CN105230490A - 一种木薯胚性愈伤组织离体保存培养基 - Google Patents

一种木薯胚性愈伤组织离体保存培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，其配方为：改良GD培养基中添加0.6-0.8mg/L？2,4-D，6-7mg/LTIBA，20-25g/L蔗糖，6.0-6.5g/L脂琼。并置于在13~17℃，光照度1000～1200Lx，光照时间16~18h/d的条件下培养。本发明采用这种培养基对木薯胚性愈伤组织进行离体保存，胚性愈伤增殖量是传统培养基的1.0～1.2倍，细胞活力是传统培养基的2～4倍，继代时间延长至120d时，保存效果最佳。利用本发明方法进行木薯胚性愈伤组织离体保存，为木薯种质资源保存提供基础。

Description

一种木薯胚性愈伤组织离体保存培养基
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及到一种木薯胚性愈伤组织离体保存的方法。
背景技术
木薯(manihotesculentaCrantz)是大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)的灌木状植物，别名南洋薯、木蕃薯和树薯，起源于南美洲，是热带地区最重要的块根食物，是世界三大薯类作物之一，素有“地下粮仓”、“淀粉之王”等之美称，广泛栽培于热带和亚热带地区，在我国广为栽培,木薯的栽培及加工利用在农业生产中占有重要的地位。
中国热带农业科学院热带作物品种资源研究通过对国内木薯种质资源的考察，已经收集了一批国内外的木薯种质资源，成为我国唯一的国家级木薯种质资源圃，同时也建立了木薯种质资源离体保存库。然而，圃地活体的保存易遭受病虫害的侵袭和极端环境的威胁；试管苗保存，长期离体培养需定期继代，且可能会引起遗传变异；低温或超低温离体保存设备成本高、耗能高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种适宜木薯胚性组织离体保存的培养基，其能够最大限度的延长木薯胚性愈伤组织保存时间，同时保持胚性愈伤组织的细胞活力。
本发明的技术方案如下：
一种木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，所述培养基包括：
大量元素：Ca(NO3)2·2H2O210-250mg/L；KCl65-75mg/L；KH2PO4300-400mg/L；
KNO31000-1200mg/L；MgSO417-20mg/L；NH4NO31000-1200mg/L；
微量元素：CaCl2·6H2O0.025-0.050mg/L；CuS04·5H2O0.025-0.050mg/L；FeNaEDTA37-40mg/L；H3BO30.30-0.50mg/L；KI0.80-1.00mg/L；MnSO4·H2O1.00-1.50mg/L；Na2MoO4·2H2O0.025-0.030mg/L；ZnSO4·7H2O0.30-0.50；
生长抑制剂：三碘苯甲酸(TIBA)6-8mg/L；
植物激素：2,4-D0.6-0.8mg/L
其他：蔗糖20-25g/L；脂琼6.0-6.5g/L，pH值5.5～6.0。
作为技术方案的进一步优选，木薯胚性愈伤组织离体保存培养基包括：
大量元素：Ca(NO3)2·2H2O230mg/L；KCl70mg/L；KH2PO4350mg/L；
KNO31100mg/L；MgSO418mg/L；NH4NO31100mg/L；
微量元素：CaCl2·6H2O0.037mg/L；CuS04·5H2O0.037mg/L；FeNaEDTA38.5mg/L；H3BO30.40mg/L；KI0.90mg/L；MnSO4·H2O1.25mg/L；Na2MoO4·2H2O0.027mg/L；ZnSO4·7H2O0.40mg/L；
生长抑制剂：三碘苯甲酸(TIBA)6mg/L-7mg/；
植物激素：2,4-D0.7mg/L；
其他：蔗糖22g/L；脂琼6.5g/L；水；pH值5.8。
本发明的培养基对木薯胚性愈伤组织离体保存条件为在13～17℃培养，光照度1000～1200Lx，光照时间16～18h/d。
三碘苯甲酸(TIBA)是一种植物生长延缓剂，具有很强的抑制细胞生长的生理活性，其主要是通过调节培养基的条件，使愈伤组织细胞吸水困难，减弱新陈代谢活动，延缓愈伤组织的细胞衰老，从而延长继代时间。
