CN111621440A - 一种抗肿瘤的多肽组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海洋短杆菌Brevibacterium sp.MTL5‑77，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18765。本发明还公开了所述菌株的抗肿瘤多肽组合物的制备方法和用该制备方法制备获得的抗肿瘤多肽组合物。本发明还公开了所述菌株的抗肿瘤多肽组合物的制药用途和包含该抗肿瘤多肽组合物的抗癌药物。

Description

一种抗肿瘤的多肽组合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤的多肽组合物及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤是指在致癌基因作用下，细胞基因发生了改变，失去了对细胞正常生长的调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物。恶性肿瘤由于分化不成熟、生长较快，进入破坏器官的结构和功能，进而发生转移，所以对机体的影响较为严重。目前，癌症在中国的发病率占到世界的22％，发病人数全球第一；由于癌症在中国造成的死亡率占到世界的27％，位居第29位。观察全球抗肿瘤药物研发现状，发现市场增速呈现放缓趋势，新兴国家市场中上市15 年以上的老药仍是主力军，新上市的药物价格呈现越来越昂贵的趋势，因此抗肿瘤药物的研发仍具有巨大的市场潜力，应不断投入各方面资源，治疗肿瘤疾病。
由于深海环境目前仍处于探索的高潮期，各方面新的发现正在不断涌现。对于深海中存在的大量微生物资源，其在药物研发方面具有巨大的潜在价值。通过提取微生物代谢产物，寻找蕴藏其中的抗肿瘤药物，不断促进海洋活性物的开发和利用，就具有了重大的研究价值与研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从马里亚纳海沟海水中培养分离得到的能够产生抗癌物质的菌株、其抗癌活性组分及其制备方法和用途。
本发明的第一方面是提供了一种抗肿瘤多肽组合物的制备方法，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌，所述多肽组合物系从短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77的胞内代谢产物分离获得，所述多肽组合物所含多肽的分子量为616～1299Da，所述制备方法包括如下步骤：
(1)发酵培养
将短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77的菌株接种于20～40mL的培养基，于10～20℃、 150～220r/min的恒温振荡培养箱里培养18～28h，得种子发酵液；
将种子发酵液按照4～10％的接种量接种到40～100mL培养基中，于相同条件下继续培养 20～28h，得扩增发酵液；
将扩增发酵液按照4～10％的接种量接种到400～600mL培养基中，于相同条件下继续培养36～72h，得发酵菌液；
所述培养基为：3～8g蛋白胨，0.5～1.5g酵母粉，0.005～0.015g磷酸铁，海水定容至1 L，在1.05kg/cm2，115～121℃，15～30min的条件下灭菌；
(2)离心收集菌体
收集上述菌株MTL5-77的发酵菌液，在8000～10000r/min，4～10℃，15～30min条件下离心，收集菌体；
(3)乙醇浸提
按10～30mM，pH 7.0～9.5的Tris-HCl缓冲液:菌体＝1:1～1:3(v/v)比例将Tris-HCl缓冲液加入菌体中，搅拌均匀，使菌体重新溶解，后经终浓度65～80％的乙醇，浸提菌体3～8h，以提取活性粗提物；过滤菌体，收集液体后，于35～50℃、80～120rpm、44mbar旋蒸至干燥，室温放置，挥发乙醇，得到菌株MTL5-77的乙醇浸提物；
(4)DEAE阴离子交换色谱分离纯化乙醇浸提物
按乙醇浸提物:10～30mM，pH 7.0-9.5的Tris-HCl缓冲液＝3:1～1:1(mg/mL)的比例将乙醇浸提物加入Tris-HCl缓冲液中，在8,000～12,000rpm、3～8℃条件下，离心15～30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物，得活性组分A；
(5)RP-HPLC高效液相色谱分离纯化活性组分A
按活性组分A:水＝3:1～1:1(mg/mL)的比例将活性组分A加入水中，在8,000～12,000rpm、 3～8℃条件下，离心15～30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，利用高效液相色谱仪进一步纯化，得活性组分B；
(6)XBP C18柱的二次纯化活性组分B
按照步骤(5)的方法将活性组分B再次过XBP C18柱，进行分离纯化，收集峰型保留时间为5.090min的流动相组分，得活性组分C；
(7)真空冷冻干燥
将活性组分C真空冷冻干燥，得抗肿瘤多肽组合物BMTP。
在一优选例中，所述步骤(4)中用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物的色谱条件为：色谱柱为DEAE阴离子交换色谱柱；流速：1.5～10mL/min；进样体积：1.5～10mL；紫外检测波长：254nm；进样缓冲液：10～30mM，pH 7.0～9.5Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液：将NaCl 加入进样缓冲液中，使NaCl的终浓度为1M；
