CN110583971A - 一种富硝甜菜粉及其制备方法和用途 - Google Patents

一种富硝甜菜粉及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了富硝甜菜粉及其制备方法和用途，该方法通过制备甜菜匀浆、液体培养基、发酵转化和冷冻干燥制得富硝甜菜粉。所述富硝甜菜粉中亚硝酸盐的含量不低于1300mg/kg，具有适用于肉制品加工的色度值；可适用于肉制品的发色和抑菌。

Description

一种富硝甜菜粉及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及食品添加剂领域，特别涉及一种天然来源的肉类食品发色添加剂及其制备方法。
背景技术
亚硝酸钠具有发色、抑菌、抗氧化、改善风味等作用，因此常用作添加剂添加到食品中，特别是作为不可替代的添加剂应用在肉制品领域。多种研究表明，亚硝酸盐可以与蛋白质降解物、氨基酸反应，产生具有强致癌作用的N-亚硝胺。因此，食品加工特别是肉制品加工中亚硝酸钠的添加量及亚硝酸盐的残留量已经成为了大家普遍关注的安全问题。
随着消费者对于肉制品中添加亚硝酸盐的安全问题越来越重视，美国农业部提出了天然有机肉制品的概念，并规定天然和有机食品要求在加工过程中不允许添加人工或化学合成的物质，亚硝酸盐作为一种人工合成添加剂禁止应用在天然有机肉制品中，目前还没有一种物质可以完全替代亚硝酸盐的发色、抑菌作用，所以寻找天然来源的亚硝酸盐尤为重要。天然有机肉制品中，蔬菜产品可以作为肉制品的添加剂。
目前，由于芹菜汁和芹菜粉与加工肉制品高度相容，并且芹菜具有非常少的植物色素和类似于生芹菜的温和风味特征，不会大大降低成品风味，多数研究都集中在芹菜的亚硝酸盐转化。然而，芹菜在亚硝酸盐转化中需要脱色处理，生产工序繁杂，导致生产成本高；并且芹菜具有致敏性，不适用于对芹菜过敏的人群食用。
肉制品的颜色是重要的感官之一，可以影响消费者购买的欲望，并可以预先确定消费者对风味和味道的期望和调节食欲。越来越多消费者认为天然色素更安全，天然色素的使用也越来越多。对于自然色料，预计其年增长率为5-10％，而合成色料的年增长率将明显低于3-5％。为了满足对天然色素日益增长的需求，人们一直寻找新的色素来源。
基于上述原因，本发明提供了一种天然来源的亚硝酸盐替代物及其制备方法，其具有较高的亚硝酸盐含量与较好的色泽，可以作为色素和亚硝酸盐替代物进行肉类食品加工，满足工业上肉制品发色的要求和食品安全性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：利用硝酸盐/亚硝酸盐含量比较高的甜菜，采用微生物转化制备天然来源的亚硝酸盐，替代合成的亚硝酸盐；还可以利用甜菜中的甜菜红素发色，降低了添加量。甜菜红素还可以促进NO释放，生成亚硝基肌红蛋白，促进发色抑菌，延缓腐败，从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供以下方面：
第一方面，本发明提供一种了亚硝酸盐替代物的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)蔬菜匀浆的制备；
(2)液体培养基的制备；
(3)将蔬菜匀浆和选定的微生物加入到液体培养基中发酵转化，得到发酵液；
(4)冷冻干燥发酵液的上清液，得到亚硝酸盐替代物。
其中，所述蔬菜选用菠菜、苦苣、生菜、芥蓝、甜菜、芹菜、小白菜、韭菜或香芹制备亚硝酸盐替代物，优选为甜菜。
