CN113684193B - 一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法 - Google Patents

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02012—Nicotinamide phosphoribosyltransferase (2.4.2.12), i.e. visfatin
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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

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Abstract

本发明公开了一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法，包括以下步骤：(1)将NAMPT生产菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心，收集发酵液中的菌体；(2)向菌体中加入纯水，用氨水调节pH至7.2‑7.4，过均质机后离心，分离得到上清液；(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤处理，得到滤液；(4)向滤液中加入非离子型去垢剂去除包涵体，得到粗酶液；(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT。采用本发明的方法可以从含有尼克酰胺磷酸核糖转移酶的发酵液中将NAMPT有效的提取纯化出来，NAMPT的收率和纯度都有了显著的提高。

Description

一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)在各种细胞生理过程中起着至关重要的作用，对基因表达、DNA修复、钙离子动员、应激、凋亡、代谢、增殖、老化、内分泌等方面表现出深刻的影响，NAD的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡，因而参与NAD生物合成和代谢的酶也成为各种疾病的药物发现中极具吸引力的靶标。尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)是NAD补救合成通路的限速酶，通过合成NAD参与细胞物质和能量代谢、蛋白质修饰、DNA修复等重要过程。
因此，NAMPT具有广泛的应用价值，需求量不断增加。目前已有通过基因重组技术表达重组NAMPT酶的报道。但是，由于表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白一直是个难题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法。采用本发明的方法可以从含有尼克酰胺磷酸核糖转移酶的发酵液中将NAMPT有效的提取纯化出来，NAMPT的收率和纯度都有了显著的提高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)将NAMPT生产菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心，收集发酵液中的菌体；
(2)向菌体中加入纯水，用氨水调节pH至7.2-7.4，过均质机后离心，分离得到上清液；
(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤处理，得到滤液；
(4)向滤液中加入非离子型去垢剂和氯化钠去除包涵体，得到粗酶液；
(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT。
优选的，步骤(1)中，离心速度为4000r/min，离心时间为15min。
优选的，步骤(2)中，过均质机后10000r/min离心20min。
优选的，步骤(4)中，非离子型去垢剂为Triton X-100。
优选的，步骤(4)中，向滤液中加入非离子型去垢剂Triton X-100和氯化钠，使Triton X-100的终质量浓度为2％，氯化钠的终浓度为500mM。
优选的，步骤(5)中，镍柱亲和层析所采用的结合缓冲液为50mM的PBS；洗脱剂为80mM的咪唑磷酸盐缓冲液，流速小于或等于5L/min。
进一步的，步骤(1)中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：
将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a(+)，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株。
本发明在构建NAMPT生产菌株时，将表达NAMPT的重组表达载体和表达PARP1的重组表达载体同时导入到大肠杆菌中，通过少量PARP1的表达，可以显著提高NAMPT的表达量。
进一步的，步骤(1)中，发酵培养的条件为：初始发酵温度为32-34℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.18-0.20；
将发酵体系的温度降至21℃-23℃，加入IPTG，使IPTG在发酵体系中的终浓度为0.5mmol/L；同时流加补料，所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧控制在20-40％，诱导培养20-30h，得到发酵液；
所述发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。
本发明的有益效果：
本发明针对含有表达NAMPT的重组表达载体和表达PARP1的重组表达载体的NAMPT生产菌株，设计了从发酵液中提取纯化NAMPT的方法。本发明首先通过一定的离心速度收集菌体，菌体量可达137g/L以上，再通过匀质机进行破菌处理，将重组NAMPT酶释放出来；通过加入非离子型去垢剂能够将包涵体去除，同时保证蛋白质的活性不减；发酵液中蛋白质种类非常多，NAMPT并不容易分离，本发明利用质粒pLLP-ompA来表达NAMPT酶，所表达的NAMPT酶加上原来NAMPT带的总共有8个His尾，通过His尾和镍离子亲和的原理，可以有效的将NAMPT酶和PARP1蛋白分离。采用本发明的方法可以从含有尼克酰胺磷酸核糖转移酶的发酵液中将NAMPT有效的提取纯化出来，NAMPT的收率和纯度都有了显著的提高。
附图说明
图1：本发明实施例2纯化得到的NAMPT的SDS-PAGE图；图中M为Maker，泳道1为纯化得到的NAMPT。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明：
通风比：一分钟内通过单位体积培养液的无菌空气体积；例如，装有18m3培养液的发酵罐，若每分钟通入无菌空气18L，则称通风比为1:1。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买得到。其中：
NAMPT酶生产菌株的构建过程如下：
将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a(+)，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株。
培养基中所使用的酵母浸膏为酵母浸膏LM800，蛋白胨为蛋白胨FP330，均为市售产品。发酵生产中所使用的消泡剂为聚醚g·p·e消泡剂(泡敌)。
实施例1：含有NAMPT酶的发酵液的生产
(1)菌种活化：将低温保存的NAMPT酶生产菌株于含有100μg/ml KAN和100μg/mlAMP的LB平板上划线，33℃培养24h；挑取生产菌株单菌落再次划线转接于含有100μg/mlKAN和100μg/ml AMP的LB平板上，33℃培养24h，备用。
LB平板的培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。
(2)一级种子液制备：用接种环刮取2环步骤(1)活化后的生产菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，33℃，200r/min，摇瓶培养12h得到一级种子液。
LB液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。
(3)二级种子液制备：将步骤(2)制得的一级种子液按照二级种子培养基2.0％(体积百分比)的比例接种到种子罐中发酵培养；转速150rpm，温度33℃，罐压0.05～0.06MPa，培养12h，作为二级种子液。
二级种子培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。
(4)发酵培养：将步骤(3)所得二级种子液按照4％(体积比)接种到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养。
发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。
发酵罐的罐压：0.05Mpa，通风比1:1。
初始发酵温度为33℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧(DO)为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.18-0.20。将发酵体系的温度降至22℃，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.5mmol/L；流加补料(所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成，121℃灭菌20min)，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧(DO)控制在20-40％，诱导培养24h，即生产得到含有NAMPT酶的发酵液。
溶氧(DO)采用溶氧电极测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。OD600和pH值采用取样测定，每2h取样一次。
实施例2：NAMPT酶的提取纯化
(1)将实施例1生产得到发酵液4000r/min离心15min，收集发酵液中的菌体；
(2)向菌体中加入纯水(每1g菌体中加入999g水)，用氨水调节pH至7.2-7.4，过均质机后(均质压力15,000PSI，均质流量400L/Hr)离心，离心速度10000r/min，离心20min，分离得到上清液；
(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤(陶瓷膜的孔径是100nm，过滤压力0.5MPa)处理，得到滤液；
(4)向滤液中加入非离子型去垢剂Triton X-100和氯化钠，使Triton X-100的终质量浓度为2％，氯化钠的终浓度为500mM，去除包涵体，得到粗酶液；
(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，结合缓冲液是50mM的PBS，洗脱剂是80mM的咪唑磷酸盐缓冲液，洗脱剂的用量为5倍柱体积，流速为2L/min，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT。
对纯化得到的NAMPT进行SDS-PAGE测定，结果如图1所示。结果表明：纯化后的NAMPT在56.3kDa处有单一的目的条带。
对本实施例纯化得到的NAMPT的收率和纯度进行测定。其中，收率是先直接测定粗酶液中NAMPT的浓度，计算出应得NAMPT的量；再进行提纯，得到精品NAMPT后，按如下公式计算收率：
收率＝(精品NAMPT的量/应得NAMPT的量)*100％。
经测定，本实施例中NAMPT的收率为85.2％。
纯度就是产品中NAMPT占产品的百分比。经测定，本实施例中提取纯化得到NAMPT的纯度为99％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司,汕头市佳禾生物科技有限公司
<120> 一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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tgaaatacct gctgaaactg aaattcaact tcaaaacctc tctgtggtaa gcatg 3055

