CN103184161A

CN103184161A - 防治辣椒疫病的生防菌株htc及其应用

Info

Publication number: CN103184161A
Application number: CN2013100783967A
Authority: CN
Inventors: 高克祥; 刘晓光; 刘永亮; 何邦令; 李超; 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: CN103184161B

Abstract

本发明公开了一种防治辣椒疫病的生防菌株HTC及其应用。本发明提供了金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC，其保藏号为CGMCC No.6173。本发明还提供了一种制备防治辣椒疫病HTC生防制剂的方法，包括如下步骤：发酵上述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC，得到发酵产物，即得到生防制剂。本发明的实验证明，温室中使用菌株HTC生防制剂对辣椒疫病有一定程度的防治效果，达72.19%，幼苗期株高增加12.27%，生物量增加32.28%；收获期生物量增加31.11%，辣椒果实产量增加21.81%。

Description

防治辣椒疫病的生防菌株HTC及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种防治辣椒疫病的生防菌株HTC及其应用。

背景技术

辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一种卵菌病害。疫霉菌隶属卵菌门、霜霉目、腐霉科、疫霉属。疫霉菌在土壤中存活不是以一种形态，而是以不同形态即菌丝体、孢子囊、厚垣孢子和卵孢子等多种互变方式存活。该病可以通过雨水与灌溉水，农用器具进行传播，是一种危害性很强的土传病害。随着我国辣椒大量种植，辣椒疫病在露地、保护地与大棚也大面积发生，因为该病害发病周期短，流行速度快，常导致辣椒植株成片死亡，给辣椒产业带来严重的经济损失。一般病株率为20－30％，严重时达80％以上，此病害是影响我国辣椒产业经济发展的主要因素之一。

辣椒疫霉是一种异宗配合的微生物，它有2种主要的交配型：A1型和A2型。Groves等认为，由于近年来杀菌剂的广泛使用，使辣椒疫霉产生了抗药性，从而诱导其交配型的变化，给该病害的防治带来很多困难。苯基酰胺类杀菌剂甲霜灵（metalaxyl）和精甲霜灵（mefenoxam）等专用杀菌剂被广泛用于防治该病害，是目前国内外广泛使用的卵菌病害防治药剂中活性高、使用量大的一类杀菌剂，并取得了良好的防治效果。但由于该类药剂属于特异性位点抑制剂，对病原菌作用位点单一，长期使用极易产生抗药性，导致防治效果下降。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是防治辣椒疫病的又一重要的内吸性杀菌剂，由于其作用机制新颖，与苯基酰胺类杀菌剂无交互抗性，目前被广泛使用。但已有研究表明，某些病原菌靶标对该类药剂产生抗药性自发突变频率较高，在药剂的高选择压力下病原菌易形成抗药性群体。

综上所述，开发新的、有效和安全的微生物杀菌剂控制辣椒疫病的发生是提高辣椒生产总量的需求，同时更是辣椒产业经济、辣椒食用安全及农业可持续发展的需要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC。

本发明提供的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC，其保藏号为CGMCC No.6173。

本发明的另一个目的是提供一种制备防治辣椒疫病HTC生防制剂的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC，得到发酵产物，即得到生防制剂。

上述方法中，在所述得到发酵产物后，还包括如下步骤：去除所述发酵产物中的菌丝体，得到生防制剂。

上述方法中，所述发酵的条件如下：25-28℃，160-180rpm振荡培养10-12d；所述发酵的条件具体如下：25℃、160rpm振荡培养12d。

由上述方法制备的生防制剂也是本发明保护的范围。

上述生防制剂中干物质的浓度为400-600μg/ml，在本发明的实施例中使用时稀释到40μg/ml。

本发明的第三个目的是提供一种防治辣椒疫病或促进辣椒生长或者促进辣椒增产或抗菌的产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC或上述的HTC生防制剂。

上述产品中，所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；

所述抗菌为抗如下8种病原菌中的至少一种：辣椒疫霉Phytophthora capsici、杨树腐烂病菌Valsa sordida、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、核桃炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、烟草赤星病菌Alternaria alternata、杨树水泡溃疡病菌Botryosphaeria ribis、玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani、板栗疫病菌Cryphonectria parasitica；

所述促进辣椒生长体现在提高辣椒株高或增加辣椒生物量或增加辣椒产量。

上述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC或上述的HTC生防制剂在防治辣椒疫病或促进辣椒生长或者促进辣椒增产或抗菌中的应用。

上述应用中，所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；

防治辣椒疫病的菌株HTC，为毛壳属金色毛壳菌（Chaetomium aureum），分类命名为金色毛壳（Chaetomium aureum）；于2012年5月31日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC No.6173。