第二方面，本发明提供了一种富硝甜菜粉的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备甜菜匀浆；
(2)制备液体培养基；
(3)将甜菜匀浆和选定的微生物加入到液体培养基中发酵转化，得到发酵液；
(4)冷冻干燥发酵液的上清液，得到富硝甜菜粉。
其中，在步骤(1)中，将新鲜甜菜研磨成浆状；
在步骤(2)中，所述液体培养基是指质量浓度为2％～8％的葡萄糖灭菌溶液，优选为4％的葡萄糖灭菌溶液。
步骤(3)中，
所述甜菜匀浆的加入到液体培养基中的质量浓度为2～3％，优选为2～2.5％；
发酵时间为24～48h，优选为24～36h。
进一步地，步骤(3)中，
所述微生物为凝固酶阴性菌，能够产生硝酸还原酶；
微生物选自考克氏变异菌，肉糖葡萄球菌或木糖葡萄球菌，优选为木糖葡萄球菌；
微生物接种量为6×104～1.5×108cfu/g；优选为6×105～1.2×108cfu/g；
恒温发酵。
步骤(3)中，任选地，发酵时还可以加入氯化钠；所述氯化钠的质量浓度为0～6％，优选为0～4％；
在发酵液中，亚硝酸盐含量为300～500mg/kg，优选为400～500mg/kg。
第三方面，本发明提供了上述方法制得的富硝甜菜粉，亚硝酸盐的含量不低于1300mg/kg，优选不低于1200mg/kg。
所述富硝甜菜粉色度值中，
L：25～30；a值：7～10；b值：1～2.5；
所述富硝甜菜粉中，水分为3～5％、灰分为2.4～2.6％、还原糖为2.8～3.2％、蛋白质为1～1.1％、脂肪为0％。
第四方面，本发明提供了上述亚硝酸盐替代物及富硝甜菜粉在肉制品发色中的用途；
进一步地，在肉制品抑菌中的用途。
根据本发明提供的富硝甜菜粉及其制备方法，具有以下有益效果：
(1)以甜菜为原料生产天然亚硝酸盐替代物，生产出有机肉制品，提高了甜菜的综合利用程度；
(2)充分利用了甜菜根富含高含量的硝酸盐，通过将硝酸盐转化成亚硝酸盐，最终获得的富硝甜菜粉可以应用于高温肉制品和低温肉制品中，达到与低剂量亚硝酸盐相同的效果，可以显著降低亚硝酸盐残留量与延长储藏时间；
(3)甜菜为原料充分利用了其具有的甜菜红素，可以促进NO释放，生成亚硝基肌红蛋白，促进发色，并且可以抑菌，延缓腐败。
附图说明
图1示出蔬菜浓度对亚硝酸盐含量的影响；
图2示出发酵时间对亚硝酸盐含量的影响；
图3示出盐浓度对亚硝酸盐含量的影响；
图4示出接菌量对亚硝酸盐含量的影响。
具体实施方式
下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些示例性说明而变得更为清楚、明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
以下详述本发明。
研究发现，蔬菜是一种易于富集硝酸盐、亚硝酸盐的植物性食品，其硝酸盐含量很高，是人们硝酸盐摄入的主要来源。
蔬菜安全性高，由蔬菜制成的天然来源的亚硝酸盐替代合成的亚硝酸盐可以提高肉制品的营养价值和肉制品的安全性；同时利用蔬菜的天然色素，可以同时满足食品加工特别是肉制品加工中对色素和亚硝酸盐的需求。
不同种类的蔬菜硝酸盐和亚硝酸盐含量差异巨大，应用于肉制品时需要考虑蔬菜中硝酸盐/亚硝酸盐含量、色素含量和气味，以适用于作为肉制品的天然添加剂。
优选地，选用菠菜、苦苣、生菜、芥蓝、甜菜(红菜头)、芹菜、小白菜、韭菜或香芹制备亚硝酸盐替代物。
在肉制品中，亚硝酸盐的发色作用可以使肉制品保持鲜红粉嫩的色泽；甜菜中含有的甜菜红素同样可以使肉制品保持相同的色泽，因而甜菜红素可以与亚硝酸盐的发色作用起到协同或共同发色的作用。并且，甜菜红素可被生物利用，安全性非常高。甜菜对肉制品的风味干扰也比较低。
