLLAKGIAEAVNYYQGLNDERIVAFIVQENYREAFSQRIIEYALLQNHGIKSVRVTLGDVPHLTVVEGKSKRLFYKKTGQEIAVVYYQAGYSPTEYKDEKDWDSRLLLETSYAIKAPDLLTQLSGTKKIQQLLTNENILTRFVPDSDTRSKLISTFVEIYPLDDSPLGQEGKKLAFESPSKFVLKPQREIGGNNIYKENIPSFLKEIDEKDWSAYILMELIQPFETTENVVIRGNESFNEPITSELGLFGCILFDDSKIHFNEYSGWLLRSKFSRSDEGGVAAGFGCVDSFVLY。

本发明还提供了编码上述突变体组合物的核酸分子，

编码所述突变体1的核酸分子具有：

(13)、如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或

(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和

编码所述突变体2的核酸分子具有：

(16)、如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或

(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子中的SEQ ID NO:5序列为：atgaaaaaatatattgtggtggtggaagcgctgtttctgggcgtggaatatgtggcgaaagcgattcgcaaaattggctatgaaccggtgtttctgaccaactatcgcagccaggaaggcgatgcgctggtgcagctggcgaccgaacgcgcgattttttgcgaaaccaccgaaaccaaagatattattagcgtgattgatctgctgggccgcagcaacattgtgggcgtgaccacctttatggatgcgcgctttagcattattgcgagcgtgaacaaactgctgggcctgccgggcgtgagcgaaagcctgctgaaactgaaagataaaagctatgtgaacggcattattccggaatttgtgccgaaaagcctggcggtggaatggggcaaaaccccgaaagataaaattgaagattttctgctgaacagcgatgcgaacaaatatattgcgaaaccgagctttaccgcgggcgcgattggcacctttgtgtttaaaaaatatgaagaactgagcaacggcattgatagcagcgtggataaaattccgaaacatctggaaccgaacaaatatgtggtgcaggaattttttgatggcaacctggtgagcattgaaggctatacctataaagatcgcattgaatttattggcgcgaccctgcgctataaatttgataacaccgaagtgaaacataaatttccgtatcaggataccatgggcattgaaaactatgaaaaatgcaaaagcattatttgcaaactgattaaccgcagcaactatgaatatggcttttttcatgtggaatttatggtgagcgataacgaagtgcgcctgattgatgcgaacatgggccgcccgtatggcgcgaaccagatggaactgattagctttagctatgaaattgatccggtgctgatgtttgaacatgcgattagcattgcggtgtttcagaaaccgaccattgatagccagttttttattgataccccgtgcgtggaaatgaccggcgtgtggtatggccagaaagaaaccgcgcgcctgctgcgctttgaaagcccgaccctgaaaagcacccatcatctggcggtgaacatgggcaccaccgtgccgaaactgggcgaaagcaactggagcgtgattggcaccctgaccggccgcccgaacgatgtgtttaccgatctgaaaaacattaaactgattaccgataaaggcgtgtgcagcgcggtgattagcgaatga。

