CN101953307A - 通过植物组织培养生产福建道地金线莲的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过组织培养生产福建道地金线莲的方法，它包括植物体的选择及无菌处理、丛生芽诱导培养和大规模培养三大环节，其技术的关键在于诱导培养和大规模培养两个阶段采用了两种不同的培养基，诱导培养基为：MS培养基+蔗糖10-50g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸0.1-3.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1-5.0mg/L，pH值为5.0-7.0；大规模培养的培养基为：改良MS培养基+硝酸钙600mg/L+香蕉泥30-50g/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸1.0-2.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，pH值为5.0-7.0；植物组织培养能保持植物的优良性状，该方法比较容易操作，生产成本低，适合工厂化育苗，产量高，品质好，不污染环境，可以实现批量生产。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种通过植物组织培养生产，组织培养生产福建道地金线莲的方法。
背景技术
福建道地金线莲(Fujian daodi ShorthairyAntenoron)是兰科，开唇兰属植物，是一种濒危珍惜的药用全草，是我国传统的珍贵药材。其性平味甘，具有清热、凉血、祛风利湿、强心利尿、固肾平肝以及降血压等功效，主治咯血、支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎、小儿急惊风、毒蛇咬伤等。被称为“药中之王”。由于福建道地金线莲的显著的药用功效及保健功能已为世人公认，其商品价格多年来一直不菲。
福建道地金线莲(Fujian daodi ShorthairyAntenoronO)是一种前景可喜的中药免疫增强剂，并具有抗肿瘤、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗诱变等作用，受到国内外学者的高度重视。
由于金线莲属植物的种子不具胚乳，无发芽能力，只有在真菌共生下，才促进种子萌发生长，发芽率很低，而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率很低、生长速度很慢、繁殖率低、加之其对生长条件要求严格、自然条件恶化、野生资源锐减、人为肆意采挖，现已濒临灭绝，致使药源紧缺，国内外市场供不应求。
目前国内外学者开展了对金线莲的初步研究，而通过本地选优的福建道地金线莲的培养主要集中在组培诱导、基本培养基条件的筛选和理化因子的考查等方面。还没有找到一个有效地培养技术用以解决福建道地金线莲诱导和增殖中存在的疑点和难点，从而影响了福建道地金线莲的深入研究应用。
天然的野生金线莲已作为濒临灭绝的植物物种受到保护，严禁采摘。为此研究福建道地金线莲的人工培养技术，实现产业化显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种保持植物体本身优良药效，繁殖速度快，增殖倍数高的的通过植物组织培养生产福建道地金线莲的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种通过组织培养生产福建道地金线莲的方法，它包括如下步骤：
1.1植物体的选择及无菌处理：
选择6-8月份生长的野生福建道地金线莲植物体，除去根和叶进行清洗和无菌处理，将茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的福建道地金线莲小段组织；
1.2丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的福建道地金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：10-60天，培养温度：10-35℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：100～2000lux lx；所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖10-50g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸0.1-3.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0；
1.3大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10-60天，培养温度：10-35℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：1000～2000lux；所述的大规模培养基为：改良MS培养基+硝酸钙600mg/L+香蕉泥30-50g/L+蔗糖10-50g/L/L+琼脂6-8g/L+活性炭0.1-5.0g/L+萘乙酸0.1-3.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
作为本发明通过组织培养生产福建道地金线莲的方法更优化的技术方案，对培养基的配方比例和培养条件进行优化选择。
所述的丛生芽诱导培养：培养周期：20-50天，培养温度：20-30℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：1500～2000lux；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖20-40g/L/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸1.0-2.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，PH值为5.5-6.5；
所述的大规模培养：培养周期：20-50天，培养温度：20-30℃，光照培养时间：8-16小时/天，光照强度：1500～2000lux；所述的大规模培养基为：改良MS培养基+硝酸钙600mg/L+香蕉泥30-50g/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸1.0-2.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，PH值为5.5-6.5。
植物体的无菌处理是本发明的重要技术环节，无菌处理的方法包括如下步骤：
A、将选取的福建道地金线莲植株，用自来水冲洗2-3小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内。
