CN105746889B - 一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法 - Google Patents
一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用水产蛋白两部发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，包括以下主要步骤：将新鲜的水产蛋白绞碎；绞碎后的水产蛋白加入到发酵罐中，并添加营养物和水混匀作为发酵培养基；发酵罐中接入产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL‑2进行液态好氧发酵；液态发酵结束后，发酵液经过滤去除沉淀后与中草药混合后于50℃~55℃下继续进行固态好氧发酵46h～56h；固态发酵后的产物经干燥、粉碎和包装后制备成一种绿色抗菌促生长饲料添加剂成品。本发明方法制备的饲料添加剂富含小肽、耐高温蛋白酶、耐高温非淀粉多糖酶、中草药有效成分和益生菌，它具有良好的促生长性能与抗病能力，有着良好的应用前景和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，属于饲料添加剂制备的技术领域。
背景技术
自20世纪50年代以来，在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素、β-兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂。抗生素等促生长保健剂在饲料中的应用历史由来已久,它创造了养殖业和饲料工业的革命,使得规模养殖在全世界范围内得到了迅速发展,动物的生产数量和饲料转化率得到大幅度提高。但是,正如所有工业文明的成果都有它的负面影响一样,长期以来使用抗生素等非绿色饲料添加剂, 导致了如下的问题：畜禽和水产产品中药物残留严重，直接危害人体健康；畜禽和水产产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；细菌耐药性增强、耐药菌株增多，威胁人类安全；破坏生态环境等。随着饲料工业和畜牧水产业的迅猛发展，目前我国的畜产品和水产品已从短缺转变为阶段性过剩，人们更关心食品是否安全、卫生，因而绿色消费已成为今后的发展趋势，加之我国已加入ＷＴＯ，发达国家对我国出口的农产品要求越来越严格，目前药物残留问题成为我国畜产品和水产品走出国门的主要障碍之一。因此加速开发、推广和应用新型绿色饲料添加剂势在必行。
酶制剂作为一种饲料添加剂具有无残留、无污染，提高饲料的利用价值，改善动物生产性能和产品品质等作用。饲用酶制剂大致可以分为消化酶和非消化酶两类，通常在营养层面发挥作用。比如提高畜禽消化道内源酶活性，补充内源酶的不足；破坏植物细胞壁，提高饲料的利用效率；消除饲料中的抗营养因子，促进营养物质的消化吸收。目前，酶制剂已经广泛应用于饲料工业，主要有蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等酶制剂。然而，市场上现有的饲用酶制剂多不耐高温，在饲料高温造粒过程中活性损失非常大。
中草药是中国医学宝库中的瑰宝，且中草药作为饲料添加剂，在我国古代已经开始。中草药具有无毒副作用、不易引发细菌抗药性、无残留等特性，作为一种饲用抗生素的绿色替代品在饲料工业得到了广泛的认可。从20世纪80年代起, 中草药已被用于作饲用抗生素替代品, 且取得了一定的应用效果。中草药经过微生物发酵后，其有效成分被充分释放，使其更具生物活性和疗效近年来更是研究热点。中国饲料〔2010，419（15）：13-17〕文献公开了从不同中草药原料中分离得到的米曲霉对中草药进行发酵，发酵料蒸煮液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性分别较对照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%。
国内外的研究结果表明，在日粮中添加一定的小肽可以改善机体对日粮中蛋白质和氨基酸的利用率，提高动物的生长性能。近年来，小肽作为一种绿色促生长饲料添加剂在饲料工业备受关注。目前小肽的制备方法有酶解法和微生物发酵法。酶解法生产活性肽是以蛋白原料为底物,运用蛋白酶的酶解作用，生产小分子肽。酶解法易于控制，作用条件温和适合活性肽的生产。但酶解法需要大量的蛋白酶，生产成本高。因此，酶解法制备活性肽多用于食品与医药行业，低端的饲用活性肽产品很少采用酶解的方法。微生物发酵法是以大分子蛋白质为原料，接入产蛋白酶的微生物，利用微生物发酵过程产生的蛋白酶的酶解作用，生成小分子肽。发酵法把蛋白酶的发酵生产和酶解过程有机结合在一起，降低了活性肽的生成成本，更适合活性肽的生产。专利CNZL200410029787.0“一种活性肽饲料添加剂及制备方法和用途”公开了一种发酵发制备小肽饲料添加剂的方法，它是以植物蛋白和动物蛋白的一种或几种的混合物，经芽孢杆菌等发酵降解，使其水解度控制在20～35％，然后经过后处理可得到小肽饲料添加剂。
小肽作为一种新型绿色促生长饲料添加剂在饲料工业有着很好的应用前景，然而目前小肽并没有在饲料工业得到广泛的应用。无论是酶解法生产的小肽，还是发酵法生产的小肽，高昂的生产成本制约了小肽在饲料工业的广泛应用。另外，现有技术制备的小肽产品功能性成分过于单一，特别是缺乏抗菌性能。因此，亟需大幅度降低小肽的生产成本，以促进小肽在饲料工业的广泛应用；另外，需增强小肽产品的抗菌性能，以进一步增强其促生长性能。
发明内容
针对现有技术制备的小肽由于成本高，很难在饲料工业广泛的应用这一问题，本发明的目的是提供一种方法能够低成本地生产小肽。另外，本发明的另一目的是通过采用耐高温枯草芽孢杆菌发酵制备小肽，使得制备得到的小肽产品还富含耐高温蛋白酶等酶制剂。这不但可以进一步提高小肽产品的促生长效果，而且还能通过生产出耐高温饲用酶制剂而进一步降低其生产成本。此外，本发明的又一目的是使得制备的小肽产品还具备抗菌性能。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55 ℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎的水产蛋白放入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到液态发酵培养基；