本发明的实验证明，本发明发现一株菌株HTC及其生防制剂，生防制剂可以在温室中使用并对辣椒疫病有一定程度的防治效果，达72.19%，而且可以使幼苗期株高增加12.27%，生物量增加32.34%；使收获期生物量增加31.11%，辣椒果实产量增加 21.81%。由于本发明的菌株HTC是专门针对辣椒疫病筛选开发的生防菌株，因而在防治辣椒疫病方面与目前其它广谱生物生防制剂相比，防治效果显著。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其它防治辣椒疫病化学农药的用量，这不仅可以为农民节省开支，也有利于辣椒产品的出口。同时该生防制剂还有增产功能，可为农民增加经济收入。

附图说明

图1为金色毛壳菌株HTC的菌落生长特征

图2为金色毛壳菌株HTC的形态特征

图3为在接种辣椒疫霉7d后HTC生防制剂对辣椒疫病的防治效果

图4为HTC生防制剂对移栽后1个月辣椒植株的促生效果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、生防真菌HTC的分离与鉴定

1、菌种分离与鉴定

（1）菌种的分离

将从山东省泰安市徂徕山林场核桃生产基地采集的核桃叶片用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗2次，无菌滤纸吸干表面水分。无菌条件下，将核桃叶片剪成4×8mm大小组织块，70%乙醇浸泡30sec，无菌水冲洗3次，转入1‰升汞消毒液（升汞1g，浓盐酸2.5ml，水1000ml）浸泡3min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。将消毒好的核桃叶片组织块，按5点均匀放置在事先准备好的PDA培养基平板上，置25℃恒温培养，3d后逐日观察，待从叶片组织块边缘长出菌丝时，及时挑取菌丝块转移到新的PDA平板上继续培养。待产生孢子时，进行单孢分离纯化，将纯化好的菌株进行编号，斜面保存备用。

PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g、自来水1000ml。

（2）拮抗菌的筛选

将上述（1）单孢分离纯化的菌株分别与辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、核桃炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)、杨树水泡溃疡病菌(Botryosphaeria ribis)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、玉米弯孢病菌(Curvularia lunata)和板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)（螺旋毛壳ND35抗生素的产生及其在病害生物防治中的作用，植物保护学报，2007，34（1）：51-56；辣椒疫霉拮抗细菌的筛选，山东农业科学，2012，44(9):90–92；公众可从山东农业大学获得）进行对峙试验，采用两点对峙同时接种，以不接HTC菌为对照，计算菌丝生长抑制率。

抑菌率＝（对照平板菌落直径－对峙平板菌落直径）/对照平板菌落直径×100%。

试验结果见表1。

表1为菌株HTC对不同病原菌的抑菌率

选择对辣椒疫霉具有较强拮抗活性的真菌菌株，编号为HTC，在4℃斜面保存。

2、HTC的形态及生物学特性测定

（1）菌落和菌株形态特征

菌株HTC在PDA培养基形态特征如图1和图2所示，图2中的A-D为扫描电镜照片：A、具附属丝的子囊壳；B、凹陷的孔口；C、半月形的子囊孢子；D、具瘤状凸起的附属丝；E-G为光学显微镜照片：E、半月形或梭形的子囊孢子；F、子囊；G、子囊成熟后，子囊壁消解。标尺：A=50μm,B=10μm,C=2μm,D=2μm,E=20μm,F=20μm,G=20μm；从上述的图中可以看出，在PDA培养基上产生红色渗出物，从而使菌落和培养基变红，培养基上通常产生稀疏气生菌丝，菌落正面呈乳白色，背面暗褐色；子囊果表生于气生菌丝上或上覆一薄层气生菌丝；子囊果在反射光下为橄绿色，孢子角形成后呈灰黑色，卵形或近卵形，直径70—104μm，高约94—137μm，顶部渐狭形成30—75μm的孔口；子囊果壁褐色或暗褐色，由角胞组织构成；子囊果顶生附属丝向内弯曲呈弓形，顶端钝圆，末端呈钩状或拳卷至1—2圈螺旋状卷曲，无分枝，浅褐色，具清晰而较密的隔膜，表面具疣突；侧生附属丝直立，在于顶生附属丝交界处部分顶部向下弯曲，长短不一，最长达1100μm；子囊棍棒状，具柄，28—46×9—16μm，内生8个子囊孢子，子囊易消解；子囊孢子舟形，半月形或两侧不对称的纺锤形，幼时无色透明或浅色，成熟时为褐色，8—11×5—7μm，两端各具一个顶生芽孔。