在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子中的SEQ ID NO:6序列为：atggtgagcgcgtatccgcagctgagcgaacgcgcgcgcgatgcgattctgccggaagtgcatcagtgggcgctgaccaacggcctgattatgtatccgcgcaactttaccagcgaacaggcgaccattgcgccgaccaccctgtatccgaccctgctgccgcgcagcagcgtggaaagcgtggtgagcctgcagaaagcgtataacgaactgtatgcgcgcattattcgcggcgaaaacgatgattggctggcgaaagaaaccgtgaaactggcgagctatgataccgaatttaccggcaaactgtggagcctgtatctgaaaaccaaagaactgggcaccacccagaacctgcgcctgggcatttttcgcagccagtatctgattgataaaaaaaacagccaggcgaaacaggtggtgtttgaaaccctgagcgtgaactttggcggcagcagcaccaaaaccggcgaactgcataactatctgaacaacagcggcaaatattgcccggatagcggcatgccgttttatcagacccagattccggtgagcaaaagcagcagcctgctggcgaaaggcattgcggaagcggtgaactattatcagggcctgaacgatgaacgcattgtggcgtttattgtgcaggaaaactatcgcgaagcgtttagccagcgcattattgaatatgcgctgctgcagaaccatggcattaaaagcgtgcgcgtgaccctgggcgatgtgccgcatctgaccgtggtggaaggcaaaagcaaacgcctgttttataaaaaaaccggccaggaaattgcggtggtgtattatcaggcgggctatagcccgaccgaatataaagatgaaaaagattgggatagccgcctgctgctggaaaccagctatgcgattaaagcgccggatctgctgacccagctgagcggcaccaaaaaaattcagcagctgctgaccaacgaaaacattctgacccgctttgtgccggatagcgatacccgcagcaaactgattagcacctttgtggaaatttatccgctggatgatagcccgctgggccaggaaggcaaaaaactggcgtttgaaagcccgagcaaatttgtgctgaaaccgcagcgcgaaattggcggcaacaacatttataaagaaaacattccgagctttctgaaagaaattgatgaaaaagattggagcgcgtatattctgatggaactgattcagccgtttgaaaccaccgaaaacgtggtgattcgcggcaacgaaagctttaacgaaccgattaccagcgaactgggcctgtttggctgcattctgtttgatgatagcaaaattcattttaacgaatatagcggctggctgctgcgcagcaaatttagccgcagcgatgaaggcggcgtggcggcgggctttggctgcgtggatagctttgtgctgtattaa。

本发明还提供了编码上述融合酶的核酸分子具有：

(19)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(21)、与(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子中的SEQ ID NO:7序列为：atgaaaaaatatattgtggtggtggaagcgctgtttctgggcgtggaatatgtggcgaaagcgattcgcaaaattggctatgaaccggtgtttctgaccaactatcgcagccaggaaggcgatgcgctggtgcagctggcgaccgaacgcgcgattttttgcgaaaccaccgaaaccaaagatattattagcgtgattgatctgctgggccgcagcaacattgtgggcgtgaccacctttatggatgcgcgctttagcattattgcgagcgtgaacaaactgctgggcctgccgggcgtgagcgaaagcctgctgaaactgaaagataaaagctatgtgaacggcattattccggaatttgtgccgaaaagcctggcggtggaatggggcaaaaccccgaaagataaaattgaagattttctgctgaacagcgatgcgaacaaatatattgcgaaaccgagctttaccgcgggcgcgattggcacctttgtgtttaaaaaatatgaagaactgagcaacggcattgatagcagcgtggataaaattccgaaacatctggaaccgaacaaatatgtggtgcaggaattttttgatggcaacctggtgagcattgaaggctatacctataaagatcgcattgaatttattggcgcgaccctgcgctataaatttgataacaccgaagtgaaacataaatttccgtatcaggataccatgggcattgaaaactatgaaaaatgcaaaagcattatttgcaaactgattaaccgcagcaactatgaatatggcttttttcatgtggaatttatggtgagcgataacgaagtgcgcctgattgatgcgaacatgggccgcccgtatggcgcgaaccagatggaactgattagctttagctatgaaattgatccggtgctgatgtttgaacatgcgattagcattgcggtgtttcagaaaccgaccattgatagccagttttttattgataccccgtgcgtggaaatgaccggcgtgtggtatggccagaaagaaaccgcgcgcctgctgcgctttgaaagcccgaccctgaaaagcacccatcatctggcggtgaacatgggcaccaccgtgccgaaactgggcgaaagcaactggagcgtgattggcaccctgaccggccgcccgaacgatgtgtttaccgatctgaaaaacattaaactgattaccgataaaggcgtgtgcagcgcggtgattagcgaaggcggcggcggcagcctggtgccgcgcggcagcggcggcggcggcagcatggtgagcgcgtatccgcagctgagcgaacgcgcgcgcgatgcgattctgccggaagtgcatcagtgggcgctgaccaacggcctgattatgtatccgcgcaactttaccagcgaacaggcgaccattgcgccgaccaccctgtatccgaccctgctgccgcgcagcagcgtggaaagcgtggtgagcctgcagaaagcgtataacgaactgtatgcgcgcattattcgcggcgaaaacgatgattggctggcgaaagaaaccgtgaaactggcgagctatgataccgaatttaccggcaaactgtggagcctgtatctgaaaaccaaagaactgggcaccacccagaacctgcgcctgggcatttttcgcagccagtatctgattgataaaaaaaacagccaggcgaaacaggtggtgtttgaaaccctgagcgtgaactttggcggcagcagcaccaaaaccggcgaactgcataactatctgaacaacagcggcaaatattgcccggatagcggcatgccgttttatcagacccagattccggtgagcaaaagcagcagcctgctggcgaaaggcattgcggaagcggtgaactattatcagggcctgaacgatgaacgcattgtggcgtttattgtgcaggaaaactatcgcgaagcgtttagccagcgcattattgaatatgcgctgctgcagaaccatggcattaaaagcgtgcgcgtgaccctgggcgatgtgccgcatctgaccgtggtggaaggcaaaagcaaacgcctgttttataaaaaaaccggccaggaaattgcggtggtgtattatcaggcgggctatagcccgaccgaatataaagatgaaaaagattgggatagccgcctgctgctggaaaccagctatgcgattaaagcgccggatctgctgacccagctgagcggcaccaaaaaaattcagcagctgctgaccaacgaaaacattctgacccgctttgtgccggatagcgatacccgcagcaaactgattagcacctttgtggaaatttatccgctggatgatagcccgctgggccaggaaggcaaaaaactggcgtttgaaagcccgagcaaatttgtgctgaaaccgcagcgcgaaattggcggcaacaacatttataaagaaaacattccgagctttctgaaagaaattgatgaaaaagattggagcgcgtatattctgatggaactgattcagccgtttgaaaccaccgaaaacgtggtgattcgcggcaacgaaagctttaacgaaccgattaccagcgaactgggcctgtttggctgcattctgtttgatgatagcaaaattcattttaacgaatatagcggctggctgctgcgcagcaaatttagccgcagcgatgaaggcggcgtggcggcgggctttggctgcgtggatagctttgtgctgtattaa。