用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物的分离方法为：AKTA快速蛋白纯化仪用进样缓冲液冲洗，并平衡DEAE阴离子交换柱；设置流速为1.5～10mL/min，平衡基线；取1.5～10mL过滤0.22μm滤膜的乙醇浸提物加入到AKTA快速蛋白纯化仪；用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分，再用20～40％的洗脱缓冲液，洗脱挂柱的组分，直接收集DEAE阴离子交换层析图谱中的洗脱峰b对应的组分，得活性组分A。
在另一优选例中，所述步骤(5)中RP-HPLC色谱法的色谱条件为：色谱柱：XBP C18；温度：4～25℃；流速：0.4～0.8mL/min；进样量：5～50μL；紫外检测波长：254nm；流动相Ⅰ：乙腈；流动相Ⅱ：纯净水；
RP-HPLC色谱法的分离纯化方法为：对高效液相色谱仪进行清洗、脱气，洗净XBPC18 柱；首先用10％的流动相Ⅰ和90％的流动相Ⅱ冲洗，平衡基线；进样体积20μL，流速为0.5 mL/min，紫外检测波长λ＝254nm，进行梯度洗脱，收集紫外吸收峰对应的流动相组分；再经过XBP C18柱分离纯化后，收集峰型保留时间为5.010min的流动相组分，得活性组分B。
在另一优选例中，所述RP-HPLC色谱流动相梯度洗脱的程序为：
Figure BDA0002532790830000031
本发明的第二方面是提供了一种可用所述的制备方法制备获得的抗肿瘤多肽组合物。
本发明的第三方面是提供了所述的抗肿瘤多肽组合物在制备预防或者治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌，所述药物包含所述的抗肿瘤多肽组合物。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1菌株Brevibacterium sp.MTL5-77革兰氏染色图
图2菌株Brevibacterium sp.MTL5-77的16S rDNA基因PCR结果
图3抗肿瘤活性组分A的DEAE阴离子交换层析图谱
其中，洗脱峰b对应的组分为抗肿瘤活性组分A
图4抗肿瘤活性组分B的HPLC层析图谱
图5抗肿瘤活性组分C的C18柱层析图谱
图6抗肿瘤活性组分BMTP的质谱图
图7BMTP抑制肿瘤细胞NCI-H460，HepG2，Panc28，Hela，BEL-7402，A549的增殖
具体实施方式
本发明提供了一种从马里亚纳海沟海水中培养分离得到的能够产生抗肿瘤物质的海洋短杆菌MTL5-77，命名为短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77(以下简称菌株MTL5-77)。该菌株已于2019年10月30日存活保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏号为CGMCC NO.18765。
本发明的菌株MTL5-77在固体培养基上生长3～4天后的菌落颜色为黄色，形状为圆形，表面光滑，凸起，排列有序均一，边缘或者正反面与中央部位颜色一致。革兰氏染色鉴定结果显示菌体染色为蓝紫色，因此为革兰氏阳性菌(图1)。菌株MTL5-77经生理生化鉴定显示，其具有一定的耐盐性，仅可以利用葡萄糖，对其他糖醇则无法利用，具有尿素酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶活性。
菌株MTL5-77的16S rRNA基因经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物的分子量在1.5kb左右(图2)。对菌株MTL5-77的16S rRNA基因PCR结果进行序列测定，测得序列长度为1454bp，见SEQ ID No.1。
参考《伯杰细菌鉴定手册(第九版)》，结合16S rRNA基因序列结果以及生理生化分析结果，确定菌株MTL5-77为放线菌门，放线菌目，短杆菌科，短杆菌属Brevibacterium，命名为短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77，为一种新型的菌株。
本发明的菌株MTL5-77的抗肿瘤活性组分从菌株MTL5-77的胞内代谢产物分离获得， MTL5-77的发酵培养基成分为：蛋白胨3～8g、酵母粉0.5～1.5g、磷酸铁0.005～0.015g、海水定容至1L，将培养基在1.05kg/cm2、115～121℃、15～30min的条件下灭菌。
进一步，本发明的菌株MTL5-77的抗肿瘤活性组分的制备方法如下：
(1)发酵培养
将短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77的菌株接种于20～40mL的培养基，于10～20℃、 150～220r/min的恒温振荡培养箱里培养18～28h，得种子发酵液；
将种子发酵液按照4～10％的接种量接种到40～100mL培养基中，于相同条件下继续培养 20～28h，得扩增发酵液；
将扩增发酵液按照4～10％的接种量接种到400～600mL培养基中，于相同条件下继续培养36～72h，得发酵菌液；
所述培养基为：3～8g蛋白胨，0.5～1.5g酵母粉，0.005～0.015g磷酸铁，海水定容至1 L，在1.05kg/cm2，115～121℃，15～30min的条件下灭菌。
(2)离心收集菌体：
收集上述菌株MTL5-77的发酵菌液，在8000～10000r/min，4～10℃，15～30min条件下离心，收集菌体。
(3)乙醇浸提：
按10～30mM，pH 7.0～9.5的Tris-HCl缓冲液:菌体＝1:1～1:3(v/v)比例将Tris-HCl缓冲液加入菌体中，搅拌均匀，使菌体重新溶解，后经终浓度65～80％的乙醇，浸提菌体3～8h，以提取活性粗提物；过滤菌体，收集液体后，于35～50℃、80～120rpm、44mbar旋蒸至干燥，室温放置，挥发乙醇，得到菌株MTL5-77的乙醇浸提物。