（2）生物学特性测定

菌株HTC在PDA、麦芽糖、查氏、麦芽浸膏和基本培养基上均能生长，其中在PDA、查氏和基本培养基上菌丝生长较快，产孢量较多。在PDA培养基上，菌丝生长和孢子产生的温度范围是15-35℃，最适温度为25℃，不需要光照。菌丝生长和孢子产生的pH值范围是3-8，最适pH值为4-6。在基本培养基上，葡萄糖、淀粉、木糖、乳糖比麦芽糖、蔗糖、果糖等更有利于菌丝生长和产孢，其中葡萄糖为最佳碳源；丙氨酸、天门冬素、亮氨酸有利于菌丝生长与产孢，其中丙氨酸为最佳氮源；VB1＋VH与VB6比其它维生素如VB2、烟酸及其组合VB2+VB6、VB6+烟酸有利于菌丝生长和产孢，其中VB1＋VH为最佳维生素组合。子囊孢子萌发对环境条件要求不严格，在PDA膜上、在2%麦芽糖、2%葡萄糖、2%苹果汁中较在2%琼脂膜上更有利于萌发、其中以PDA膜为最佳，在蒸馏水中也有少量萌发。在15-35℃范围内子囊孢子均可萌发，其中30℃时萌发率最高。25℃时孢子萌发率与相对湿度成正比，在pH值3-7范围内均可萌发，其中pH4-6为最适。氧气充足、无光照有利于孢子萌发。

3、菌株HTC的分子生物学鉴定

将菌株HTC接于PDA培养基，25℃培养7d，用无菌手术刀，刮下0.5g菌丝，研磨，用CTAB法提取真菌的基因组DNA。利用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增。反应采用25μl体系：10×PCR buffer2.5μl，25mM MgCl21.5μl，2.5mM dNTP0.2μl，ITS10.5μl，ITS40.5μl，5U/μl Taq酶0.2μl，ddH₂O18.6μl，基因组DNA模板1μl。PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。PCR产物用1%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测，找到大小为500-600bp目的条带18S rDNA，切胶回收。

将目的片段18S rDNA连接至载体Peasy-T3，送华大基因测序。

测序结果为HTC的18S rDNA中的ITS区域核苷酸序列为序列表中的序列1。

同Genbank数据库中已知的ITS序列进行BLAST同源性序列比对，并用MAGE4.0软件建立进化树。最终鉴定结果菌株HTC为毛壳属的金色毛壳菌（Chaetomium aureum）。

实施例2、生防真菌HTC在防治辣椒疫病中的应用

一、HTC生防制剂的制备

（1）种子液的制备：

将在4℃下保存在试管斜面上的实施例1分离保藏的金色毛壳菌（Chaetomium aureum）HTC CGMCC No.6173的菌种，转移到新鲜的PDA培养基平板上活化，于25℃培养5d长出新鲜菌丝后，再转移到大批新鲜的PDA平板上，于25℃培养10d。待产生大量子囊孢子后，无菌条件下刮取下来，用无菌水制备成浓度为1×10⁸cfu/ml的孢子悬浮液即为HTC种子液。

（2）生防制剂的制备：

将HTC种子液以1:100体积比加入PDB培养基中，25℃，160rpm振荡培养12d；用无菌尼龙网过滤掉发酵产物中的菌丝体，留下的发酵液即为HTC生防制剂。

将发酵液与乙酸乙脂按1：1等体积混合萃取两次，收集萃取液，用旋转蒸发仪蒸干，得到干物质，干物质在发酵液中的浓度为400-600μg/ml。

PDB培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000ml。

二、HTC在防治辣椒疫病中的应用

1、温室防病试验

选取生长良好，6叶期辣椒（品种为特大茄门甜椒，由内蒙古赤峰市展欣种业公司生产销售）每盆5株，分为如下几组：

处理组：每盆浇灌25ml稀释10倍的由上述一得到的HTC生防制剂（其中干物质的浓度为40μg/ml）；

阳性对照组：每盆浇灌25ml球毛壳ND35发酵液（球毛壳ND35记载在：球毛壳中抗真菌物质对树皮腐烂病菌的抑制作用，安徽农业科学，2010，38（12）：6256-6257，6298；公众可从山东农业大学获得；发酵方法同上述HTC生防制剂制备方法相同，且干物质的浓度也相同）；

阴性对照组：每盆浇灌25ml灭菌水。

各组均按照上述处理5d后每株辣椒苗浇灌10⁵cfu/ml的辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株SD-33（记载在辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究，中国农业科学2009,42(6):1988-1993；公众可从山东农业大学获得）游动孢子悬浮液5ml，每个处理重复6盆。