结合致敏性、硝酸盐/亚硝酸盐含量、颜色和风味，优选使用甜菜作为亚硝酸盐和色素替代物。
基于此，本发明提供了一种富硝甜菜粉作为天然亚硝酸盐和色素，以替代合成亚硝酸盐和色素。
在本发明中，所述硝酸盐指含有硝酸根的无机盐，包括但不限于钠盐和钾盐；所述亚硝酸盐指含有亚硝酸根的无机盐，包括但不限于钠盐和钾盐。
本发明还提供了所述富硝甜菜粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)甜菜匀浆的制备；
(2)液体培养基的制备；
(3)将甜菜匀浆和微生物加入到液体培养基中发酵转化，得到发酵液；
(4)冷冻干燥发酵液的上清液，得到富硝甜菜粉。
在步骤(1)甜菜匀浆的制备中，将甜菜研磨成浆状即可。
优选地，将新鲜甜菜用自来水冲洗掉泥土，再用去离子水冲洗，晾干后研磨成匀浆状。
在制备甜菜匀浆的过程中，为了避免引入非必要微生物，影响后续的发酵转化，优选将制备过程中用到的设备，例如案板、研磨机或研钵、菜刀等用75％酒精擦洗并晾干后再使用。
在步骤(2)中，所述液体培养基是指质量浓度为2％～8％的葡萄糖灭菌溶液，优选为4％的葡萄糖灭菌溶液。
优选地，所述液体培养基的制备按照如下进行：
将葡萄糖粉制成的质量浓度为4％葡萄糖溶液，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，冷却备用。
在步骤(3)中，为了避免杂菌的引入，影响发酵中设定微生物的发酵转化效果，优选进行无菌操作，更优选在超净工作台下进行无菌操作。
将甜菜匀浆加入到液体培养基中，利用选定微生物的发酵转化作用将甜菜中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，从而使最终制得的富硝甜菜粉不仅可以用于肉类制品的发色，同时还具有抑菌、抗氧化和改善风味等作用。
为了更好地将甜菜中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，所述甜菜匀浆的加入到液体培养基中的质量浓度为2～3％，优选为2～2.5％，此时，转化液体中硝酸盐接近饱和。
研究发现，将甜菜匀浆中硝酸盐转化为亚硝酸盐的微生物种类有很多，但是由于甜菜中复杂的成分，多数微生物的转化效果不理想，或者会产生其他有毒有害物质，不适用于食品加工领域。
经多次研究发现，选用特定种类的微生物可以很好地提高甜菜匀浆中硝酸盐转化为亚硝酸盐的转化率，同时制得的富硝甜菜粉无有毒有害物质，安全性高。
较好地，利用微生物产生的凝固酶阴性菌产硝酸还原酶将甜菜匀浆中硝酸盐转化为亚硝酸盐，同时保持甜菜匀浆中的甜菜红素不被分解，使得富硝甜菜粉可以使肉制品保持良好、稳定的粉红色。
用于发酵转化的微生物选自考克氏变异菌，肉糖葡萄球菌或木糖葡萄球菌，优选为木糖葡萄球菌。
接菌量升高时亚硝酸盐含量也升高，这是因为在低接种量条件下微生物难以繁殖，数量太少，菌种在发酵期间不占优势，微生物产硝酸盐还原酶数量少，酶活力较低。但是接种量增加会导致菌种延滞期缩短和微生物之间竞争营养物质，抑制了木糖葡萄球菌的生长条件，更不利于其产生硝酸盐还原酶。
较好地，液体培养基中微生物接种量为6×104～1.5×108cfu/g；优选为6×105～1.2×108cfu/g，更优选为6×105～1.5×107cfu/g。
发酵时，优选培养温度为30～35℃，恒温培养；更优选为30℃恒温培养，满足菌种的最佳培养温度。