(4)DEAE阴离子交换色谱分离纯化乙醇浸提物
按乙醇浸提物:10～30mM，pH 7.0-9.5的Tris-HCl缓冲液＝3:1～1:1(mg/mL)的比例将乙醇浸提物加入Tris-HCl缓冲液中，在8,000～12,000rpm、3～8℃条件下，离心15～30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物；
色谱条件：色谱柱为DEAE阴离子交换色谱柱；流速：1.5～10mL/min；进样体积：1.5～10 mL；紫外检测波长：254nm；进样缓冲液：10～30mM，pH 7.0～9.5Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液：将NaCl加入进样缓冲液中，使NaCl的终浓度为1M。
分离方法：AKTA快速蛋白纯化仪用进样缓冲液冲洗，并平衡DEAE阴离子交换柱；设置流速为1.5～10mL/min，平衡基线；取1.5～10mL过滤0.22μm滤膜的乙醇浸提物加入到AKTA 快速蛋白纯化仪；用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分，再用20～40％的洗脱缓冲液，洗脱挂柱的组分，直接收集DEAE阴离子交换层析图谱(图3)中的洗脱峰b对应的组分，得活性组分A；
(5)RP-HPLC高效液相色谱分离纯化活性组分
按活性组分A:水＝3:1～1:1(mg/mL)的比例将活性组分A加入水中，在8,000～12,000rpm、 3～8℃条件下，离心15～30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，利用高效液相色谱法(HPLC) 进一步纯化。
RP-HPLC色谱条件：色谱柱：XBP C18；温度：4～25℃；流速：0.4～0.8mL/min；进样量：5～50μL；紫外检测波长：254nm；流动相Ⅰ：乙腈；流动相Ⅱ：纯净水。
RP-HPLC色谱法分离纯化方法：利用高效液相色谱仪以及XBP C18柱对活性组分A进行分离纯化。实验前，对高效液相色谱仪进行清洗、脱气，洗净XBP C18柱。首先用10％的流动相Ⅰ和90％的流动相Ⅱ冲洗，平衡基线。进样体积20μL，流速为0.5mL/min，紫外检测波长λ＝254nm，进行梯度洗脱，收集紫外吸收峰对应的流动相组分。
经过XBP C18柱分离纯化后，收集峰型保留时间为5.010min的流动相组分，得活性组分B(图4)；
(6)XBP C18柱的二次纯化
按照步骤(5)的方法将活性组分B再次过XBP C18柱，进行分离纯化，收集峰型保留时间为5.090min的流动相组分，得活性组分C(图5)，
(7)真空冷冻干燥：将活性组分C进行真空冷冻干燥，得抗肿瘤多肽组合物BMTP(aProduct from Brevibacterium sp.MTL5-77)(B-Brevibacterium；MT-Mariana Trench；P-Product)。
进一步，抗肿瘤多肽组合物BMTP的鉴定方法如下：
(1)抗肿瘤多肽组合物BMTP的质谱分析
BMTP用5800串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，采用正离子模式和自动获取数据模式采集数据。仪器先用肌红蛋白(myoglobin)酶解肽段进行外标校正。基质和样品的PMF质量扫描范围为500-3600Da，获得一级图谱(图6)。
由质谱指纹图谱可见：BMTP包含分子量为616、785、850、1044和1299等的多个多肽，即其含有分子量为616～1299Da的多个多肽。
(2)实验中通过非小细胞肺癌细胞A549，利用MTT法检测BMTP的抗肿瘤活性。为测定BMTP对肿瘤细胞的IC50值，共设定6个梯度(含空白对照)，加样体积20μL。具体操作方法如下：①取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549，弃培养液，再用3-4mL的PBS 清洗。加入800μL胰酶消化液消化40-60s，吸出胰酶，放在含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中孵育60-80s，显微镜下观察，发现80％左右的细胞变圆皱缩就停止反应；②消化后的细胞加入适量RPMI-1640细胞培养液，用无菌吸管吹打成单细胞悬液。用细胞计数器测定悬液细胞数，取适量细胞悬液到新鲜18mL RPMI-1640细胞培养液中，使新的细胞悬液浓度为3-4×103个/mL；③将细胞悬液加到96孔板中，每孔加180μL，在恒温培养箱中培养16-20 h；④每孔加入样品20μL，样品在加入前用0.22μm的无菌滤膜过滤，每组设置3个平行孔；⑤然后继续在恒温培养箱中培养48h，每个样品孔中加20μL MTT(5mg/mL，即0.5％ MTT)，置于恒温培养箱中继续培养4h；⑥终止培养反应，去除孔内液体，用RPMI-1640 培养基清洗2遍，每孔加入150μL DMSO，多功能酶标仪振荡10min，使结晶物甲瓒充分溶解；⑦酶标仪测定OD 570nm下的吸光值，用下面公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(％) ＝((OD对照组-OD实验组)/OD对照组)×100％。抑制率达到50％时的药物浓度为IC50值，实验重复3次结果以均值±SD表示。
然后按照上述方法，分别将肝癌细胞BEL-7402、宫颈癌细胞Hela、胰腺癌细胞Panc28、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞NCI-H460铺96孔板，按照终浓度0、2、3、5、6、7μg/mL加入到不同细胞的96孔板中，每个浓度做3组重复，MTT法测定BMTP对不同肿瘤细胞的活性抑制。利用MTT法，测定BMTP处理不同肿瘤细胞48h后，对肿瘤细胞的半致死抑制率。
