CN102907327A

CN102907327A - 一种金线莲的组培繁殖方法

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Publication number: CN102907327A
Application number: CN2012104425938A
Authority: CN
Inventors: 方金镇; 郑志红; 方加强
Original assignee: XIAMEN JIASHENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: XIAMEN JIASHENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: CN102907327B

Abstract

一种金线莲的组培繁殖方法，涉及植物组织培养方法。提供能够快速促进金线莲茎段的快速繁殖并生长的一种金线莲的组培繁殖方法。取金线莲的茎段作为外植体材料，将外植体消毒；茎段不定芽的诱导；组培苗的培育；组培苗移栽。选用不含顶芽和长根的中间茎段作为培养对象，成活率高，不定芽增殖率高。在培养基中加入香蕉对促进幼苗生长非常有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量高。经过组培试验，增殖率可达5.7倍。

Description

一种金线莲的组培繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养方法，尤其是涉及一种金线莲的组培快速繁殖方法。

背景技术

由于金线莲具备显著的药用功效，具有清热、凉血、降血压、抗菌、抗癌等功效，因此金线莲的药用价值已被世人所认可，并被广泛地使用。但是金线莲在自然条件下繁殖率低、生长速度很慢，加之自然条件的恶化和人类行为破坏，已导致其濒临灭绝，致使金线莲供不应求。

为满足市场的需求，金线莲的人工繁殖及培养技术被大量研究及应用。在种子繁殖、扦插繁殖和组培繁殖中，组培繁殖是最适合金线莲人工培育的繁殖方法，组培繁殖技术是实现金线莲规模化、产业化培育和生产的最优技术。

中国专利CN102090341A公开一种金线莲的快繁方法，包括种苗消毒、芽诱导、芽增殖、幼苗培养、根诱导、试管苗移栽，所述芽增殖的培养基为：去除肌醇的MS+ZnSO4·7H2O6mg/L+KH2PO4180mg/L+6-BA4mg/L+NAA1mg/L+2%蔗糖。

中国专利CN102100171A公开一种金线莲水培方法，该方法将金线莲种苗清洗消毒后，移植到培养盘中，置于装有水培营养液的培养槽内培育，每10L水培营养液中含有：四水硝酸钙650~800mg，硝酸铵50~60mg，硝酸钾280~350mg，磷酸二氢钾100~130mg，硫酸镁350~380mg，碘化钾0.5~0.8mg，硫酸锰2~5mg，钼酸钠0.2~0.3mg，氯化钴0.1~0.2mg，硼酸2~4mg，硫酸锌0.5~1mg，硫酸铜0.3~0.5mg，铁盐溶液3~5ml；铁盐溶液是由水、七水硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠配制而成。

发明内容

本发明的目的在于提供能够快速促进金线莲茎段的快速繁殖并生长的一种金线莲的组培繁殖方法。

本发明包括以下步骤：

1）取金线莲的茎段作为外植体材料，将外植体消毒；

2）茎段不定芽的诱导；

3）组培苗的培育；

4）组培苗移栽。

在步骤1）中，所述金线莲最好选用野生金线莲；所述外植体为除去金线莲叶片后的野生金线莲茎段；所述外植体消毒的具体方法可为：

（1）将外植体置于流动水中冲洗；所述冲洗的时间可为1～3h。

（2）对冲洗后的外植体浸润灭菌；所述灭菌可在水平超净工作台内完成，外植体放置于已消毒的容器中并用酒精浸泡，所述浸泡的时间可为10～30s。

（3）将步骤（2）浸润灭菌后的外植体放入HgCl溶液灭菌，所述HgCl溶液的质量分数可为0.1%，所述灭菌的时间可为5～20min。

（4）将步骤（3）处理后的外植体用无菌水进行涮洗，所述涮洗的条件可为涮洗5～10次，每次涮洗的时间可为1～5min。

在步骤2）中，所述茎段不定芽的诱导方法可为：将已消毒的外植体茎段切成3段，分别接种于MS培养基上，茎段不定芽诱导后，转接到增殖培养基，培养后得到组培苗；

所述切成3段可切成上段、中段和下段，所述上段切除茎尖，所述上段、中段和下段的长度可分别为0.5～1.0cm，所述上段、中段和下段最好每段均带有1～2个节间；所述培养的时间可为2～4个月；所述增殖培养基的组分为：MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.1～0.5mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.1～0.5mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.1～0.5mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.1～0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)0.3～0.5g/L+香蕉50～80g/L+活性碳0.5～1.5g/L+蔗糖25～40g/L+琼脂6.5～8g/L；增殖培养基的pH可为：5.8～6。