研究发现，发酵初期木糖葡萄球菌为优势菌种，随着时间增加，菌产硝酸盐还原酶的增多可以使甜菜中的硝酸盐逐渐还原成亚硝酸盐。另外，当有硝酸盐存在时，会阻止亚硝酸还原酶的作用，抑制了亚硝酸盐被还原成氨类物质。菌产硝酸盐还原酶和甜菜本身的硝酸盐还原酶起协同作用，加快硝酸盐的转化。然而随着时间的延长，大量的硝酸盐被消耗还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐含量占据主导地位时，甜菜中的亚硝酸盐还原酶起作用将亚硝酸盐还原为氨类物质。
优选地，发酵时间为24～48h，可以使微生物将其中的硝酸盐充分转化为亚硝酸盐。更优选地，发酵时间为24～36h，最好为24～30h。
此时，在24h之前反应体系内含有较多的硝酸盐，微生物的硝酸盐还原酶会将其还原为亚硝酸盐，从而提高亚硝酸盐的含量。在此期间，由于硝酸盐抑制了微生物中亚硝酸盐还原酶的活性，亚硝酸盐不会被还原成氨类物质。
之后，由于体系内硝酸盐大部分被消耗，菌产硝酸盐还原酶能力下降，此时微生物中的亚硝酸还原酶将亚硝酸盐还原成氨类物质，亚硝酸盐含量出现下降。
另外，在本发明中，为了充分利用甜菜本身具有的硝酸盐还原酶及其原有的紫红色，为防止高温使其颜色变性和酶活力丧失，并没有烫漂甜菜。然而甜菜匀浆中含有硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶，这两种酶具有动态平衡的关系，当木糖葡萄球菌由初期的优势菌逐渐劣化后，杂菌开始生长，杂菌对亚硝酸盐的利用也可能导致亚硝酸盐含量进一步下降。
任选地，还可以在发酵前向液体培养基中加入氯化钠，以满足微生物生长过程中对钠离子、氯离子及溶液渗透压的需求。
然而，Na+的浓度超过适宜浓度后，盐浓度增加会降低微生物生长，进而对硝酸盐还原酶的活性具有抑制作用。
较好地，所述氯化钠的加入量(质量浓度)为0～6％，优选为0～4％，更优选为0～2％，可以使微生物生长良好。
发酵完成后，得到含有甜菜红素和亚硝酸盐的发酵液。在发酵液中，亚硝酸盐含量为300～500mg/kg，优选为400～500mg/kg，更优选为450～500mg/kg，例如487mg/kg。
在步骤(4)中，
取发酵液的上清液，冷冻干燥后制得富硝甜菜粉。
优选地，将发酵液浓缩后离心，取上清液进行冷冻干燥。
进一步地，为了避免浓缩过程中甜菜红素受热降解，优选将发酵液在真空或减压条件下进行浓度，以降低浓缩加热温度。
较好地，在浓缩过程中发酵液的加热温度不超过70℃，优选不超过65℃，最好不好超过60℃。
在一种优选的实施方式中，将发酵液于真空旋转蒸发仪中在55℃下浓缩。
将发酵液浓缩至约为原体积的1/10后，离心，于真空冷冻干燥机中冻干，制得富硝甜菜粉。
本发明提供的富硝甜菜粉的制备方法简单可靠，重现性好，成本低，有利于充分开发甜菜的价值，为蔬菜的深加工提供了研发思路。
本发明制得的富硝甜菜粉中，亚硝酸盐的含量不低于1300mg/kg，优选不低于1200mg/kg。
进一步地，所述富硝甜菜粉中，甜菜粉色度值为：L：25～30；a值：7～10；b值：1～2.5；优选地，甜菜粉色度值为：L：27～30；a值：8～10；b值：1～2。
在一种优选的实施方式中，甜菜粉色度值为：L：28.51；a值：8.93；b值：1.76。
优选地，在所述富硝甜菜粉中，水分≤10％、灰分≤3％、还原糖≤3.5％、蛋白质≤1.5％、脂肪≤1％，以质量分数计。
进一步地，所述富硝甜菜粉中，水分为3～5％、灰分为2.4～2.6％、还原糖为2.8～3.2％、蛋白质为1～1.1％、脂肪为0％。
最优选地，所述富硝甜菜粉中，水分为5％、灰分为2.5％、还原糖为3％、蛋白质为1.05％、脂肪为0％。