实验结果显示：BMTP对人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞Panc 28和人大细胞肺癌细胞NCI-H460均有较好的抑制肿瘤细胞增殖的效果，IC50分别为2.9798μg/mL，3.4656μg/mL，2.8642μg/mL，4.1040μg/mL，4.3324μg/mL和5.6793μg/mL。BMTP在体外对实验肿瘤细胞具有较好的抑制活性，IC50值的范围为2μg/mL<IC50<6μg/mL。说明从Brevibacterium sp.MTL5-77中获得的BMTP在体外具有广泛的抑制肿瘤细胞增殖的作用(表3，图7)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1菌株MTL5-77的筛选及鉴定
1.1.菌株MTL5-77的分离纯化和鉴定
将马里亚纳海沟的L5站点(11°23ˊN，142°29ˊE)3000米深海水样品经过0.22μm滤膜抽滤，然后将附菌滤膜存于含25％甘油瓶中，于-80℃冰箱储存。将滤菌膜转移至无菌工作台，粉碎后重溶于样品海水，适度摇动，形成菌液。在常压条件下，取适量菌液涂布于2216E 海水分离培养基，置于25℃、静置培养。待单菌落直径约1mm时，再挑取不同单菌落涂布纯化培养。将纯化后的细菌接种于对应液体培养基，适当振荡培养，待对数生长期保存到含 25％的无菌甘油管中，-80℃储藏。
1.2.菌株MTL5-77的发酵培养
液体培养基的配制：蛋白胨5g/L，酵母粉1.0g/L，磷酸高铁0.008g/L，以海水配制，121℃、30min灭菌。
取1支100μL甘油保种的菌株MTL5-77，接种于30mL的培养基，于16℃、200r/min 的恒温振荡培养箱里培养24h，至对数生长期，即为种子发酵液。用于后续革兰氏染色检测。
固体培养基的配制：蛋白胨5g/L，酵母粉1.0g/L，磷酸高铁0.008g/L，琼脂粉2％，加入海水配制，121℃、高压蒸汽灭菌15min。
制备固体培养基平板，涂布种子发酵液，生长3天，形成单一菌落，用于生理生化实验。
1.3.菌株MTL5-77的菌种鉴定。
革兰氏染色：①取20μL菌悬液涂布于洁净载玻片，自然晾干后，菌斑向上，过火焰上方3次进行固定；②滴加结晶紫染液没过菌斑面，染色60s，倾去染色液，一次水轻轻洗净；滴加鲁哥氏碘液没过菌斑面，媒染60s，一次水洗净碘液；③倾斜载玻片，95％乙醇脱色25 s至无色，一次水洗净；④滴加番红复染菌斑5min，用一次水洗净番红染色液，涂片自然晾干后，光学显微镜观察，用油镜进行观察、拍照。菌株MTL5-77的革兰氏染色鉴定结果显示，菌体染色为蓝紫色，因此为革兰氏阳性菌(图1)。
表1菌株MTL5-77生理生化鉴定结果
Figure BDA0002532790830000081
从固体培养基平板上挑取纯化的单菌落到无菌水试管中，研磨成0.5麦氏浓度的菌悬液，加到生理生化鉴定管中，每管加3滴，得到菌株MTL5-77的生理生化检测结果(表1)。菌株MTL5-77具有一定的耐盐性，仅可以利用葡萄糖，对其他糖醇则无法利用，具有尿素酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶活性。
“+”表示阳性反应
“－”表示阴性反应
1.4. 16S rDNA序列测定
142.1.菌株基因组DNA的提取
菌株基因组DNA的提取采用Invitrogen Genomic DNA mini Kit，详细方法如下：将水浴锅的温度分别设定为55℃和37℃。取200μL的溶菌酶缓冲液，加入新鲜的溶菌酶，使最终溶菌酶浓度为20mg/mL。通过离心收集2×109革兰氏阳性细胞，用180μL包含溶菌酶的缓冲液重悬细胞，涡旋振荡，37℃培养30min。加入20μL蛋白酶，涡旋振荡。再加入200μLPureLinkTM基因组裂解/结合缓冲液，涡旋混合均匀，55℃培养30min。加入200μL 96-100％乙醇溶液于溶菌液中，涡旋混合均匀。将吸附柱放入收集管中，向其中加入640μL的溶菌液，室温下10000×g离心1min。弃掉收集管，将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL洗脱缓冲液1，室温下10000×g离心1min。弃掉收集管，将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL 洗脱缓冲液2，室温下最大转速离心3min。将吸附柱放入1.5μL的离心管中，加入25-200μL 基因组洗脱缓冲液，室温下等待1min后，再以最大速度离心1min。收集管中纯化后的DNA， -20℃下储存。
1.4.2. 16S rDNA引物设计
采用16S rDNA通用引物，由上海生工合成。
正向引物27F：5’-agagtttgat cctggctca-3’(SEQ ID No.2)；
反向引物1492R：5’-ggttaccttgttacgactt-3’(SEQ ID No.3)；
1.4.3.菌株16S rDNA的扩增
16S rDNA序列的PCR扩增体系：以菌株提取的基因组DNA为模版，加入2μL引物(见1.4.2)；0.25μL Taq DNA聚合酶(5U·mL-1)；5μL 10xPCR反应缓冲液；4μL dNTP MasterMix；ddH20补足至50μL。
PCR反应条件：95℃预变性4min；30个循环(94℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 90s)；72℃终延伸10min。
1.4.4.琼脂糖电泳检测PCR产物