本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子。

本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述表达载体。

本发明还提供了胶原三肽的制备方法，以脯氨酸、甘氨酸和羟脯氨酸为原料，经上述突变体组合物和/或上述融合蛋白催化，制得所述胶原三肽。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述原料还包括偏六磷酸钠和多聚磷酸激酶。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中上述多聚磷酸激酶PPK，来源于奇异球菌(Deinococcus radiodurans),Uniprot ID:Q9RY20。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中上述多聚磷酸激酶具有如SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列；SEQ ID NO:8的序列为MDIDNYRVKPGKRVKLSDWATNDDAGL SKEEGQAQTAKLAGELAEWQERLYAEGKQSLLLILQARDAAGKDGAVKKVIGAFNPAGVQITSFKQPSAEELSHDFLWRIHQKAPAKGYVGVFNRSQYEDVLVTRVYDMIDDKTAKRRLEHIRHFEELLTDNATRIVKVYLHISPEEQKERLQARLDNPGKHWKFNPGDLKDRSNWDKFNDVYEDALTTSTDDAPWYVVPADRKWYRDLVLSHILLGALKDMNPQFPAIDYDPSKVVIH。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中编码上述多聚磷酸激酶的核酸分子具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:9的序列为atggatattgataactatcgcgtgaaaccgggcaaacgcgtgaaactgagcgattgggcgaccaacgatgatgcgggcctgagcaaagaagaaggccaggcgcagaccgcgaaactggcgggcgaactggcggaatggcaggaacgcctgtatgcggaaggcaaacagagcctgctgctgattctgcaggcgcgcgatgcggcgggcaaagatggcgcggtgaaaaaagtgattggcgcgtttaacccggcgggcgtgcagattaccagctttaaacagccgagcgcggaagaactgagccatgattttctgtggcgcattcatcagaaagcgccggcgaaaggctatgtgggcgtgtttaaccgcagccagtatgaagatgtgctggtgacccgcgtgtatgatatgattgatgataaaaccgcgaaacgccgcctggaacatattcgccattttgaagaactgctgaccgataacgcgacccgcattgtgaaagtgtatctgcatattagcccggaagaacagaaagaacgcctgcaggcgcgcctggataacccgggcaaacattggaaatttaacccgggcgatctgaaagatcgcagcaactgggataaatttaacgatgtgtatgaagatgcgctgaccaccagcaccgatgatgcgccgtggtatgtggtgccggcggatcgcaaatggtatcgcgatctggtgctgagccatattctgctgggcgcgctgaaagatatgaacccgcagtttccggcgattgattatgatccgagcaaagtggtgattcattaa。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述催化的时间为2小时或4小时。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述催化后还包括变性和离心的步骤。

