CN104830732A - 一株八丈岛链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株八丈岛链霉菌及其应用。本发明的八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497能够明显抑制栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)孢子的发生、导致该菌菌丝体脱水、畸变，具有高效的抑制作用，同时确定了不同含量CNA-23菌株的滤液以及不同类型发酵培养基对CNA-23菌株抗栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)效果的影响。八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一株八丈岛链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一株八丈岛链霉菌及其应用。
背景技术
我国是一个农业大国，粮食、果蔬产量和质量关乎民生和社会稳定。全世界因为植物病害所造成的主要农作物的经济损失达数千亿美元，而病害中的70％-80％都是由病原真菌导致的，如导致板栗疫病的病原真菌为栗疫病菌。
栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)间座壳目(Diaporthales)隐丛壳科(Cryphonectriaceae),可寄生于欧洲板栗、美洲板栗、板栗、日本板栗、锥栗和其它栎类。板栗苗木和结果树都可以受到栗疫病菌的侵染，发病后病斑迅速包围枝、干，导致栗实产量和质量都明显降低，严重时造成整个枝条或全株枯死。栗疫病菌已成为危害板栗最严重的病菌。1904年，在美国纽约首次发现栗疫病，随后近半个世纪的时间内，全境美洲栗树几乎全部被其摧毁。1913年，栗疫病首次在中国被发现，之后在中国各地均发现该病，部分地区发病严重。
目前，栗疫病菌的主要防治方法为农业防治、生物防治、化学防治和综合防治。在意大利和法国发现了含有dsRNA的弱毒力菌株，能有效控制栗疫病菌带来的危害；部分生物制剂也能起到抑制作用；另外多菌灵、杀菌剂等化学药品也能起到一定效果。
放线菌(Actinomycete)是一类含有大量G/C的革兰氏阳性菌，其种类繁多，在自然界中分布广泛，是土壤中的优势菌群。链霉菌属(Streptomyces)是放线菌目的一个属。放线菌含有的微生物资源可创造巨大价值，它是产生生物活性物质最多的微生物种类之一，特别是抗生素，当前在医疗和农业方面广泛应用的抗生素，70％来自放线菌，而80％以上的放线菌抗生素都是由链霉菌(Streptomyces)产生的。但目前还没有利用链霉菌产生抗生素抑制板栗疫病的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何防治栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)及其引起的板栗疫病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株八丈岛链霉菌。
本发明所提供的八丈岛链霉菌是八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9497。该菌种已于2014年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497在高氏一号培养基上菌丝生长缓慢，包括基生菌丝和气生菌丝，菌落表面粗糙、不规则，初期乳白色，菌丝浓密，后期偏浅黄色，不产色素。扫描电镜观察显示，菌丝表面光滑，微柔曲。
本发明所提供的所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCCNo.9497在生产分生孢子和/或菌丝体中的应用也属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了栗疫病菌抑制剂。
本发明所提供的栗疫病菌抑制剂，其活性成分是所述八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497或/和所述八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物。
上述栗疫病菌抑制剂中，所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497可为分生孢子和/或菌丝体。
上述栗疫病菌抑制剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述栗疫病菌抑制剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述栗疫病菌抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述栗疫病菌抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
为解决上述技术问题，本发明还提供了制备所述栗疫病菌抑制剂的方法。
本发明所提供的制备所述栗疫病菌抑制剂的方法，包括在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(实施例中的7号培养基)中培养所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497，收集发酵液，得到栗疫病菌抑制剂。
本发明还提供了下述1)-4)中任一种应用：
1)所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497或/和所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物在抑制栗疫病菌中的应用；
2)所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497或/和所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物在制备栗疫病菌抑制剂中的应用；
3)所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497或/和所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物在制备栗疫病菌引起的植物病害抑制剂中的应用；
4)所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497或/和所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物在抑制栗疫病菌引起的植物病害中的应用。
所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物可从所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的发酵液中获得。所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCCNo.9497的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497，除去液体培养物(发酵液)中的所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497即得到所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的代谢物。
上述应用中，所述植物病害为板栗疫病。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了培养所述八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的方法。
本发明所提供的培养所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的方法，包括将所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497在用于培养八丈岛链霉菌的培养基中培养的步骤。
上述培养所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的方法，可包括在液体培养基中培养所述八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的步骤；所述液体培养基具体可为液体发酵培养基(4号培养基)、1号培养基、2号培养基、3号培养基、5号培养基、6号培养基和7号培养基；所述培养温度可为26-30℃，具体可为28℃；所述培养时间可为8-10d，具体可为8d。