在步骤3）中，所述组培苗的培育方法可为：将组培苗接种于生根培养基上，经过培育得到生根组培金线莲苗，培育的环境条件为：温度(24±2）℃，光照时间11h/d，光照强度900～2000lux，培育时间为2～3个月；所述生根培养基的组分为：1/2MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.1～0.5mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.1～0.5mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.1～0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)0.3~0.5g/L+香蕉100～120g/L+活性碳1～1.5g/L+蔗糖15～30g/L+琼脂6.5～8g/L；生根培养基的pH可为：5.8～6。

在步骤4）中，所述组培苗移栽方法可为：将生根组培金线莲苗移栽大棚，大棚的基质按质量比的原料组成为：泥炭土∶菜园土∶蛭石=2∶1∶1。

本发明提供了一套金线莲的组培快速繁殖的方法，其优点在于：

1．本发明选用不含顶芽和长根的中间茎段作为培养对象，成活率高，不定芽增殖率高。

2．在培养基中加入香蕉对于促进幼苗生长非常有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量高。

3．经过组培试验，增殖率可达5.7倍。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

选取除去金线莲叶片后的野生金线莲茎段作为外植体，本实施例通过以下四步进行组培。

1）取野生金线莲的茎段作为外植体材料，将外植体进行消毒。

2）茎段不定芽的诱导。

3）组培苗的培育。

4）组培苗移栽。

在外植体消毒过程需要准备的器材及物品：已消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、0.1%的HgCl溶液、无菌水、秒表等。具体的消毒过程为：

第一步，将外植体置于流动的自来水中冲洗约2h；

第二步，对冲洗后的外植体浸润灭菌。灭菌过程在水平超净工作台内完成，外植体放置于已消毒的烧杯中并用70%酒精浸泡10～30s。

第三步，灭菌剂处理。将经过第二步处理后的外植体放入0.1%的HgCl溶液灭菌约10min。

第四步，无菌水涮洗。对经过第三步处理后的外植体用无菌水进行涮洗，涮洗8次，每次3min。

茎段不定芽的诱导过程为：将消毒好的外植体（茎段）按上段（切除茎尖）、中段和下段切成长约（0.5～1.0）cm、并带有1～2个节间的小段，分别接种于MS培养基上。茎段不定芽诱导后，转接到增殖培养基，3个月后得到组培苗。

组培苗的培育过程为：将组培苗接种于生根培养基上，经过培育得到生根组培金线莲苗。本过程培育的环境条件为：温度(24±2）℃，光照时间11h/d，光照强度900～2000lux。培育时间为2～3个月。