将扩增产物加入到2％的琼脂糖凝胶中，用2,000bp的Marker做对照，电泳检测。如果在Marker的1.5kb左右有明亮单一条带，可证明16S rRNA基因序列扩增成功(图2)。将PCR产物送至上海生工，进行基因测序。测得MTL5-77的16S rDNA的序列长度分别为1454bp，测序结果如SEQ ID No.1所示。菌株MTL5-77的16S rDNA序列已提交Genbank，登录号为MH151243。
cgggggcgcgtgctaatacatgcagtcgagcgaatcgatgggagcttgctccctgagattagcggcggacgggtgagtaacacgtgg gcaacctgcctataagactgggataacttcgggaaaccggagctaataccggatacgttcttttctcgcatgagagaagatggaaagacggttta cgctgtcacttatagatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtg atcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagca acgccgcgtgaacgaagaaggccttcgggtcgtaaagttctgttgttagggaagaacaagtaccagagtaactgctggtaccttgacggtacct aaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgc aggtggttccttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggaaagtgga attccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaag cgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagct aacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtg gtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttccccttcgggggacagagtgaca ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgg gcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgcta caatggatggtacaaagggctgcaaacctgcgaaggtaagcgaatcccataaagccattctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcat gaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttg taacacccgaagtcggtgaggtaaccttcatggagccagccgcctaaggtgacaagagt(SEQ ID No.1)。
参考《伯杰细菌鉴定手册(第九版)》、16sDNA的结果和生理生化分析结果，确定菌株 MTL5-77为放线菌门，放线菌目，短杆菌科，短杆菌属(Brevibacterium)，命名为Brevibacterium sp.MTL5-77。
实施例2菌株MTL5-77的发酵培养及抗肿瘤活性组分BMTP的制备
(1)发酵培养：将短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77的菌株接种于培养基，培养基成分为：5g蛋白胨，1g酵母粉，0.01g磷酸铁，海水定容至1L，并将培养基在1.05kg/cm2，120℃，20min的条件下灭菌。在16℃、180r/min条件下培养24h。按照5％的接种量将种子发酵液接种到含50mL培养基的250mL培养瓶中，在16℃、180r/min条件下继续培养 24h后得到扩增菌液。再按照5％的接种量将扩增菌液接种到含500mL培养基的2L培养瓶中，16℃、160r/min条件下继续培养48h，得发酵菌液60L。
(2)离心收集菌体：
收集上述菌株MTL5-77的发酵菌液，在9000r/min，5℃，20min条件下离心，收集菌体。
(3)乙醇浸提：
按20mM，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液:菌体＝1:2(v/v)比例将Tris-HCl缓冲液加入菌体中，搅拌均匀，使菌体重新溶解，后经终浓度70％的乙醇，浸提菌体5h，以提取活性粗提物。过滤菌体，收集液体后，40℃、100rpm、44mbar旋蒸至干燥，室温放置，至乙醇彻底挥发，得到菌株MTL5-77的乙醇浸提物。
(4)DEAE阴离子交换色谱柱分离纯化乙醇浸提物
按乙醇浸提物:20mM，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液＝2:1(mg/mL)的比例将乙醇浸提物加入Tris-HCl缓冲液中，在9000rpm、4℃条件下，离心20min，收集上清液，过0.22μm滤膜，用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物。
色谱条件：色谱柱为HiPrepTM16/10DEAE Fast Flow预装柱；流速：2mL/min；进样体积：2mL；紫外检测波长：254nm；进样缓冲液：20mM，pH 9.0Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液：将NaCl加入进样缓冲液中，使NaCl的终浓度为1M。