Claims (1)

1.一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将NAMPT生产菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心，收集发酵液中的菌体；
(2)向菌体中加入纯水，每1g菌体中加入999g水，用氨水调节pH至7.2-7.4，过均质机后离心，均质压力15,000PSI，均质流量400L/Hr，离心速度10000r/min，离心20min，分离得到上清液；
(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤处理，陶瓷膜的孔径是100nm，过滤压力0.5MPa，得到滤液；
(4)向滤液中加入非离子型去垢剂Triton X-100和氯化钠，使Triton X-100的终质量浓度为2％，氯化钠的终浓度为500mM，去除包涵体，得到粗酶液；
(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，结合缓冲液是50mM的PBS，洗脱剂是80mM的咪唑磷酸盐缓冲液，洗脱剂的用量为5倍柱体积，流速为2L/min，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT；
步骤(1)中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：
将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a(+)，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株；
步骤(1)中，发酵培养的条件为：初始发酵温度为32-34℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.18-0.20；
将发酵体系的温度降至21℃-23℃，加入IPTG，使IPTG在发酵体系中的终浓度为0.5mmol/L；同时流加补料，所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧控制在20-40％，诱导培养20-30h，得到发酵液；
所述发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。
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重组人尼克酰胺磷酸核糖转移酶及其活性位点突变体蛋白的制备及体外酶活性检测;王峰等;《浙江大学学报(医学版)》;20110325(第02期);1.2方法 *

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