组培苗移栽过程为：将生根组培金线莲苗移栽大棚，大棚的基质原料及比例为：泥炭土∶菜园土∶蛭石=2∶1∶1。

所述增殖培养基的组分及配比见表1。

表1增殖培养基的组分

所述生根培养基的组分及配比见表2。

表2生根培养基的组分

组培后，经统计，茎段成活率约为99%，茎段诱导的金线莲的增殖率约为5.7倍。

实施例2：

1）取金线莲的茎段作为外植体材料，将外植体消毒；所述金线莲最好选用野生金线莲；所述外植体为除去金线莲叶片后的野生金线莲茎段；所述外植体消毒的具体方法可为：

（1）将外植体置于流动水中冲洗；所述冲洗的时间可为1h。

（2）对冲洗后的外植体浸润灭菌；所述灭菌可在水平超净工作台内完成，外植体放置于已消毒的容器中并用酒精浸泡，所述浸泡的时间可为20s。

（3）将步骤（2）浸润灭菌后的外植体放入HgCl溶液灭菌，所述HgCl溶液的质量分数可为0.1%，所述灭菌的时间可为10min。

（4）将步骤（3）处理后的外植体用无菌水进行涮洗，所述涮洗的条件可为涮洗8次，每次涮洗的时间可为1min。

2）茎段不定芽的诱导；所述茎段不定芽的诱导方法可为：将已消毒的外植体茎段切成3段，分别接种于MS培养基上，茎段不定芽诱导后，转接到增殖培养基，培养后得到组培苗；所述切成3段可切成上段、中段和下段，所述上段切除茎尖，所述上段、中段和下段的长度可分别为0.8cm，所述上段、中段和下段最好每段均带有1个节间；所述培养的时间可为3个月；所述增殖培养基的组分为：MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.3mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.3mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.1mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L+水解酪蛋白(CH)0.3g/L+香蕉60g/L+活性碳1g/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L；增殖培养基的pH可为：5.9。

3）组培苗的培育；所述组培苗的培育方法可为：将组培苗接种于生根培养基上，经过培育得到生根组培金线莲苗，培育的环境条件为：温度26℃，光照时间11h/d，光照强度1500lux，培育时间为2.5个月；所述生根培养基的组分为：1/2MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.3mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.1mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.1mg/L+水解酪蛋白(CH)0.4g/L+香蕉100g/L+活性碳1.2g/L+蔗糖15g/L+琼脂6.5g/L；生根培养基的pH可为：5.8。

4）组培苗移栽，所述组培苗移栽方法可为：将生根组培金线莲苗移栽大棚，大棚的基质按质量比的原料组成为：泥炭土∶菜园土∶蛭石=2∶1∶1。

实施例3：

（1）将外植体置于流动水中冲洗；所述冲洗的时间可为2h。

（2）对冲洗后的外植体浸润灭菌；所述灭菌可在水平超净工作台内完成，外植体放置于已消毒的容器中并用酒精浸泡，所述浸泡的时间可为10s。

（3）将步骤（2）浸润灭菌后的外植体放入HgCl溶液灭菌，所述HgCl溶液的质量分数可为0.1%，所述灭菌的时间可为20min。

（4）将步骤（3）处理后的外植体用无菌水进行涮洗，所述涮洗的条件可为涮洗5次，每次涮洗的时间可为5min。

2）茎段不定芽的诱导；所述茎段不定芽的诱导方法可为：将已消毒的外植体茎段切成3段，分别接种于MS培养基上，茎段不定芽诱导后，转接到增殖培养基，培养后得到组培苗；所述切成3段可切成上段、中段和下段，所述上段切除茎尖，所述上段、中段和下段的长度可分别为0.5cm，所述上段、中段和下段最好每段均带有2个节间；所述培养的时间可为2个月；所述增殖培养基的组分为：MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.1mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.1mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.5mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.3mg/L+水解酪蛋白(CH)0.5g/L+香蕉50g/L+活性碳0.5g/L+蔗糖40g/L+琼脂6.5g/L；增殖培养基的pH可为：5.8。

3）组培苗的培育；所述组培苗的培育方法可为：将组培苗接种于生根培养基上，经过培育得到生根组培金线莲苗，培育的环境条件为：温度24℃，光照时间11h/d，光照强度900lux，培育时间为2个月；所述生根培养基的组分为：1/2MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.1mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.5mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.3mg/L+水解酪蛋白(CH)0.3g/L+香蕉120g/L+活性碳1g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L；生根培养基的pH可为：6。