本发明提供的富硝甜菜粉用特定微生物将天然来源的硝酸盐转化为天然型的亚硝酸盐，安全性高，不含过敏原；并且会对微生物的结构、功能和细胞膜通透性产生不利影响，最终导致细胞死亡，具有抗微生物
活性的作用。另外，富硝甜菜粉中的甜菜红素可以促进NO释放，生成亚硝基肌红蛋白，促进发色，并且可以抑菌和延缓腐败。
进一步地，所述富硝甜菜粉对沙门氏菌和大肠杆菌具有一定作用，用于肉制品时可以防止肉的腐败，可作为肉制品加工配料。用于肉制品时还具有良好的发色作用。
通过所述富硝甜菜粉，在肉制品加工过程中不添加人工合成的亚硝酸盐，而是添加由天然来源硝酸盐转化为的天然型亚硝酸盐，从而替代传统的合成型亚硝酸盐。
所述富硝甜菜粉可以添加到低温肉制品，例如火腿，以及高温肉制品，例如酱卤肉中，不仅可以使肉制品呈现良好、稳定的粉红色，还可以起到一定的抑菌作用，减少肉制品中其他防腐剂的添加量。
由于富硝甜菜粉中甜菜红素对高温的不稳定，当所述富硝甜菜粉用于高温肉制品中时，其添加量可能需要适当增加。虽然甜菜红素的热降解作用使红色素结构发生异构化，然而随着高温肉制品特别是酱卤肉的制备过程，红度值显著提升。这是由于酱制使肉制品颜色变成深红甚至是深黄色，尽管甜菜红素的热变化，但是依然有利于形成酱卤肉的色泽，更容易形成酱卤肉的金黄色。
本发明还提供了上述亚硝酸盐替代物、富硝甜菜粉或上述方法制得的富硝甜菜粉在肉制品发色中的用途；
进一步地，在肉制品抑菌中的用途。
所述富硝甜菜粉所谓天然来源的亚硝酸盐替代物，满足有机肉制品的条件，符合消费者对安全肉制品的安全性要求，具有广阔的市场前景。
实施例
实施例1
甜菜浓度对亚硝酸盐含量的影响
含4％葡萄糖溶液三角瓶，在121℃、0.1MPa下，灭菌20min。冷却后，在超净工作台下无菌操作往各三角瓶中分别加入甜菜匀浆。甜菜匀浆的质量浓度分为:0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％，接菌量为1.5×107cfu/g，盐(NaCl)浓度为2％。样品放入30℃恒温培养箱中静置培养24h，测量发酵液中亚硝酸盐含量。
实验结果如图1所示，可知，甜菜匀浆含量在2％-2.5％时亚硝酸盐的含量达到了16mg/L，远高于其他浓度的样品。
实施例2
发酵时间对亚硝酸盐含量的影响
含4％葡萄糖溶液三角瓶，在121℃、0.1MPa下，灭菌20min。冷却后，在超净工作台下无菌操作，分别加入2％的甜菜，接菌量为1.5×107cfu/g，盐浓度为2％。分别发酵6、12、24、36、48h，样品放入30℃恒温培养箱中静置，测量发酵液中亚硝酸盐的含量。
实验结果如图2所示，可知：在24h-48h时亚硝酸盐的含量都在50mg/L以上，但在24h-30h时亚硝酸盐的含量达到最大。
实施例3
接菌量对亚硝酸盐含量的影响
含4％葡萄糖溶液三角瓶，在121℃、0.1MPa下，灭菌20min。冷却后，在超净工作台下无菌操作，分别加入2％的甜菜，接菌量分别为6×104cfu/g、6×105cfu/g、6×106cfu/g、1.2×107cfu/g、1.02×108cfu/g，将样品放入30℃恒温培养箱中静置24h，测量发酵液中亚硝酸盐的含量。
实验结果如图4所示，可知：接菌量在6×106cfu/g之前，随着菌浓度的升高硝酸还原酶活力升高；之后随着菌浓度的升高，亚硝酸盐含量下降，可能是由于微生物之间存在着竞争性抑制。但接菌量在6×105～1.2×107cfu/g时亚硝酸盐的含量不低于80mg/L。
实施例4
响应面优化
在实施例1～3的基础上，利用响应面优化法对亚硝酸盐含量工艺进行优化。实验的因素水平表如表1所示：
表1
响应面实验确定的拟合方程为：