实验证明，本发明的八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCCNo.9497能够明显抑制栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)孢子的发生,导致栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝体脱水、畸变，具有高效的抑制作用，同时确定了不同含量CNA-23菌株的滤液以及不同类型发酵培养基对CNA-23菌株抗栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)效果的影响。八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
保藏说明
菌种名称：八丈岛链霉菌
拉丁名：Streptomyces hachijoensis
菌株编号：CNA-23
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年7月21日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9497
附图说明
图1为八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的菌丝形态。
图2为基于16S rDNA序列的八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497菌株与其它链霉菌构成的系统发育树。
图3为受八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497菌株抑制的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和正常生长的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌丝形态的电镜照片。其中，A为对照组，B为实验组。
图4为受八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497菌株抑制的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)和正常生长的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的孢子的电镜照片。其中，A为对照组，B为实验组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)为美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)的产品，产品目录号为ATCC 64671。
下述实施例中所用的培养基如下：
PDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
高氏一号培养基：20g可溶性淀粉，1g KNO3，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，0.01g FeSO4·7H2O，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
液体发酵培养基(4号培养基):340g蔗糖，10g葡萄糖，3g酵母膏，5g细菌蛋白胨，3g麦芽膏，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
1号培养基：15g可溶性淀粉，4g酵母粉，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
2号培养基：20g可溶性淀粉，0.5g NaCl，1g KNO3，0.01g FeSO4，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H20，2g酵母膏，4g细菌蛋白胨，1g葡萄糖，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
3号培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
5号培养基：30g可溶性淀粉，2g麦芽膏，2g大豆蛋白胨，5mg CoCl2·6H2O(预先配置成20mg/mL储液)，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
6号培养基：2g可溶性淀粉，15g黄豆粉，5g酵母粉，4g CaCO3，2g蛋白胨，4g NaCl，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
7号培养基(胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基)：17g胰蛋白胨，3g大豆蛋白胨，5g NaCl，2.5g K2HPO4，2.5g葡萄糖，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌20min。
实施例1、八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的分离及鉴定
1、八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的分离
采集北京密云板栗站板栗树根际的土壤样品，采用梯度稀释平板法，获取各菌株单菌落，试管保存并进行分子生物学鉴定，筛选得到八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497。
2、八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的鉴定
(1)形态学鉴定
八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497在高氏一号培养基上菌丝生长缓慢，包括基生菌丝和气生菌丝，菌落表面粗糙、不规则，初期乳白色，菌丝浓密，后期偏浅黄色，不产色素。扫描电镜观察显示，菌丝表面光滑，微柔曲(图1)。
(2)分子鉴定
使用高氏一号培养基活化八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497，收集菌丝于无菌离心管中，采用细菌DNA提取试剂盒的方法操作，提取八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497的基因组DNA，作为PCR反应的模板。以大肠杆菌(Escherich coli)16S rDNA通用引物为扩增引物，其中正向引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’，反向引物P6：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’。
50μL PCR反应体系包括模板DNA 1μL，正向引物P1 2μL，反向引物P6 2μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，ddH2O 20μL。
PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环扩增，最后72℃延伸10min，4℃保存。
将八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497菌株的16S rDNA序列的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到约1418bp的DNA片段，测序后，利用Blast工具与数据库中已知的相关序列进行在线比对，利用MEGA5.0软件构建系统发育树(图2)，八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497与八丈岛链霉菌属(Streptomyces hachijoensis)的16S rDNA序列相似性为100％。根据八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCCNo.9497的形态特征和16S rDNA序列，将其鉴定为八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijoensis)。八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列长度为1418bp。
八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23 CGMCC No.9497已于2014年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.9497。