分离方法：AKTA快速蛋白纯化仪用进样缓冲液冲洗，并平衡DEAE阴离子交换柱。设置流速为2mL/min，平衡基线。取2mL过滤0.22μm滤膜的乙醇浸提物加入到AKTA快速蛋白纯化仪。用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分，再用30％的洗脱缓冲液，洗脱挂柱的组分，直接收集DEAE阴离子交换层析图谱中洗脱峰b对应的组分，得活性组分A(图3)。
(5)RP-HPLC高效液相色谱分离纯化抗肿瘤活性组分
按活性组分A:水＝2:1(mg/mL)比例将活性组分A加入水中，在9000rpm、4℃条件下，离心120min，收集上清液，过0.22μm滤膜，利用高效液相色谱法(HPLC)进一步纯化。
RP-HPLC色谱条件：色谱柱：Agela Venusil XBP C18；温度：24℃；流速：0.5mL/min；进样量：20μL；紫外检测波长：254nm；流动相Ⅰ：乙腈；流动相Ⅱ：纯净水。
RP-HPLC色谱流动相洗脱程序：利用以下流动相比例，进行抗肿瘤活性组分的分离纯化 (表2)。
表2 HPLC色谱梯度洗脱程序
Figure BDA0002532790830000111
RP-HPLC色谱法分离纯化方法：利用岛津LC-16高效液相色谱仪以及AgelaVenusil XBP C18柱对抗肿瘤活性组分A进行分离纯化。实验前，对高效液相色谱仪进行清洗、脱气，洗净C18柱。首先用10％(v/v)的流动相Ⅰ和90％(v/v)的流动相Ⅱ冲洗，平衡基线。进样体积20μL，流速为0.5mL/min，紫外检测波长λ＝254nm，按照表2中的洗脱程序进行洗脱，收集紫外吸收峰对应的流动相组分。
经过XBP C18柱分离纯化后，收集峰型保留时间为5.010min的流动相组分，得活性组分B(图4)
(6)XBP C18柱第二次纯化
按照步骤(5)的方法将活性组分B再次过XBP C18柱，进行分离纯化，收集峰型保留时间为5.090min的流动相组分，得活性组分C(图5)，
(7)真空冷冻干燥：将活性组分C进行真空冷冻干燥，得BMTP 2.4g。
实施例3.抗肿瘤多肽组合物BMTP的质谱分析
(1)BMTP用5800串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，采用正离子模式和自动获取数据模式采集数据。仪器先用肌红蛋白(myoglobin)酶解肽段进行外标校正。基质和样品的PMF 质量扫描范围为500-3600Da，获得一级谱图(图6)。
(2)样品处理方法：先点0.5μL的样品于MALDI靶板上，自然干燥后，再点上0.5μL0.5g/L CHCA溶液(溶剂，0.1％TFA+50％ACN)中，在室温下自然干燥。
(3)质谱分析和谱图解析
仪器名称：5800MALDI-TOF/TPF(AB SCIEX，USA)
分析软件：TOF/TOF Explorer，Data Explorer
样品用5800串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为20kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。仪器先用myoglobin 酶解肽段进行外标校正。基质和样品的PMF质量扫描范围为700-3600Da。进行完MS后,直接选择目标肽段离子进行MS/MS分析。
MS采用Reflector Positive参数：CID(OFF)，mass rang(700－3600Da)FocusMass (1600Da)Fixed laser intensity(3000)Digitizer：Bin Size(0.5ns)
由质谱指纹图谱可见：BMTP包含分子量为616、785、850、1044和1299等的多个多肽，即其包含分子量为616～1299Da的多个多肽。
实施例4.BMTP的抗肿瘤细胞活性的验证
(1)BCA蛋白浓度测定活性组分蛋白浓度
研究中应用TIANGEN品牌BCA蛋白浓度测定试剂盒，详细操作如下：
①将BCA试剂和Cu2+试剂按50:1(v/v)充分混匀，即为BCA工作液。
②分别将新配制的BSA标准液(表4-3)和待测样品加入96孔平底板中，各25μL，并设置3个平行。每孔中加入200μL BCA工作液，并加盖置于酶标仪中振荡混匀；
③将96孔板置于37℃恒温生化培养箱中，孵育30min；
④样品冷却至室温，用酶标仪检测其吸光度，λ＝562nm；
⑤根据BSA吸光值和浓度绘制标准曲线，并通过标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
利用BCA蛋白浓度测定法，设定λ＝562nm，测定不同浓度BSA的吸光值，每个浓度做3个平行。计算平均值，利用吸光度和标准品蛋白浓度绘制BSA蛋白浓度标准曲线。
将活性BMTP冻干样品用0.01M PBS缓冲液配成一定浓度的母液，用BCA法测定母液的蛋白浓度后，用以测定BMTP的活性。
(2)MTT法检测BMTP对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用
实验中通过非小细胞肺癌细胞A549，利用MTT法检测抗肿瘤活性。为测定活性组分对肿瘤细胞的IC50值，共设定6个梯度(含空白对照)，加样体积20μL。具体操作方法如下：①取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549，弃培养液，再用3-4mL的PBS清洗。加入 800μL胰酶消化液消化40-60s，吸出胰酶，放在含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中孵育 60-80s，显微镜下观察，发现80％左右的细胞变圆皱缩就停止反应；②消化后的细胞加入适量RPMI-1640细胞培养液，用无菌吸管吹打成单细胞悬液。用细胞计数器测定悬液细胞数，取适量细胞悬液到新鲜18mL RPMI-1640细胞培养液中，使新的细胞悬液浓度为3-4×103个 /mL；③将细胞悬液加到96孔板中，每孔加180μL，在恒温培养箱中培养16-20h；④每孔加入样品20μL，样品在加入前用0.22μm的无菌滤膜过滤，每组设置3个平行孔；⑤然后继续在恒温培养箱中培养48h，每个样品孔中加20μL MTT(5mg/mL，即0.5％MTT)，置于恒温培养箱中继续培养4h；⑥终止培养反应，去除孔内液体，用RPMI-1640培养基清洗2遍，每孔加入150μL DMSO，多功能酶标仪振荡10min，使结晶物甲瓒充分溶解；⑦酶标仪测定OD 570nm下的吸光值，用下面公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(％)＝((OD 对照组-OD实验组)/OD对照组)×100％。抑制率达到50％时的药物浓度为IC50值，实验重复 3次结果以均值±SD表示。