实施例4：

（1）将外植体置于流动水中冲洗；所述冲洗的时间可为3h。

（2）对冲洗后的外植体浸润灭菌；所述灭菌可在水平超净工作台内完成，外植体放置于已消毒的容器中并用酒精浸泡，所述浸泡的时间可为30s。

（3）将步骤（2）浸润灭菌后的外植体放入HgCl溶液灭菌，所述HgCl溶液的质量分数可为0.1%，所述灭菌的时间可为5min。

（4）将步骤（3）处理后的外植体用无菌水进行涮洗，所述涮洗的条件可为涮洗10次，每次涮洗的时间可为3min。

2）茎段不定芽的诱导；所述茎段不定芽的诱导方法可为：将已消毒的外植体茎段切成3段，分别接种于MS培养基上，茎段不定芽诱导后，转接到增殖培养基，培养后得到组培苗；所述切成3段可切成上段、中段和下段，所述上段切除茎尖，所述上段、中段和下段的长度可分别为1.0cm，所述上段、中段和下段最好每段均带有2个节间；所述培养的时间可为4个月；所述增殖培养基的组分为：MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.5mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.5mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.3mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)0.4g/L+香蕉80g/L+活性碳1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L；增殖培养基的pH可为：6。

3）组培苗的培育；所述组培苗的培育方法可为：将组培苗接种于生根培养基上，经过培育得到生根组培金线莲苗，培育的环境条件为：温度22℃，光照时间11h/d，光照强度2000lux，培育时间为3个月；所述生根培养基的组分为：1/2MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.5mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.3mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)0.5g/L+香蕉110g/L+活性碳1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L；生根培养基的pH可为：5.9。

Claims

1.一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取金线莲的茎段作为外植体材料，将外植体消毒；

2）茎段不定芽的诱导；

3）组培苗的培育；

4）组培苗移栽。

2.如权利要求1所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤1）中，所述金线莲选用野生金线莲。

3.如权利要求1所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤1）中，所述外植体为除去金线莲叶片后的野生金线莲茎段。

4.如权利要求1所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤1）中，所述外植体消毒的具体方法为：

（1）将外植体置于流动水中冲洗；

（2）对冲洗后的外植体浸润灭菌；

（3）将步骤（2）浸润灭菌后的外植体放入HgCl溶液灭菌；

（4）将步骤（3）处理后的外植体用无菌水进行涮洗。

5.如权利要求4所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤（1）中，所述冲洗的时间为1～3h；在步骤（2）中，所述灭菌在水平超净工作台内完成，外植体放置于已消毒的容器中并用酒精浸泡，所述浸泡的时间为10～30s；在步骤（3）中，所述HgCl溶液的质量分数为0.1%，所述灭菌的时间为5～20min；在步骤（4）中，所述涮洗的条件为涮洗5～10次，每次涮洗的时间为1～5min。

6.如权利要求1所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤2）中，所述茎段不定芽的诱导方法为：将已消毒的外植体茎段切成3段，分别接种于MS培养基上，茎段不定芽诱导后，转接到增殖培养基，培养后得到组培苗。

7.如权利要求6所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于所述切成3段是切成上段、中段和下段，所述上段切除茎尖，所述上段、中段和下段的长度可分别为0.5～1.0cm，所述上段、中段和下段最好每段均带有1～2个节间；所述培养的时间可为2～4个月。

8.如权利要求6所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于所述增殖培养基的组分为：MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.1～0.5mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.1～0.5mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.1～0.5mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.1～0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)0.3～0.5g/L+香蕉50～80g/L+活性碳0.5～1.5g/L+蔗糖25～40g/L+琼脂6.5～8g/L；增殖培养基的pH可为：5.8～6。

9.如权利要求1所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤3）中，所述组培苗的培育方法为：将组培苗接种于生根培养基上，经过培育得到生根组培金线莲苗，培育的环境条件为：温度24±2℃，光照时间11h/d，光照强度900～2000lux，培育时间为2～3个月；所述生根培养基的组分为：1/2MS培养基+细胞分裂素（6-苄氨基腺嘌呤,6-BA）0.1～0.5mg/L+激动素（6-糖基氨基嘌呤,KT）0.1～0.5mg/L+生长素（a-萘乙酸,NAA）0.1～0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)0.3～0.5g/L+香蕉100～120g/L+活性碳1～1.5g/L+蔗糖15～30g/L+琼脂6.5～8g/L；生根培养基的pH可为：5.8～6。

10.如权利要求1所述的一种金线莲的组培繁殖方法，其特征在于在步骤4）中，所述组培苗移栽方法为：将生根组培金线莲苗移栽大棚，大棚的基质按质量比的原料组成为：泥炭土∶菜园土∶蛭石=2∶1∶1。