本发明还提供了上述突变体组合物、上述融合蛋白、上述表达载体、上述宿主在直接或间接制备胶原三肽和/或含有胶原三肽的产品中的应用。

本发明提供了突变体组合物，包括突变体1和突变体2；

所述突变体1具有：

(1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列；和

所述突变体2具有：

(4)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

(5)、在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(6)、与如(4)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明提供的制备方法，利用廉价的氨基酸作为原料，在三磷酸腺苷(ATP)以及对应的连接酶作用下高收率的转化成相应的二肽或三肽产物。为了进一步节省成本，反应体系中引入ATP循环再生系统可以大大降低其使用量；同时通过构建融合酶(GPHSynAB)则可以减少实际生产过程中酶的用量；利用固定化酶催化则可以进一步优化反应及纯化工艺，因此总的来说该制备方案非常精简、收率高、产品品质好，易规模化。

(2)本发明使用两个氨基酸连接酶将L-甘氨酸、L-脯氨酸以及羟基脯氨酸依次连接从而高转化率的生成胶原三肽。该工艺采用大宗廉价的氨基酸为初始原料，通过温和简单的酶反应就能快速生成产物。相比于市面上常见的动物皮纯化提取、酶切割工艺，本专利规模化生产工艺稳定、产品品质也稳定，纯度高副产物少；同时该方法也显著优于化学合成方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明氨基酸连接酶法制备路线；

图2示二肽甘氨酸-脯氨酸制备路线；

图3示GPHSynB酶制备胶原三肽路线；

图4示二肽甘氨酸-脯氨酸制备路线；

图5示实施例1液相图谱；其中：上图示GPSynA粗酶液制备Gly-Pro反应0h；下图示GPSynA粗酶液制备Gly-Pro反应3h；

图6示GPHSynB酶制备胶原三肽路线；

图7示实施例2液相图谱；其中：上图示GPHSynB粗酶液制备Gly-Pro-Hyp反应0h；下图示GPHSynB粗酶液制备Gly-Pro-Hyp反应2h；

图8示H-Gly-Pro-Hyp-OH核磁图谱；

图9示对照，标准核磁图谱(引用专利CN 114901670 A)；

图10示融合酶液酶制备三肽路线；

图11示实施例3液相图谱；其中：上图示GPHSynAB粗酶液制备Gly-Pro-Hyp反应0h；下图示GPHSynAB粗酶液制备Gly-Pro-Hyp反应4h；

图12示融合酶液酶加ATP再生系统制备三肽路线；

图13示实施例4液相图谱；其中：上图示GPHSynAB粗酶液-ATP再生制备Gly-Pro-Hyp反应0h；下图示GPHSynAB粗酶液-ATP再生制备Gly-Pro-Hyp反应4h；

图14示融合酶固定化加ATP再生系统制备三肽路线；

图15示实施例5液相图谱；其中：上图示固定化酶制备Gly-Pro-Hyp反应0h；下图示固定化酶制备Gly-Pro-Hyp反应2h；

图16示本发明中的蛋白的凝胶电泳图谱；其中：从左至右依次为：PPK、GPSynA、GPHSynB、GPHSynAB。

具体实施方式

本发明公开了突变体组合物、融合酶及胶原三肽的制备方法。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明氨基酸连接酶法制备路线如图1所示。

本发明采用GPSynA酶在水溶液中可先将甘氨酸与脯氨酸连接生成Gly-Pro二肽，然后再利用GPHSynB酶将Gly-Pro二肽与羟脯氨酸连接得到GPH三肽；或者可采用融合酶GPHSynAB将三个氨基酸原料一次性连接成胶原三肽。反应过程中的ATP可以是等当量的，也可以采用ATP再生的方式用催化剂量的。反应可以采用细胞破碎粗酶液，也可以采用固定化酶。