实施例2、不同含量八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCCNo.9497菌株的滤液对栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)抑制作用的影响
将八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23 CGMCC No.9497(下文简称CNA-23菌株)接种于150mL液体发酵培养基中，在28℃，转速为180rpm条件下振荡培养8天，获得CNA-23菌株的发酵液。然后将CNA-23菌株的发酵液在12000rpm条件下离心5min，收集上清液。将上清液通过0.2μm的细菌过滤器过滤，收集滤液，获得CNA-23菌株的滤液(不含菌)。
采用PDA平板活化栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)，用直径5mm的打孔器获得活化后的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼。分别取0μL、200μL、400μL、800μL和1600μL的CNA-23菌株的滤液与温的20mL PDA培养基混合制备平板，分别获得1号平板(加入0μL的CNA-23菌株的滤液，对照组)，2号平板(加入200μL的CNA-23菌株的滤液，实验组)，3号平板(加入400μL的CNA-23菌株的滤液，实验组)，4号平板(加入800μL的CNA-23菌株的滤液，实验组)和5号平板(加入1600μL的CNA-23菌株的滤液，实验组)，带冷却凝固后，分别在1-5号平板的中央接种栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼一块，1-5号平板每个均设三个重复，静置，待其完全吸附。将接种了栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼的平板置于28℃培养24h，通过测量栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝的生长直径，计算抑菌率，抑菌率(％)＝(1-实验组菌丝生长直径/对照组菌丝生长直径)×100％。
结果如表1所示，结果表明加入的CNA-23菌株的滤液量越大，对于栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的抑制率越高，加入了1600μL的CNA-23菌株的滤液的平板对栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的抑菌率最高，为74％。
表1、不同CNA-23菌株的滤液量对栗疫病菌的抑制效果
滤液量/μL 抑菌率(％)
0 0
200 35
400 49
800 71
1600 74
实施例3、不同类型培养基对八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497抑菌活性的影响
分别向150mL的1-7号培养基中接种两块CNA-23菌株的菌饼，在28℃，转速为180rpm条件下振荡培养8天，分别获得编号为1-7号的CNA-23菌株发酵液；将编号为1-7号的CNA-23菌株发酵液在12000rpm条件下离心5min，收集上清液，分别获得编号为1-7号的CNA-23菌株上清液。分别将编号为1-7号的CNA-23菌株上清液通过0.2μm的细菌过滤器过滤，收集滤液，分别获得编号为1-7号的CNA-23菌株滤液(不含菌)。
采用PDA平板活化栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)，用直径5mm的打孔器获得活化后的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼，将一块栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼接种在新的PDA培养基中间，同时在距栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼边缘5mm处的圆周上，用直径5mm的打孔器均匀打三个孔，在每个孔中加入20μL上述各个编号的CNA-23菌株滤液(实验组)，以加入等体积的水作对照，将所有的处理平板在28℃培养24h。通过测量栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝的生长直径，计算抑菌率，抑菌率(％)＝(1-实验组菌丝生长直径/对照组菌丝生长直径)×100％。
结果如表2所示，结果表明采用7号培养基培养CNA-23菌株获得的滤液具有最高的抑菌活性，对于栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的抑制率为77.8％，4号培养基次之，抑制率为72.2％。
表2、不同类型培养基的CNA-23的菌株滤液对栗疫病菌的抑制效果
培养基编号 抑菌率(％)
1 11.1
2 11.1
3 66.7
4 72.2
5 66.7
6 44.4
7 77.8
实施例4、受八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijoensis)CNA-23CGMCC No.9497作用后的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝结构及孢子的生长状况
采用PDA平板在28℃活化培养栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)，同时采用高氏一号培养基活化CNA-23菌株。
用直径5mm的打孔器获得活化后的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌饼，转接到新的PDA平板中间，28℃培养至其直径为2cm左右。用直径5mm的打孔器取3个活化后的CNA-23菌饼，接在距离栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)边缘1cm处的圆周上，均匀接种3个活化后的CNA-23菌饼，将该平板置于28℃培养24h，作为实验组，将只接种栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)而不接种CNA-23菌饼的平板作为对照组。
采集实验组的被抑制边缘的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的菌丝及对照组的相同位置正常生长的栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝，观察栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝及孢子形态。结果表明，CNA-23能够明显抑制栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)孢子的发生、导致该菌菌丝体脱水、畸变(图3和图4)。

Claims (7)

1.八丈岛链霉菌，其特征在于：所述八丈岛链霉菌的菌株号为CNA-23，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9497。
2.权利要求1所述的八丈岛链霉菌在生产分生孢子和/或菌丝体中的应用。
3.栗疫病菌抑制剂，其活性成分是权利要求1所述的八丈岛链霉菌或/和所述八丈岛链霉菌的代谢物。
4.制备权利要求3所述栗疫病菌抑制剂的方法，包括在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中培养权利要求1所述的八丈岛链霉菌，收集发酵液，得到栗疫病菌抑制剂。
5.下述1)-4)中任一种应用：
1)权利要求1所述八丈岛链霉菌或/和所述八丈岛链霉菌的代谢物在抑制栗疫病菌中的应用；
2)权利要求1所述八丈岛链霉菌或/和所述八丈岛链霉菌的代谢物在制备栗疫病菌抑制剂中的应用；
3)权利要求1所述八丈岛链霉菌或/和所述八丈岛链霉菌的代谢物在制备栗疫病菌引起的植物病害抑制剂中的应用；
4)权利要求1所述八丈岛链霉菌或/和所述八丈岛链霉菌的代谢物在抑制栗疫病菌引起的植物病害中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物病害为板栗疫病。
7.培养权利要求1所述八丈岛链霉菌的方法，包括将所述八丈岛链霉菌在用于培养八丈岛链霉菌的培养基中培养的步骤。
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