CN114946999A - 一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法 - Google Patents

一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法。本发明采用虾头与磷虾，先加入枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，先酶解一段时间后，再以一定流速加入木瓜蛋白酶溶液进行酶解；酶解结束后，进行灭酶处理，过滤后，收集滤液，进行浓缩和喷雾干燥即可制备得到高抗菌性促生长饲料添加剂。本发明提供的高抗菌性促生长饲料添加剂不仅具有较高的抗菌活性，将其添加到饲料中能显著提高断奶仔猪的平均日采食量与平均日增重量及降低料重比，提高仔猪的血清抗氧化功能，并且还能显著提高血清IgG水平，改善机体的免疫功能，提高了产品中抗菌肽的含量。

Description

一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的 方法
技术领域
本发明属于农业生产技术领域。更具体地，涉及一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法。
背景技术
自20世纪50年代以来，在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素、β-兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂。抗生素等促生长保健剂在饲料中的应用历史由来已久，它创造了养殖业和饲料工业的革命，使得规模养殖在全世界范围内得到了迅速发展，动物的生产数量和饲料转化率得到大幅度提高。但是，正如所有工业文明的成果都有它的负面影响一样，长期以来使用抗生素等非绿色饲料添加剂，会导致了如下问题：(1)畜禽和水产产品中药物残留严重，直接危害人体健康；(2)畜禽和水产产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；(3)细菌耐药性增强、耐药菌株增多，威胁人类安全；(4)破坏生态环境等。随着饲料工业和畜牧水产业的迅猛发展，目前我国的畜产品和水产品已从短缺转变为阶段性过剩，人们更关心食品是否安全、卫生，因而绿色消费已成为今后的发展趋势，加之我国已加入WTO，发达国家对我国出口的农产品要求越来越严格，目前药物残留问题成为我国畜产品和水产品走出国门的主要障碍之一。因此加速开发、推广和应用新型绿色饲料添加剂势在必行。
作为饲用抗生素的一种替代品，抗菌肽通常具有耐热、抗菌谱广、水溶性好和不易产生耐药性等特性，近年来备受关注。然而，目前只有含有一定特殊结构的肽类才具有抗菌活性，绝大多数的蛋白质通过水解后高温灭酶很难具有抗菌活性。如中国专利公开了一种申利用四角蛤蜊加工废弃物分段酶解生产饲料添加剂的方法，采用酶解水产蛋白制备饲料添加剂，但该方法制备的饲料添加剂没有抗菌活性，不能在饲料中作为抗生素的替代物。为了提供更多的具备抗菌活性的饲料或者饲料添加剂，有必要研究和开发出更多的具备抗菌活性的饲料或者饲料添加剂应用于农业生产中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法。
本发明的目的是提供一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法。
本发明另一目的是提供高抗菌性的促生长饲料添加剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法，包括以下步骤：
S1.将虾头和/或磷虾与水混合，进行匀浆，得匀浆液；
S2.采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶对步骤S1制备的匀浆液进行酶解处理；
S3.再添加木瓜蛋白酶对步骤S2酶解处理后的匀浆液进行酶解处理；
S4.酶解结束后，进行灭酶处理，将酶解液过滤，收集滤液，进行浓缩和喷雾干燥，即得到抗菌活性高促生长的饲料添加剂。
本发明以虾头和/或磷虾为酶解原料，通过研究不同蛋白酶酶解方式，以枯草芽孢杆菌中性蛋白酶进行第一次酶解，再使用木瓜蛋白酶进行第二次酶解得到了抗菌活性较高的酶解液，提高产品中抗菌肽的含量。再将得到的酶解液用于制备高抗菌性促生长饲料添加剂，并将制备得的饲料添加剂添加到饲料中能显著提高断奶仔猪的平均日采食量与平均日增重量及降低料重比，提高仔猪的血清抗氧化功能，并且还能显著提高血清IgG水平，改善机体的免疫功能。
本发明通过对南美白对虾虾头与南极磷虾混合比例的优化，可进一步提高酶解液的抗菌活性。
优选地，步骤S1中虾头与磷虾的质量比为5～10:1～5。
优选地，虾头与磷虾的质量比为8～9:1～2。
更优选地，虾头与磷虾的质量比为8:2。
优选地，步骤S1所述虾头和/或磷虾与水混合的质量比为1:1～3。
更优选地，所述虾头和/或磷虾与水混合的质量比为1:3。