本发明实施例1～实施例5和效果例中，所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得。

本发明实施例1～实施例5和效果例中有关于酶的发酵生产：

具体包含以下步骤：将实施例1～实施例5中的酶所对应的基因进行序列优化后，下单到通用生物公司合成(安徽滁州)。再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。具体包含单菌落转入5mL含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250mL含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm,20min)获得酶过量表达湿细胞25～50g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM,pH8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 8.0)在低温混合均匀(以～10g湿细胞：200mL缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁后获得含酶上清液备用(得到的酶活力在250～500U/mL,U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

本发明实施例1～实施例5和效果例中关于酶的固定化：

具体步骤如下：取酶的发酵生产中收集的粗酶上清液，缓慢加入硫酸铵固体至蛋白固体析出(20～50％w/v硫酸铵：缓冲液)，该蛋白固体通过高速离心(10000rpm,10min)收集后缓慢溶解到25mMpH 8.0的Tris缓冲液中(缓冲液A)，然后在50倍体积的缓冲液A中透析(两次，每次间隔4小时)，除去酶溶液里的硫酸铵，最后透析液上样DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱(NaCl在缓冲液梯度洗脱:0-1N NaCl)得到初纯化的GPHSynAB与PPK酶液；然后GPHSynAB与PPK酶利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按活性单位1:(2～3)以下面的方法一次性混合固定化：1500U纯化混合酶溶解在1L 50mM pH 8.0的磷酸钾(缓冲液B)溶液中，随后加入30～50mM苯氧乙酸以及500gLX-1000EP环氧树脂至，室温搅拌10小时后过滤出固定化酶，最后用清水及缓冲液B各洗两次后低温保存待用，固定化酶具有70～92％的初始活力。

本发明实施例1～实施例5和效果例中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1利用野生连接酶(GPSynA0)和野生连接酶(GPHSynB0)粗酶液制备二肽甘氨酸-脯氨酸Gly-Pro和胶原三肽Gly-Pro-Hyp

(1)制备路线如图2所示，在1L 100mMpH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入12.4g L-甘氨酸(165mM),17.3g L-脯氨酸(150mM),83.0g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,157mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到8.0后，加入连接酶GPSynA03000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到有目标产物生成，但是原料转化率比较低。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，2:1,v:v)得约11.7～13.9g L-甘氨酸-L-脯氨酸(Gly-Pro)二肽(收率45％～54％)。由于产品占比较少，结晶纯化很困难。

(2)与上述步骤(1)Gly-Pro制备方法类似，制备路线如图3所示，在1L 100mMpH7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入17.2g L-甘氨酸-L-脯氨酸(100mM),14.4g反式-4-OH-L-脯氨酸(110mM),55.5g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,105mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到7.5后，加入连接酶GPHSynB03000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后通过HPLC检测到有目标产物生成。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，3:1,v:v)仅得8.6～9.9g胶原三肽(仅收率30％～35％)。如上一步所叙述，此步结晶纯化更困难。

实施例2利用突变连接酶(GPSynA)和突变连接酶(GPHSynB)粗酶液制备胶原三肽Gly-Pro-Hyp

(1)制备路线如图4所示，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入12.4g L-甘氨酸(165mM),17.3g L-脯氨酸(150mM),83.0g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,157mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到8.0后，加入连接酶GPSynA 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全(如图5所示)。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，2:1,v:v)得21.9～22.4g L-甘氨酸-L-脯氨酸(Gly-Pro)二肽(收率85％～87％)。结晶纯化后的产品Gly-Pro,过程中送检核磁，确认了正确结构:1H NMR(400MHz,D2O):δ＝4.54–4.62(m,1H),3.50(s,2H),3.40–3.70(m,2H),1.87–2.35(m,4H)。

(2)制备路线如图6所示，与步骤(1)Gly-Pro制备方法类似，在1L 100mM pH7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入17.2g L-甘氨酸-L-脯氨酸(100mM),14.4g反式-4-OH-L-脯氨酸(110mM),55.5g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,105mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到7.5后，加入连接酶GPHSynB 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全(如图7所示)。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，3:1,v:v)得23.1～24.2g胶原三肽(收率81％～85％)。结晶纯化后的产品Gly-Pro-Hyp，送检核磁，核磁图谱如图8所示，与标准品的色谱图(如图9所示)进行对比，确认了正确结构：1H NMR(400MHz,D2O)δ＝4.79(m,1H),4.62(m,1H),4.53(t,J＝8.4Hz,1H),3.99(s,2H),3.92–3.69(m,2H),3.57(m,2H),2.36(m,2H),2.15(m,1H),1.98(m,3H)。