Y＝37141.25+5364.84A+3184.71B-10038.87C+7488.76AB-2744.47AC-3133.20BC-7758.52A2-14076.43B2-4817.35C2
A表示蔬菜浓度，B表示菌浓度，C表示发酵时间，R为响应值(发酵液中亚硝酸盐含量)。模型P值为0.0009<0.01，失拟项P＝0.363>0.05，模型可选择。
得到最佳工艺：
蔬菜2.2％；发酵时间27h；接菌量7.8×106cfu/g。
发酵、冷冻干燥后制得的富硝甜菜粉，Hunterlab测定仪测得的色度值为：亮度L：28.51，红度值a值：8.93，黄度值b值：1.76；其中，发酵液中亚硝酸盐的含量为487mg/kg，富硝甜菜粉中亚硝酸盐的含量为1200mg/kg。
实施例5
富硝甜菜粉在低温肉制品火腿中的应用
以不加抑菌剂的火腿做空白对照，150mg/kg亚硝酸盐添加量为阳性对照，加入实施例4制得的70mg/kg富硝甜菜粉为试验组。按照常规制备工艺制备火腿样品，测试不同样品的感官评价、亚硝酸盐残留量和微生物生长情况。
其中，添加70mg/kg富硝甜菜粉的样品的色泽与亚硝酸盐添加量150mg/kg的样品的色泽相当。阳性对照组发色较好，呈淡粉色，而试验组颜色为枣红色。试验组获得比阳性对照组更优异的红度，是由于甜菜红素本身的呈色作用和亚硝酸盐的协同发色。
并且，在试验组中，亚硝酸盐残留量为7.16mg/kg；阳性对照组亚硝酸盐残留为24.76mg/kg。
使用富硝甜菜粉替代亚硝酸盐后可以把亚硝酸盐残留量由24.76mg/kg减少到7.16mg/kg的量。替代后，至少可以把亚硝酸盐的添加量减少至原来的46.7％，亚硝酸盐残留量减少82％。
采用GB 4789.2-2016和GB 4789.3-2016检测其微生物菌落总数和大肠菌群数，与GB 2726-2016对比，确定试验组色泽可以达到阳性对照组的效果，并且防腐效果可以比空白对照延长7天。具体如下表2所示：
实施例6
富硝甜菜粉在高温肉制品酱卤肉中的应用
以不加抑菌剂的酱卤肉做空白对照，150mg/kg亚硝酸盐添加量为阳性对照，90mg/kg添加实施例4制得的富硝甜菜粉为试验组。按照常规制备工艺制备酱卤肉样品，测试不同样品的感官评价、亚硝酸盐残留量和微生物生长情况。
其中，添加90mg/kg富硝甜菜粉的试验组的红度值与亚硝酸盐添加量150mg/kg的阳性对照的红度值相当，色泽优于阳性对照组。
阳性对照组中亚硝酸盐残留量为22.76mg/kg，使用90mg/kg富硝甜菜粉替代亚硝酸盐后可以把亚硝酸盐残留量减少至9.46mg/kg，替代后，至少可以把亚硝酸盐的添加量减少至原来的60％，亚硝酸盐残留量减少80％。
采用GB 4789.2-2016和GB 4789.3-2016检测其微生物菌落总数和大肠菌群数，与GB 2726-2016对比，确定试验组色泽可以达到阳性对照组的效果，并且防腐效果可以比空白延长7天。
具体如下表3所示：
对比例
对比例1
盐浓度对亚硝酸盐含量的影响
含4％葡萄糖溶液三角瓶，在121℃、0.1MPa下，灭菌20min。冷却后，在超净工作台下无菌操作，分别加入2％的甜菜，接菌量为1.5×107cfu/g，分别加入0％、2％、4％、6％、8％、10％的Nacl溶液，将样品放入30℃恒温培养箱中静置24h，测发酵液亚硝酸盐含量。实验结果如图3所示。
由图3可知，盐浓度提高后对亚硝酸盐含量起到了负面的作用。
实验例
实验例1
安全性评价
实验动物的选择：选用健康清洁级昆明种雌性小鼠36只，体重18-20g。