B、将除去了根和叶的茎段植物体用70-80％的酒精浸泡20-40秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净
C、将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3-0.8％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-6分钟，用无菌水冲洗4-5次，再转入0.15％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D、无菌条件下将次氯酸钠消毒的茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的小段。
本发明的优点在于：通过植物组织培养，保持植物体的优良性状，保持植物优良的药物疗效，该方法易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现工厂化育苗。选用配方合理的诱导培养基，诱导出的丛生芽比例达到98％以上，通过两段培养的方式再生植株产量大幅度提高，和增殖倍数达到8倍以上。通过本发明方法生产福建道地金线莲，不变异，产量高，成本低，周期短，极具市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：一种通过组织培养生产福建道地金线莲的方法，他包括如下步骤：
A.植物体的选择及无菌处理：
A)选择8月份生长的野生福建道地金线莲植株，用自来水冲洗2-3小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置操净工作台内；
B)将除去了根和叶的茎段植物体用75％的酒精浸泡30秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
C)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗5次，再转入0.15％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D)无菌条件下将消毒的茎段剪成1CM左右带茎节的福建道地金线莲小段；
B.丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的福建道地金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：30天，培养温度：28℃，光照培养时间：24小时/天，光照强度：2000lux；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖45g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0g/L+萘乙酸2.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L，PH值为5.0
C.大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：45天，培养温度：28℃，光照培养时间：24小时/天，光照强度：1500lux所述的大规模培养基为：改良MS培养基+硝酸钙600mg/L+香蕉泥30-50g/L+蔗糖15g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0g/L+萘乙酸1.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L，PH值为5.0
实施例2：一种通过组织培养生产福建道地金线莲的方法，它包括如下步骤：
A.植物体的选择及无菌处理：
A)选择10月份生长的野生福建道地金线莲植株，用自来水冲2-3小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置操净工作台内；
B)将除去了根和叶的茎段植物体用75％的酒精浸泡25秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
C)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3％次氯酸钠溶液浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗4次，再转入0.15％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D)无菌条件下将消毒的茎段剪成1CM左右带茎节的福建道地金线莲小段；
B.丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的福建道地金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：40天，培养温度：25℃，光照培养时间：15小时/天，光照强度1500lux；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖35g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0g/L+萘乙酸1.8mg/L+6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L，PH值为6.0
C.大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：60天，培养温度：25℃，光照培养时间：16小时/天，光照强度：1500lux所述的大规模培养基为：改良MS培养基+硝酸钙600mg/L+香蕉泥30-50g/L+蔗糖35g/L+琼脂6-8g/L+活性炭3.0g/L+萘乙酸2.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L，PH值为6.0
实施例3：采用MS培养基、改良MS培养基分别对经过无菌处理后的福建道地金线莲小段组织进行诱导丛生芽的培养试验，本实验重复三次，培养条件和实施例2相同，试验调查其金线莲的分化数、组织鲜重、分化率、生长势。试验结果如下：
不同培养基和不同浓度激数对丛生芽的试验比较：
注：+示颜色发黄，++示颜色略黄，+++示较好，++++示很好苗绿。
试验结果证明，本发明采用两种不同基本培养基和添加不同浓度的生长素进行的诱导培养基对无菌处理后的福建道地金线莲小段进行培养，通过三因素二水平方差分析认为：NAA对金线莲的腋芽诱导极显著6-BA×NAA的交付作用对腋芽的诱导存在显著性差异。6-BA的3个浓度水平中腋芽的诱导率较高，当6-BA浓度达到3.0时，NAA浓度的浓度达到1.0时，有利于腋芽的诱导，MS培养基苗的生长势较差，大部分苗的叶片发黄。在处理号5号的试验中金线莲腋芽的诱导有较好的效果。各处理诱导所得的芽在培养前30天仅见单芽，45天之后有丛芽出现。我们还发现，在改良的MS中硝酸钙钙和天然添加物香蕉泥对金线莲腋芽有促进生长的作用。最好增殖率达到8.37倍。组织鲜重达到68.2g，生长势良好，叶片舒展苗绿。