本发明的有益效果：本发明通过改良GD培养基中添加一定浓度的生长抑制剂进行木薯胚性愈伤组织离体保存，解决了其他培养基配方不适宜木薯胚性愈伤组织离体保存的问题，使用本发明的培养基可以提高木薯胚性愈伤组织的细胞活力，是对照(不添加生长抑制剂的培养基)的2～4倍，愈伤增殖量是对照(不添加生长抑制剂的培养基)的1.0～1.2倍，继代保存时间延长120d，是一种适宜的木薯愈伤组织中短期保存的方法。利用本发明方法进行木薯胚性愈伤组织离体保存，为木薯种质资源保存提供基础。
采用本发明的培养基对木薯胚性愈伤组织进行离体培养，保持了母体良好的性状，减免了遗传变异的可能。
具体实施例
实施例1
配制改良GD培养基，其中每升该培养基的组分及各组分的含量如下：
1、大量元素：Ca(NO3)2·2H2O230mg/L；KCl70mg/L；KH2PO4350mg/L；
KNO31100mg/L；MgSO418mg/L；NH4NO31100mg/L；
2、微量元素：CaCl2·6H2O0.037mg/L；CuS04·5H2O0.037mg/L；FeNaEDTA38.5mg/L；H3BO30.40mg/L；KI0.90mg/L；MnSO4·H2O1.25mg/L；Na2MoO4·2H2O0.027mg/L；ZnSO4·7H2O0.40mg/L；
3、生长抑制剂：TIBA6mg/L-8mg/；
4、植物激素：2,4-D0.7mg/L；
5、其他：蔗糖22g/L；脂琼6.5g/L；水；pH值5.8
6、培养基配制：按各组分含量分别添加，次序为大量元素→微量元素→植物激素→蔗糖→已经煮沸的琼脂和水的混合物→加水定容→调节pH值5.8→分装至培养皿中并密封好→高压锅灭菌温度121℃21分钟。
7、接种方法：在超净工作台上取已接至培养皿中的颗粒状木薯胚性愈伤组织，将其平均分成6堆共2.0g接至已配制好并经过高压灭菌过的培养基中。接种完毕后放于恒温15℃，光照度1000～1200Lx，光照时间16h/d的光照培养箱中培养。
8、增殖过程：在光照培养箱中培养10d左右，开始出现新的胚性愈伤组织，25d左右达到增殖目的。
9、离体保存试验
9.1试验设计：试验以改良GD培养基为基础培养基，添加生长抑制剂TIBA或2,4-D激素，TIBA浓度分别为TIBA6mg/L、7mg/L、8mg/L，2,4-D浓度为0.7mg/L，以不添加生长抑制剂的GD培养基为CK。共得4种培养基，分别为：
(1)改良GD培养基+2,4-D0.7mg/L+TIBA6mg/L；
(2)改良GD培养基+2,4-D0.7mg/L+TIBA7mg/L；
(3)改良GD培养基+2,4-D0.7mg/L+TIBA8mg/L；
(4)改良GD培养基+2,4-D0.7mg/L(CK)。
接种方法，每个处理为9个培养皿，每皿接种2g，分别于40d、80d、120d后采用TTC法测定细胞活力，并比较不同保存时间的愈伤组织生长量。
9.2实施的结果对比
从对比试验可知，采用添加生长抑制剂三碘苯甲酸(TIBA)的GD培养基可提高木薯胚性愈伤组织存活率，利用木薯胚性愈伤具有自身增殖的特点，采取添加生长抑制剂进行离体保存技术性效果更显著。由表1可以看出，随着保存时间延长，处理组的愈伤生长量比对照组增长较快，细胞活力比对照降低较慢，处理1和处理2表现最佳，保存至120d时细胞活力仍比对照较高，与对照差异明显，使用本发明的培养基木薯胚性愈伤组织较疏松，呈黄绿色，生长良好，保存愈伤增殖量是对照(不添加生长抑制剂的培养基)的1.0～1.2倍，细胞活力是对照(不添加生长抑制剂的培养基)的2～4倍，是一种适宜的木薯愈伤组织中短期保存的方法。
表1不同保存培养基对木薯胚性愈伤组织生长量和细胞活力的比较
实施例2
配置木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，其中每升该培养基的组分及各组分的含量如下：
1、大量元素：Ca(NO3)2·2H2O210mg/L；KCl65mg/L；KH2PO4300mg/L；
KNO31000mg/L；MgSO417mg/L；NH4NO31000mg/L；
2、微量元素：CaCl2·6H2O0.025mg/L；CuS04·5H2O0.025mg/L；FeNaEDTA37.0mg/L；H3BO30.30mg/L；KI0.80mg/L；MnSO4·H2O1.00mg/L；Na2MoO4·2H2O0.025mg/L；ZnSO4·7H2O0.30mg/L；