优选地，步骤S2中采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的终浓度为20～30IU/g。
更优选地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的终浓度为25IU/g。
优选地，步骤S2中酶解条件为：45～55℃，转速80～150r/min，1～4h。
更优选地，酶解条件为：50℃，转速100r/min，2h。
优选地，步骤S3中木瓜蛋白酶的终浓度为15～25IU/g。
更优选地，木瓜蛋白酶的终浓度为15IU/g。
优选地，步骤S3中通过一定流速将木瓜蛋白酶溶液添加到步骤S2酶解处理后的匀浆液中，木瓜蛋白酶溶液的浓度为150～250IU/mL，流速为80～150m L/h/kg，流加时间为1～2h。
更优选地，流速为：100m L/h/kg，流加时间1h。
优选地，步骤S3中酶解条件为：45～55℃，转速80～150r/min，1～3h。
更优选地，酶解条件为：50℃，转速100r/min，1h。
优选地，步骤S3中灭酶处理为95～100℃灭酶5～10min。
更优选地，灭酶处理为100℃灭酶5min。
优选地，所述虾头为南美白对虾虾头，所述磷虾为南极磷虾。
本发明提一种供高抗菌性促生长的饲料添加剂，由上述方法制备得到。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法，通过先使用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶进行第一次酶解，再使用木瓜蛋白酶进行第二次酶解，制备得到了抗菌活性较高的酶解液，用于制备高抗菌性促生长饲料添加剂；并进一步通过精准的流加法酶解法，以及对南美白对虾虾头与南极磷虾混合比例的优化，大大提高了酶解液的抗菌活性，制备的活性肽产品中富含高抗菌性的抗菌肽，在饲料工业中具有更好的应用效果；将其制备得的饲料添加剂添加到饲料中，能显著提高断奶仔猪的平均日采食量、平均日增重量及降低料重比，提高仔猪的血清抗氧化功能，并且还能显著提高血清IgG水平，改善机体的免疫功能。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1高抗菌性促生长饲料添加剂的制备
本实施例提供一种利用虾头和/或磷虾制备抗菌活性高、促生长的饲料添加剂的方法，包括以下步骤：
S1.将南美白对虾虾头与水按质量比为1:3的比例混合，并用打浆机进行匀浆，得匀浆液；
S2.采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶对步骤S1制备的匀浆液进行酶解处理，在酶解温度为50℃，转速为100r/min的条件下酶解2h；
S3.再添加木瓜蛋白酶对步骤S2酶解处理后的匀浆液进行酶解处理，50℃，转速100r/min，1h；通过一定流速将木瓜蛋白酶溶液添加到步骤S2酶解处理后的匀浆液中，流速为80～150m L/h/kg，流加时间为1～2h；
S4.酶解结束后，进行灭酶处理，于100℃灭酶5min，然后于5000r/min离心10min，收集上清液；将酶解液过滤，收集滤液，上清液用0.22μm微孔膜过滤，再进行浓缩和喷雾干燥，即得到抗菌活性高促生长的饲料添加剂。
实施例2高抗菌性促生长饲料添加剂的制备
本实施例提供一种利用虾头和/或磷虾制备抗菌活性高、促生长的饲料添加剂的方法，包括以下步骤：
S1.将南极磷虾与水按质量比为1:3的比例混合，并用打浆机进行匀浆，得匀浆液；
S2.采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶对步骤S1制备的匀浆液进行酶解处理，在酶解温度为50℃，转速为100r/min的条件下酶解2h；
S3.再添加木瓜蛋白酶对步骤S2酶解处理后的匀浆液进行酶解处理，50℃，转速100r/min，1h；通过一定流速将木瓜蛋白酶溶液添加到步骤S2酶解处理后的匀浆液中，流速为80～150m L/h/kg，流加时间为1～2h；
S4.酶解结束后，进行灭酶处理，于100℃灭酶5min，然后于5000r/min离心10min，收集上清液；将酶解液过滤，收集滤液，上清液用0.22μm微孔膜过滤，再进行浓缩和喷雾干燥，即得到抗菌活性高促生长的饲料添加剂。
实施例3高抗菌性促生长饲料添加剂的制备
本实施例提供一种利用虾头和/或磷虾制备抗菌活性高、促生长的饲料添加剂的方法，包括以下步骤：
S1.将南美白对虾虾头与南极磷虾进行混合后，再虾将混合物与水按质量比为1:3的比例混合，并用打浆机进行匀浆，得匀浆液；
S2.采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶对步骤S1制备的匀浆液进行酶解处理，在酶解温度为50℃，转速为100r/min的条件下酶解2h；