然后按照上述方法，分别将肝癌细胞BEL-7402、宫颈癌细胞Hela、胰腺癌细胞Panc28、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞NCI-H460铺96孔板，按照终浓度0、2、3、5、6、7μg/mL加入到不同细胞的96孔板中，每个浓度做3组重复，MTT法测定BMTP对不同肿瘤细胞的活性抑制。利用MTT法，测定BMTP处理不同肿瘤细胞48h后，对肿瘤细胞的半致死抑制率。
实验结果显示：BMTP对人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞Panc 28和人大细胞肺癌细胞NCI-H460均有较好的抑制肿瘤细胞增殖的效果，IC50分别为2.9798μg/mL，3.4656μg/mL，2.8642μg/mL，4.1040μg/mL，4.3324μg/mL和5.6793μg/mL。BMTP在体外对实验肿瘤细胞具有较好的抑制活性，IC50值的范围为2μg/mL<IC50<6μg/mL。说明从Brevibacterium sp.MTL5-77中获得的BMTP在体外具有广泛的抑制肿瘤细胞增殖的作用(表3，图7)。
表3 BMTP对不同肿瘤细胞的半数抑制率
肿瘤细胞 平均值(IC<sub>50</sub>/μg·mL-1) 样本1 样本2 样本3 标准偏差
A549 2.9798 2.805 3.1037 3.0307 0.155719
BEL-7402 3.4656 3.6034 3.4066 3.3868 0.119748
Hela 2.8642 2.8802 2.6425 3.0699 0.214149
Panc 28 4.3324 4.1599 4.2557 4.5861 0.223602
HepG2 4.104 4.3529 3.952 4.0071 0.217307
NCI-H460 5.6793 5.8352 5.5966 5.6061 0.135097
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 一种抗肿瘤的多肽组合物及其制备方法和用途
<130> JSP12004993
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> Brevibacterium sp. MTL5-77
<400> 1
cgggggcgcg tgctaataca tgcagtcgag cgaatcgatg ggagcttgct ccctgagatt 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcctat aagactggga taacttcggg 120
aaaccggagc taataccgga tacgttcttt tctcgcatga gagaagatgg aaagacggtt 180
tacgctgtca cttatagatg ggcccgcggc gcattagcta gttggtgagg taatggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgaacg aagaaggcct tcgggtcgta aagttctgtt gttagggaag 420
aacaagtacc agagtaactg ctggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagcgcgc gcaggtggtt ccttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc aagtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatttg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac 720
tgacactgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggctttcccc ttcgggggac agagtgacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200
acgtgctaca atggatggta caaagggctg caaacctgcg aaggtaagcg aatcccataa 1260
agccattctc agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg aatcgctagt 1320
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttcatggag ccagccgcct 1440
aaggtgacaa gagt 1454