（4）往步骤（3）获得的液态发酵培养上接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液；
（5）液态发酵过程的控制：发酵温度为50℃～55℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～350rpm，发酵时间为36h～48h；
（6）发酵结束后发酵液过滤去除沉淀后与粉碎后过60目筛的中草药按0.5～1.5：1的比例混合，并搅拌均匀作为接有菌种的中草药固态发酵培养基；
（7）固态发酵：将步骤（6）获得的接有菌种的中草药固态发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在50℃~55℃，发酵时间为46h～56h；
（8）成品处理：固态发酵结束，将发酵后获得的产物经干燥、粉碎和包装后，即制得了一种绿色抗菌促生长饲料添加剂成品。
所述步骤（1）中所用的产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2已于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60001，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。所述步骤（3）中水产蛋白的加入量以添加的水产蛋白的质量占液态发酵培养基总质量百分比计，为10%～40%。
所述步骤（3）中营养物为葡萄糖、氯化钙、氯化亚铁和磷酸氢二钾组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占液态发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，氯化钙0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（4）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液的接种量以接入的种子液的质量占液态发酵培养基总质量百分比计，为1%～9%。
所述步骤（6）中的中草药为甘草、连翘、车前草、苏子、五味子、马鞭草、黄芪、金银花、石榴皮、地榆、黄连、鱼腥草、苦参和土茯苓中的一种或其中两种以上的混合物。
本发明与现有的发酵法制备小肽的技术相比，有如下优点。
（1）发酵产品可以在饲养动物体内发挥蛋白酶的功效。现有小肽的发酵制备采用的都是常温的菌种，其在发酵过程中产生的蛋白酶的活性在产品制备的干燥过程和用于饲料的高温造粒过程中会损失殆尽。因而，现有发酵技术制备的小肽产品用于饲料在动物体内并不能发挥蛋白酶的功效。而本技术采用耐高温的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行发酵，发酵过程产生耐高温的蛋白酶，这些耐高温蛋白酶的活性在产品制备的干燥和用于饲料的高温造粒过程中基本没有损失，因而本技术制备的饲料添加剂可在动物体内发挥蛋白酶的功效。
（2）成本低。与现有的发酵法制备小肽相比，本发明提供的技术方案中，原料不用灭菌，可降低能耗和成本。另外，本发明将小肽的发酵生产和饲用酶制剂的发酵生产合二为一，饲用酶制剂的生产会分摊部分生产成本，从而进一步降低小肽的生产成本。此外，本发明将小肽产品的后处理程序与中草药的固态发酵有机结合在一起，中草药的发酵生产会分摊部分生产成本，这又进一步降低小肽的生产成本。
（3）发酵效果好，小肽含量高。与现有的发酵法制备小肽相比，本发明提供的技术方案中，原料不用灭菌，从而使得水产蛋白丰富的内源酶得以保留；另外，内源酶的最适酶解温度和微生物发酵温度一致。因此，在内源酶和发酵所产酶的协同作用下，制备得到的小肽含量会更高；在加上高温会提高酶的活性，会进一步提高小肽含量。
（4）产品富含中草药有效成分，可增强其抗病力，并进一步提高其促生长性能。本产品将含有小肽的发酵液直接与中草药进行混合发酵，通过微生物的发酵作用将中草药的有效成分释放出来，从而使得最终制备的成品具有良好的抗菌性能。
（5）可有效保护水产蛋白中热敏性的功能因子。本发明的技术方案中，由于原料可以不经灭菌，因而，水产蛋白中热敏性的功能因子的活性得以有效保留。例如，虾头和南极磷虾中的虾青素。
本发明和现有的中草药发酵技术相比，具有以下优点。
（1）与现有的中草药发酵技术相比，本发明提供的技术方案中，原料不用灭菌，可降低能耗和成本。另外，本发明将中草药的发酵生产和饲用酶制剂（主要为非淀粉多糖酶）的发酵生产合二为一，饲用酶制剂的生产会分摊部分生产成本，从而进一步降低中草药发酵的成本。
（2）发酵产品可以在饲养动物体内发挥非淀粉多糖酶的功效。现有中草药的发酵采用的都是常温的菌种，其在发酵过程中产生的非淀粉多糖酶的活性在产品制备的干燥过程和用于饲料的高温造粒过程中会损失殆尽。因而，现有技术制备的发酵中草药产品用于饲料在动物体内并不能发挥非淀粉多糖酶的功效。而本技术采用耐高温的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行发酵，发酵过程产生耐高温的非淀粉多糖酶，这些耐高温非淀粉多糖酶的活性在产品制备的干燥和用于饲料的高温造粒过程中基本没有损失，因而本技术制备的饲料添加剂可在动物体内发挥非淀粉多糖酶的功效。
本发明提供了一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法。本发明得到的绿色抗菌促生长饲料添加剂在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，用本发明生产的绿色抗菌促生长饲料添加剂配合的饲料，不但可提高饲养动物的生长效果，而且还可提高饲养动物的免疫力和抗病力，可直接用来配制绿色饲料，具有良好的应用前景和社会意义。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就水产蛋白的种类、中草药的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2