S3.再添加木瓜蛋白酶对步骤S2酶解处理后的匀浆液进行酶解处理，50℃，转速100r/min，1h；通过一定流速将木瓜蛋白酶溶液添加到步骤S2酶解处理后的匀浆液中，流速为80～150m L/h/kg，流加时间为1～2h；
S4.酶解结束后，进行灭酶处理，于100℃灭酶5min，然后于5000r/min离心10min，收集上清液；将酶解液过滤，收集滤液，上清液用0.22μm微孔膜过滤，再进行浓缩和喷雾干燥，即得到抗菌活性高促生长的饲料添加剂。
实施例4酶解方式对酶解液抗菌活性的影响
本实施例采用的抗菌活性高促生长的饲料添加剂的制备方法同实施例1，区别在于在步骤S2和S3的酶解方式不同，其分别按照下表1的加酶方式进行酶解，收集过滤液用于测定抑菌率。
将大肠杆菌接种于LB液体培养基，并置于37℃、150r/min震动培养16h。培养结束后，取50μL大肠杆菌培养液接入到5mL无菌LB液体培养基中，并混匀，得到大肠杆菌菌悬液。取无菌96孔板，分为2组，即对照组与样品组，每组3个平行，即3个孔。每个孔分别取190μL大肠杆菌菌悬液，对照组3个孔分别都加入10μL无菌水，样品组3个孔分别都加入10μL酶解液，加样结束后用酶标仪测定OD630，然后于37℃培养16小时，再测定OD630，根据菌体光密度的变化计算酶解液对大肠杆菌的抑菌率大小，其计算公式为：
I＝(1-AE/AC)×100％
其中，I＝酶解液抑菌率(％)；AE＝样品组三次平行吸光值差的平均值；AC＝空白组三次平行吸光值差的平均值。
结果由表1可知，不同的蛋白酶酶解方式对酶解液抑菌率影响很大。单独采用枯草芽孢杆菌蛋白酶或木瓜蛋白酶，其酶解液都没有抗菌活性；在双酶酶解中，酶的加入时间和方法对抗菌活性都有影响，最终加入的双酶的酶解浓度相同，但是加酶方式不同，对酶解液的抑菌率影响特别大。其中，采用先添加枯草芽孢杆菌蛋白酶，然后再流加木瓜蛋白酶的方式，最优利于具有抑菌活性的肽的生成。
表1不同酶解方式对酶解液抑菌率的影响
Figure BDA0003635117520000051
Figure BDA0003635117520000061
实施例5不同的原料组合对酶解液抗菌活性的影响
本实施例采用的抗菌活性高促生长的饲料添加剂的制备方法同实施例3，区别在于，将南美白对虾虾头与南极磷虾按5种不同比例(虾头：南极磷虾＝9:1、虾头：南极磷虾＝8:2、虾头：南极磷虾＝7:3、虾头：南极磷虾＝6:4、虾头：南极磷虾＝5:5)进行混合制备；以单独采用南美白对虾虾头与南极磷虾为对照，其混合物与水按质量比为1:3的比例再混合，并用打浆机打浆，得到匀浆液备用；在酶解温度为50℃，转速为100r/min的条件下酶解，将匀浆液分别先用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶终浓度为25IU/g酶解2h后，再流加150IU/mL木瓜蛋白酶溶液，流加速度为100m L/h/kg，流加时间为1h，使其终浓度为15IU/g，继续酶解1h；酶解结束后，置于100℃灭酶5min；然后于5000r/min离心10min，收集上清液；上清液用0.22μm微孔膜过滤，过滤液用于测定抑菌率。
结果由表2可知，在南美白对虾虾头中添加南极磷虾对酶解液的抗菌活性有较大的影响。当虾头与南极磷虾的质量比为8:2时，酶解液的抗菌活性最佳。可见，当在虾头酶解体系中，加入一定量南极磷虾时，可以使得抑菌基团更容易暴露出来或生成，提高酶解液的抗菌活性。
表2不同的原料组合对酶解液抗菌活性的影响
Figure BDA0003635117520000062
Figure BDA0003635117520000071
实施例6利用虾头和磷虾制备抗菌活性高促生长的饲料添加剂
将80公斤南美白对虾虾头与20公斤南极磷虾混合，并往混合物中加入300公斤水，并用打浆机打浆，得到匀浆液备用；将上述匀浆液加入到发酵罐中，并往发酵罐中加入枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，使其终浓度为25IU/g，酶解温度为50℃，转速为100r/min；将木瓜蛋白酶溶于水中，使其终浓度为15IU/g，并将木瓜蛋白酶溶液加入发酵罐的补料罐中备用；枯草芽孢杆菌中性蛋白酶酶解体系开始2h后，通过补料罐的蠕动泵将木瓜蛋白酶水溶液流加到发酵罐中，木瓜蛋白酶水溶液的流加速度为100m L/h/kg，流加时间为1h。
木瓜蛋白酶水溶液流加结束后，继续在酶解温度为50℃，转速为100r/min的条件下酶解1h；酶解结束后，于100℃灭酶5min；灭酶后的酶解液经过滤收集滤液，然后经浓缩和喷雾干燥即可制备得到抗菌活性高促生长的饲料添加剂成品。
制备得到的饲料添加剂的技术指标为：抑菌率95％(稀释1000倍)，分子量小于2000u的蛋白质水解物所占比例为90％；以上为酶解液经浓缩和喷雾干燥的成品的抑菌率。
实施例7饲料添加剂对断奶仔猪生长性能及免疫力的影响
采用108头日龄、体质量相近、健康状况良好的断奶仔猪，随机分为3组，每组3个重复，每个重复12头猪，公母各半。其中对照组采用基础日粮组，实验1组为每吨饲料添加300克实施例6中制备的添加剂，实验2组为每吨饲料添加600克实施例6中制备的添加剂，每日每组投喂相同量的饲料。