7d后调查辣椒苗发病（辣椒疫病）情况，病情指数，并计算防治效果。实验重复三次，结果取平均值。

辣椒疫病分级标准（林柏青等,辣椒品种抗疫病鉴定方法的初步研究[J].中国蔬菜,1994,(4):21-25）：

0级：无病；

1级：幼苗茎基部稍有变黑，但植株健康不萎焉；

2级：幼苗茎基部变黑达1-2cm，叶片不可恢复性萎焉，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗茎基部变黑达2cm以上，叶片明显萎焉或明显脱落；

4级：幼苗茎基部变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎焉；

5级：植株全部枯死。

苗期盆栽试验结果如表1和图3（左边为CK阴性对照组，右边为HTC处理组）所示，可以看出，施用HTC生防制剂对辣椒疫病的防治效果达72.19%，阳性对照的球毛壳ND35发酵液的防治效果为57.92%。

表2HTC生防制剂对辣椒疫病的温室防治效果

2、温室促生试验

选取生长均一的2叶期辣椒幼苗，每盆5株，处理组每盆浇灌40ml HTC生防制剂（其中干物质的浓度为40μg/ml），以浇灌40ml含球毛壳ND35发酵液（其中干物质的浓度为40μg/ml）为阳性对照，以浇灌40ml自来水为阴性对照（CK），每个处理重复6盆，每3d浇一次水，30d后观察植株的生长状况，并测量株高和鲜重。

结果如表3和图4（左边两盆为CK阴性对照组，右边两盆为HTC处理组）所示，可以发现HTC生防制剂（其中干物质的浓度为40μg/ml）和球毛壳ND35发酵液（其中干物质的浓度为40μg/ml）均对辣椒苗的生长具有较强的促进作用，在株高和生物量（生物量等同于辣椒植株包括根茎叶的鲜重，并没有包括果实重量）上与阴性对照均表现出明显差异。

表3为HTC生防制剂对辣椒苗生长的促生效果

3、田间促生增产试验

选择生长良好的8叶期辣椒苗，移栽时每株浇灌10ml的HTC生防制剂（其中干物质的浓度为40μg/ml），以浇灌10ml球毛壳ND35发酵液（其中干物质的浓度为40μg/ml）为阳性对照，以浇灌10ml自来水为阴性对照，90d后调查辣椒植株鲜重和果实重量，计算生物量和产量增加百分率。

结果如表4所述，可以发现HTC生防制剂与球毛壳ND35发酵液对辣椒的生物量和果实产量增加均有较好的促进作用，增产作用明显。

表4为大田条件下HTC生防制剂对辣椒的促生增产效果

上述研究均可看出，HTC生防制剂有良好的防病、增产效果，辣椒疫病的防治效果可达72.19%，幼苗期株高增加12.27%，生物量增加32.34%；收获期对辣椒果实产量提高15.12%，生物量增加31.11%；因此该菌株有较大的潜力开发成商业化的生防制剂。

Claims

1.金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC，其保藏号为CGMCC No.6173。

2.一种制备防治辣椒疫病HTC生防制剂的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC，得到发酵产物，即得到生防制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述得到发酵产物后，还包括如下步骤：去除所述发酵产物中的菌丝体，得到生防制剂。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件如下：25-28℃，160-180rpm振荡培养10-12d；所述发酵的条件具体如下：25℃、160rpm振荡培养12d。

5.由权利要求2-4中任一所述方法制备的生防制剂。

6.一种防治辣椒疫病或促进辣椒生长或者促进辣椒增产或抗菌的产品，其活性成分为权利要求1所述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC或权利要求5所述的生防制剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；

所述抗菌为抗如下8种病原菌中的至少一种：辣椒疫霉Phytophthora capsici、杨树腐烂病菌Valsa sordida、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、核桃炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、烟草赤星病菌Alternaria alternata、杨树水泡溃疡病菌Botryosphaeria ribis、玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani、板栗疫病菌Cryphonectriaparasitica；

8.权利要求1所述的金色毛壳Chaetomium aureum菌株HTC或权利要求5所述的生防制剂在防治辣椒疫病或促进辣椒生长或者促进辣椒增产或抗菌中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；

所述抗菌为抗如下8种病原菌中的至少一种：辣椒疫霉Phytophthora capsici、杨树腐烂病菌Valsa sordida、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、核桃炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、烟草赤星病菌Alternaria alternata、杨树水泡溃疡病菌Botryosphaeria ribis、玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani、板栗疫病菌Cryphonectriaparasitica。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述促进辣椒生长体现在提高辣椒株高或增加辣椒生物量或增加辣椒产量。