实验方法：采用急性经口毒性试验的方法，空白鼠作对照，不同浓度梯度溶液的不同组小鼠做实验处理组，在24h内多次给予实验动物受试物，观察在短期内出现的毒性效应。
受试物的配制：将实施例4制得的富硝甜菜粉溶于水分别配制成1.00mg/ml、2.15mg/ml、4.64mg/ml、10mg/ml、21.5mg/ml的溶液浓度。药物给予方式为经口灌胃，按2％容积灌胃。
结果发现，不同剂量组的受试动物均没有出现死亡情况，说明富硝甜菜粉在木糖葡萄球菌发酵下并没有生成有毒有害物质；这也在一定程度下说明了甜菜红和木糖葡萄球菌可以在食品中应用，不会对人体有害。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种亚硝酸盐替代物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)蔬菜匀浆的制备；
(2)液体培养基的制备；
(3)将蔬菜匀浆和选定的微生物加入到液体培养基中发酵转化，得到发酵液；
(4)冷冻干燥发酵液的上清液，得到亚硝酸盐替代物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蔬菜选用菠菜、苦苣、生菜、芥蓝、甜菜、芹菜、小白菜、韭菜或香芹制备亚硝酸盐替代物，优选为甜菜。
3.一种富硝甜菜粉的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备甜菜匀浆；
(2)制备液体培养基；
(3)将甜菜匀浆和选定的微生物加入到液体培养基中发酵转化，得到发酵液；
(4)冷冻干燥发酵液的上清液，得到富硝甜菜粉。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，将新鲜甜菜研磨成浆状；
在步骤(2)中，所述液体培养基是指质量浓度为2％～8％的葡萄糖灭菌溶液，优选为4％的葡萄糖灭菌溶液。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中，
所述甜菜匀浆的加入到液体培养基中的质量浓度为2～3％，优选为2～2.5％；
发酵时间为24～48h，优选为24～36h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中，
所述微生物为凝固酶阴性菌，能够产生硝酸还原酶；
微生物选自考克氏变异菌，肉糖葡萄球菌或木糖葡萄球菌，优选为木糖葡萄球菌；
微生物接种量为6×104～1.5×108cfu/g；优选为6×105～1.2×108cfu/g；
恒温发酵。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中，任选地，发酵时还可以加入氯化钠；所述氯化钠的质量浓度为0～6％，优选为0～4％；
在发酵液中，亚硝酸盐含量为300～500mg/kg，优选为400～500mg/kg。
8.一种权利要求3～7之一所述方法制得的富硝甜菜粉，亚硝酸盐的含量不低于1300mg/kg，优选不低于1200mg/kg。
9.权利要求8所述的富硝甜菜粉，其特征在于，
所述富硝甜菜粉色度值中，
L：25～30；a值：7～10；b值：1～2.5；
所述富硝甜菜粉中，水分为3～5％、灰分为2.4～2.6％、还原糖为2.8～3.2％、蛋白质为1～1.1％、脂肪为0％。
10.权利要求1或2所述亚硝酸盐替代物、权利要求3～7之一所述方法制得的富硝甜菜粉、以及权利要求8或9所述富硝甜菜粉在肉制品发色中的用途；
进一步地，在肉制品抑菌中的用途。
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