试验期间，记录每个重复的采食量和每个试验期的末质量，计算平均日增质量、平均日采食量和料质量比。试验结束(即第29天)后前腔静脉采血5mL(每个重复3头猪)，室温下倾斜静置30min后，以5000r/min离心10min，取上层血清，分装在1.5min离心管中，-20℃保存备测。测定指标有超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC)等抗氧化能力指标，并测定血清IgG。
测定结果由下表3可知，饲料中添加600克饲料添加剂能显著提高断奶仔猪的平均日采食量与平均日增重量及降低料重比。由表4结果可知，饲料中添加600克饲料添加剂可以显著提高SOD、GSH和T-AOC的含量，提高仔猪的血清抗氧化功能。并且还能显著提高血清IgG水平，改善机体的免疫功能。
表3添加剂对断奶仔猪生长性能的影响
Figure BDA0003635117520000081
表4添加剂对断奶仔猪血清抗氧化功能与免疫功能的影响
Figure BDA0003635117520000082
综上可知，本发明提供的抗菌活性高促生长的饲料添加剂的制备方法，通过研究不同蛋白酶酶解方式，筛选出抗菌活性较高的酶解方法用于制备饲料添加剂；通过对南美白对虾虾头与南极磷虾混合比例的优化，进一步提高了酶解液的抗菌活性；并将制备得的饲料添加剂添加到饲料中，能显著提高断奶仔猪的平均日采食量与平均日增重量及降低料重比，提高仔猪的血清抗氧化功能，并且还能显著提高血清IgG水平，改善机体的免疫功能。本发明通过精准的流加法酶解控制，使酶解液的抗菌活性大大增强，制备的活性肽产品中富含抗菌肽，在饲料工业中具有更好的应用效果；通过优化原料组合，提高了酶解液的抗菌活性，提高了产品中抗菌肽的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用虾头和/或磷虾制备高抗菌性促生长饲料添加剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将虾头和/或磷虾与水混合，进行匀浆，得匀浆液；
S2.采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶对步骤S1制备的匀浆液进行酶解处理；
S3.再添加木瓜蛋白酶对步骤S2酶解处理后的匀浆液进行酶解处理；
S4.酶解结束后，进行灭酶处理，将酶解液过滤，收集滤液，进行浓缩和喷雾干燥，即得到抗菌活性高促生长的饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中虾头与磷虾的质量比为5～10:1～5；优选地，虾头与磷虾的质量比为8～9:1～2。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述虾头和/或磷虾与水混合的质量比为1:1～3。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2采用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的终浓度为20～30IU/g。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中酶解条件为：45～55℃，转速80～150r/min，1～4h。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中木瓜蛋白酶的终浓度为15～25IU/g。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中通过一定流速将木瓜蛋白酶溶液添加到步骤S2酶解处理后的匀浆液中，木瓜蛋白酶溶液的浓度为150～250IU/mL，流速为80～150m L/h/kg，流加时间为1～2h。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中酶解条件为：45～55℃，转速80～150r/min，1～3h。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中灭酶处理为95～100℃灭酶5～10min。
10.一种抗菌活性高促生长的饲料添加剂，其特征在于，由权利1-9任一所述方法制备得到。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105746889A (zh) * 2016-03-09 2016-07-13 广东海洋大学 一种利用水产蛋白两部发酵制备绿色抗菌促生长饲料添加剂的方法
CN110720549A (zh) * 2019-10-10 2020-01-24 浙江海洋大学 一种南极磷虾虾溶浆的制备方法

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