实施例3利用融合酶(GPHSynAB)粗酶液一次性制备胶原三肽Gly-Pro-Hyp

制备路线如图10所示，同样在1L 100mMpH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入8.3g L-甘氨酸(110mM)，12.1g L-脯氨酸(105mM)，13.1g反式-4-OH-L-脯氨酸(100mM)，111g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,210mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到7.5后，加入连接酶GPHSynAB 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在6.5～9.0之间，4小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全(如图11所示)。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，3:1,v:v)得22～23g胶原三肽(收率77％～80％)。

实施例4利用融合酶(GPHSynAB)粗酶液以及ATP再生系统一次性制备胶原三肽Gly-Pro-Hyp

制备路线如图12所示，与实施例3类似，同样在1L 100mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入8.3g L-甘氨酸(110mM),12.1g L-脯氨酸(105mM),13.1g反式-4-OH-L-脯氨酸(100mM)，5.4g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,10mM)，32.2g偏六磷酸钠(52.6mM),调节溶液pH值到7.5后加入多聚磷酸激酶PPK酶3000U、连接酶GPHSynAB2000U，在室温(25℃)轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，4小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全(如图13所示)。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，3:1,v:v)得23.6～24.2g胶原三肽(收率83％～85％)。

实施例5利用固定化酶一次性制备胶原三肽Gly-Pro-Hyp

制备路线如图14所示，反应与实施例4类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入4.2g L-甘氨酸(55mM),5.7g L-脯氨酸(50mM),6.5g反式-4-OH-L-脯氨酸(50mM)，5.4g三磷酸腺苷单钠盐(ATP,10mM)，16.1g偏六磷酸钠(26.3mM)，调节溶液pH值到8.0后加入混合固定的GPHSynAB/PPK 3000U。在30℃下轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全(如图15所示)。然后直接过滤回收固定化的GPHSynAB/PPK酶，该固体用25mM Tris pH 8.0缓冲液冲洗三次备用；反应液用HCl水溶液调节pH到1.0沉淀蛋白并离心除去，然后再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇：水，3:1,v:v)得12.8～13.5g胶原三肽(收率89.6％～94.5％)，回收后的固定化的GPHSynAB/PPK酶具有88％的初始活力。

效果例

表1预实验和实施例的一些统计数据

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.突变体组合物，其特征在于，包括突变体1和突变体2；

所述突变体1具有：

(1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列；和

所述突变体2具有：

(4)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

(5)、在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(6)、与如(4)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

2.融合酶，其特征在于，包括如权利要求1所述的突变体组合物和Linker。

3.如权利要求2所述的融合酶，其特征在于，

所述Linker具有：

(7)、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或

(8)、在如(7)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(9)、与如(7)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

4.如权利要求2或3所述的融合酶，其特征在于，其具有：

(10)、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

(11)、在如(10)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

(12)、与如(10)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

5.编码如权利要求1所述的突变体组合物的核酸分子，其特征在于，

编码所述突变体1的核酸分子具有：

(13)、如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或

(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和

编码所述突变体2的核酸分子具有：

(16)、如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或

(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

6.编码如权利要求2至4任一项所述的融合酶的核酸分子，其特征在于，其具有：

(19)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(21)、与(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

7.表达载体，其特征在于，包括如权利要求5或6所述的核酸分子。

8.宿主，其特征在于，转化和/或转染如权利要求7所述的表达载体。

9.胶原三肽的制备方法，其特征在于，以脯氨酸、甘氨酸和羟脯氨酸为原料，经如权利要求1所述的突变体组合物和/或如权利要求2至4任一项所述融合蛋白催化，制得所述胶原三肽。

10.如权利要求1所述的突变体组合物、如权利要求2至4任一项所述的融合蛋白、如权利要求7所述的表达载体、如权利要求8所述的宿主在直接或间接制备胶原三肽和/或含有胶原三肽的产品中的应用。

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