3、生长抑制剂：TIBA7mg/；
4、植物激素：2,4-D0.7mg/L；
5、其他：蔗糖20g/L；脂琼6.0g/L；水；pH值5.5
培养基配制：按各组分含量分别添加，次序为大量元素→微量元素→植物激素→生长抑制剂→蔗糖→已经煮沸的琼脂和水的混合物→加水定容→调节pH值5.5→分装至培养皿中并密封好→高压锅灭菌温度121℃，21分钟。
将经过增殖的木薯胚性愈伤组织接种上述制备的培养基中，并置于条件为恒温13℃，光照度1000～1200Lx，光照时间17h/d的光照培养箱中培养。
木薯胚性愈伤组织在培养120d后，愈伤组织依然较为疏松，呈现黄绿色，生长量多，生长良好。
实施例3
配置木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，其中每升该培养基的组分及各组分的含量如下：
1、大量元素：Ca(NO3)2·2H2O250mg/L；KCl75mg/L；KH2PO4400mg/L；
KNO31200mg/L；MgSO420mg/L；NH4NO31200mg/L；
2、微量元素：CaCl2·6H2O0.050mg/L；CuS04·5H2O0.050mg/L；FeNaEDTA40.0mg/L；H3BO30.50mg/L；KI1.00mg/L；MnSO4·H2O1.50mg/L；Na2MoO4·2H2O0.030mg/L；ZnSO4·7H2O0.50mg/L；
3、生长抑制剂：TIBA6mg/；
4、植物激素：2,4-D0.7mg/L；
5、其他：蔗糖25g/L；脂琼6.5g/L；水；pH值6.0
培养基配制：按各组分含量分别添加，次序为大量元素→微量元素→植物激素→生长抑制剂→蔗糖→已经煮沸的琼脂和水的混合物→加水定容→调节pH值6.0→分装至培养皿中并密封好→高压锅灭菌温度121℃，21分钟。
将经过增殖的木薯胚性愈伤组织接种上述制备的培养基中，并置于条件为恒温17℃，光照度1000～1200Lx，光照时间18h/d的光照培养箱中培养。
木薯胚性愈伤组织在培养120d后，愈伤组织依然较为疏松，呈现黄绿色，生长量多，生长良好。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，其特征在于：所述培养基包括：
大量元素：Ca(NO3)2·2H2O210-250mg/L；KCl65-75mg/L；KH2PO4300-400mg/L；
KNO31000-1200mg/L；MgSO417-20mg/L；NH4NO31000-1200mg/L；
微量元素：CaCl2·6H2O0.025-0.050mg/L；CuS04·5H2O0.025-0.050mg/L；FeNaEDTA37-40mg/L；H3BO30.30-0.50mg/L；KI0.80-1.00mg/L；MnSO4·H2O1.00-1.50mg/L；Na2MoO4·2H2O0.025-0.030mg/L；ZnSO4·7H2O0.30-0.50；
生长抑制剂：TIBA6-8mg/L；
植物激素：2,4-D0.6-0.8mg/L
其他：蔗糖20-25g/L；脂琼6.0-6.5g/L，pH值5.5-6.0。
2.根据权利要求1所述的木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，其特征在于：所述培养基包括：
大量元素：Ca(NO3)2·2H2O230mg/L；KCl70mg/L；KH2PO4350mg/L；
KNO31100mg/L；MgSO418mg/L；NH4NO31100mg/L；
微量元素：CaCl2·6H2O0.037mg/L；CuS04·5H2O0.037mg/L；FeNaEDTA38.5mg/L；H3BO30.40mg/L；KI0.90mg/L；MnSO4·H2O1.25mg/L；Na2MoO4·2H2O0.027mg/L；ZnSO4·7H2O0.40mg/L；
生长抑制剂：TIBA6mg/L-7mg/；
植物激素：2,4-D0.7mg/L；
其他：蔗糖22g/L；脂琼6.5g/L；水；pH值5.8。
3.根据权利要求1或2所述的木薯胚性愈伤组织离体保存培养基，其特征在于：所述培养基对木薯胚性愈伤组织离体保存条件为在13~17℃培养，光照度1000～1200Lx，光照时间16~18h/d。
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