接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55 ℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的南极磷虾绞碎后备用。将15公斤绞碎的南极磷虾和100公斤水加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入300克葡萄糖、600克氯化钙、600克氯化亚铁和700克磷酸氢二钾，获得发酵培养基；往发酵罐中的发酵培养基中加入8公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液；发酵温度为50℃，无菌空气通入量为1.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为250rpm～350rpm，发酵时间为45h；发酵结束后发酵液经过滤去除虾壳后与鱼腥草按1.5：1的比例混合，并搅匀作为加入菌种的固态培养基；加入菌种的固态培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为50℃，发酵时间为48h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种绿色抗菌促生长饲料添加成品。
实施例2：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2
接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55 ℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的虾头绞碎后备用。将20公斤绞碎的虾头和100公斤水加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入330克葡萄糖、650克氯化钙、580克氯化亚铁和750克磷酸氢二钾，获得发酵培养基；往发酵罐中的发酵培养基中加入9公斤枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液；发酵温度为55℃，无菌空气通入量为1.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为250rpm～350rpm，发酵时间为40h；发酵结束后发酵液经过滤去除虾壳后与甘草按1：1的比例混合，并搅匀作为加入菌种的固态培养基；加入菌种的固态培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为55℃，发酵时间为50h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种绿色抗菌促生长饲料添加成品。
Claims (7)
1.一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55 ℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎的水产蛋白放入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到液态发酵培养基；
（4）往步骤（3）获得的液态发酵培养上接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液；
（5）液态发酵过程的控制：发酵温度为50℃～55℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～350rpm，发酵时间为36h～48h；
（6）发酵结束后发酵液过滤去除沉淀后与粉碎后过60目筛的中草药按0.5～1.5：1的比例混合，并搅拌均匀作为接有菌种的中草药固态发酵培养基；
（7）固态发酵：将步骤（6）获得的接有菌种的中草药固态发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在50℃~55℃，发酵时间为46h～56h；
（8）成品处理：固态发酵结束，将发酵后获得的产物经干燥、粉碎和包装后，即制得了一种绿色抗菌促生长饲料添加剂成品；
所述步骤（1）中所用的产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60001。
2.根据权利要求1所述的一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤（3）中水产蛋白的加入量以添加的水产蛋白的质量占液态发酵培养基总质量百分比计，为10%～40%。
4.根据权利要求1所述的一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤（3）中营养物为葡萄糖、氯化钙、氯化亚铁和磷酸氢二钾组成的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占液态发酵培养基总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，氯化钙0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。
6.根据权利要求1所述的一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤（4）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HL-2种子液的接种量以接入的种子液的质量占液态发酵培养基总质量百分比计，为1%～9%。
7.根据权利要求1所述的一种利用水产蛋白两步发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤（6）中的中草药为甘草、连翘、车前草、苏子、五味子、马鞭草、黄芪、金银花、石榴皮、地榆、黄连、鱼腥草、苦参和土茯苓中的一种或其中两种以上的混合物。
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