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一种抗肿瘤多肽组合物的制备方法，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌，所述多肽组合物系从短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77的胞内代谢产物分离获得，所述多肽组合物所含多肽的分子量为616～1299Da，所述制备方法包括如下步骤：
(1)发酵培养
将短杆菌Brevibacterium sp.MTL5-77的菌株接种于20～40mL的培养基，于10～20℃、150～220r/min的恒温振荡培养箱里培养18～28h，得种子发酵液；
将种子发酵液按照4～10％的接种量接种到40～100mL培养基中，于相同条件下继续培养20～28h，得扩增发酵液；
将扩增发酵液按照4～10％的接种量接种到400～600mL培养基中，于相同条件下继续培养36～72h，得发酵菌液；
所述培养基为：3～8g蛋白胨，0.5～1.5g酵母粉，0.005～0.015g磷酸铁，海水定容至1L，在1.05kg/cm2，115～121℃，15～30min的条件下灭菌；
(2)离心收集菌体
收集上述菌株MTL5-77的发酵菌液，在8000～10000r/min，4～10℃，15～30min条件下离心，收集菌体；
(3)乙醇浸提
按10～30mM，pH 7.0～9.5的Tris-HCl缓冲液:菌体＝1:1～1:3(v/v)的比例将Tris-HCl缓冲液加入菌体中，搅拌均匀，使菌体重新溶解，后经终浓度65～80％的乙醇，浸提菌体3～8h，以提取活性粗提物；过滤菌体，收集液体后，于35～50℃、80～120rpm、44mbar旋蒸至干燥，室温放置，挥发乙醇，得到菌株MTL5-77的乙醇浸提物；
(4)DEAE阴离子交换色谱分离纯化乙醇浸提物
按乙醇浸提物:10～30mM，pH 7.0-9.5的Tris-HCl缓冲液＝3:1～1:1(mg/mL)的比例将乙醇浸提物加入Tris-HCl缓冲液中，在8,000～12,000rpm、3～8℃条件下，离心15～30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物，得活性组分A；
(5)RP-HPLC高效液相色谱分离纯化活性组分A
按活性组分A:水＝3:1～1:1(mg/mL)的比例将活性组分A加入水中，在8,000～12,000rpm、3～8℃条件下，离心15～30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，利用高效液相色谱仪进一步纯化，得活性组分B；
(6)XBP C18柱的二次纯化活性组分B
按照步骤(5)的方法将活性组分B再次过XBP C18柱，进行分离纯化，收集峰型保留时间为5.090min的流动相组分，得活性组分C；
(7)真空冷冻干燥
将活性组分C真空冷冻干燥，得抗肿瘤多肽组合物BMTP。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤多肽组合物的制备方法，其中所述步骤(4)中用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物的色谱条件为：色谱柱为DEAE阴离子交换色谱柱；流速：1.5～10mL/min；进样体积：1.5～10mL；紫外检测波长：254nm；进样缓冲液：10～30mM，pH 7.0～9.5的Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液：将NaCl加入进样缓冲液中，使NaCl的终浓度为1M；
用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物的分离方法为：AKTA快速蛋白纯化仪用进样缓冲液冲洗，并平衡DEAE阴离子交换色谱柱；设置流速为1.5～10mL/min，平衡基线；取1.5～10mL过滤0.22μm滤膜的乙醇浸提物加入到AKTA快速蛋白纯化仪；用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分，再用20～40％的洗脱缓冲液，洗脱挂柱的组分，直接收集DEAE阴离子交换层析图谱中洗脱峰b对应的组分，得活性组分A。
3.如权利要求1所述的抗肿瘤多肽组合物的制备方法，其中所述步骤(5)中RP-HPLC色谱法的色谱条件为：色谱柱：XBP C18；温度：4～25℃；流速：0.4～0.8mL/min；进样量：5～50μL；紫外检测波长：254nm；流动相Ⅰ：乙腈；流动相Ⅱ：纯净水；
RP-HPLC色谱法的分离纯化方法为：对高效液相色谱仪进行清洗、脱气，洗净XBP C18柱；首先用10％的流动相Ⅰ和90％的流动相Ⅱ冲洗，平衡基线；进样体积20μL，流速为0.5mL/min，紫外检测波长λ＝254nm，进行梯度洗脱，收集紫外吸收峰对应的流动相组分；再经过XBP C18柱分离纯化后，收集峰型保留时间为5.010min的流动相组分，得活性组分B。
4.如权利要求3所述的抗肿瘤多肽组合物的制备方法，其中所述RP-HPLC色谱流动相梯度洗脱的程序为：
Figure FDA0002532790820000021
5.一种可用如权利要求1所述的方法制备获得的抗肿瘤多肽组合物。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤多肽组合物在制备预防或者治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌。
7.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌，所述药物包含如权利要求5所述的抗肿瘤多肽组合物。
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