实施例4：采用福建道地金线莲生根诱导，不同激数组合影响根的诱导和生根率。把福建道地金线莲继代苗接种于不同激素组合的1/2MS固体培养基，培养基中均添加NAA、IBA、活性碳(AC)固定添加香蕉泥30g/L，培养条件跟实施例2相同；采用4因素3水平的正交设计L9(34)(见表2)，共9个处理，每处理接种20瓶，每瓶接10根苗，每处理重复3次，调查统计每瓶生根数、生根率。
表2不同生长素对生根的影响
结果分析：采用1/2MS分别附加NAA(0、2.0、4.0)、IBA(1.0、2.0、3.0)和AC(0.5、1.0、1.5)进行生根培养，选取无根苗转入生根培养基中培养。30天后统计生根情况，结果见表2。结果表明：各处理都能诱导福建道地金线莲小苗生根，但生根率有显著差异。在添加高浓度的NAA，并附加高浓度的AC时，诱导生根的效果均好于不加生长调节剂或加入浓度较低时的生根率，说明高浓度的生长调节剂较易诱导金线莲生根，而低浓度的生长调节剂对金线莲植株生根不好。从表2可看出，平均生根率最高，达98.2％，平均生根量达4.8条。因此，处理9，即1/2MS+NAA4.0mg/L+IBA1.0mg/L+AC1.0mg/L+香蕉泥为最佳的生根培养基。
生根苗移植到炼苗大棚炼苗，20天后开始种植。
Claims (3)
1.一种通过植物组织培养生产福建道地金线莲的方法，它包括如下步骤：
1.1植物体的选择及无菌处理：
选择5-10月份生长的福建道地金线莲野生健壮植物，除去根和叶进行清洗和无菌处理，将茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的福建道地金线莲小段组织；
1.2诱导培养：
将经过无菌处理后的福建道地金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：10-60天，培养温度：10-35℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：0～2000lux；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖10-50g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸0.1-3.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0；
1.3大规模培养：
将诱导的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10-60天，培养温度：10-35℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：0～2000lux；所述的诱导培养基为：改良MS培养基+硝酸钙600mg/L+香蕉泥30-50g/L+蔗糖10-50g/L/L+琼脂6-8g/L+活性炭0.1-5.0g/L+萘乙酸1.0-2.0mg+6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg，PH值为5.5-6.5。
2.按照权利要求1所述的通过植物组织培养生产福建道地金线莲的方法，其特征在于：所述的丛生芽诱导培养：培养周期：20-50天，培养温度：20-30℃，光照培养时间：8-16小时/天，光照强度：100～2000lux；所述的诱导培养基为：MS基本培养基+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸1.0-2.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，PH值为5.5-6.5；所述的大规模培养：培养周期：20-50天，培养温度：20-30℃，光照培养时间：8-16小时/天，光照强度：1000～2000lux；所述的大规模培养基为：改良MS培养基+蔗糖20-40g/L琼脂6-8g/L+活性炭2.0-3.0g/L+萘乙酸1.0-2.mg/L+6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg/L，PH值为5.5-6.5。
3.按照权利要求1或2所述的通过植物组织培养生产福建道地金线莲的方法，其特征在于植物体的无菌处理方法包括如下步骤：
A、将选取的福建道地金线莲野生材料植株，用自来水冲洗2-3小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；
B、将除去了根和叶的茎段植物用70-80％的酒精浸泡20-40秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
C、将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3-0.8％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-6分钟，用无菌水冲洗4-5次，再转入0.15％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D、无菌条件下将消毒好的茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的小段。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 361101 Fujian Province, Xiamen city Xiangan District Haixiang Boulevard Hai Ming Road No. 506-508 Applicant after: Fujian Jincao Biological Group Co.,Ltd. Address before: 361008, unit 289, 211 Weng Weng Road, Xin Yang Street, Haicang District, Fujian, Xiamen Applicant before: Fujian Jincao Biotechnology Co., Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: FUJIAN JINCAO BIOTECHNOLOGY CO., LTD. TO: FUJIAN JINCAO BIOLOGY GROUP CO., LTD. |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110126 |