CN114403004A - 一种人参愈伤组织诱导方法及提取物在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参愈伤组织诱导方法，其中，包含以下步骤：获取人参苗组织及消毒；将消毒处理的人参苗组织接种到人参愈伤组织诱导培养基中，诱导人参愈伤组织，其中，所述人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为2.2‑6.6g/L的MS培养基、浓度为15‑50g/L的蔗糖、浓度为6‑8g/L的琼脂、浓度为0.1‑5mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸、浓度为0.05‑0.5mg/L的噻苯隆，减少人参根消毒过程中出现的染菌问题并充分利用人参苗的营养价值，使用人参苗进行人参愈伤组织的诱导，确认了人参愈伤组织诱导培养基条件及制备了人参愈伤组织提取物，进一步评估了人参愈伤组织提取物在化妆品领域中作为伤口愈合原料的应用性。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种人参愈伤组织诱导方法及提取物在化妆品中的应用。
背景技术
人参(Panax ginseng)属于三七属、马齿苋科，由于其卓越的药理作用，在东亚地区曾被作为一种草药植物广泛使用，其使用历史为已2000多年，人参在许多药典中扮演了重要的角色，该生理活性功效主要有新陈代谢调节作用、血压调节作用、免疫功能调节作用、抗肿瘤、抗氧化以及抗衰老作用等。
然而，人参在育种过程当中对于温度、光度以及湿度等环境条件需要精确的调节，并且为了得到一定大小的人参需要较长的时间周期，利用植物组织培养技术的人参培养可采取少量组织而能培养成大量的组织，并可以在短期内获得大量营养苗，不会被天气或季节等难控因素的限制。并且在培养过程当中保持无菌状态而不需要农药的处理，同时还可以稳定地保持母体组织的营养成分，符合环境保护的理念并具有减少劳动力等经济价值。
人参由根部、茎部、叶部和浆果构成，其中人参苗的茎和人参苗的叶含有着丰富的皂苷、β-谷甾醇和胡萝卜苷等营养成分，具有充分的应用价值，但现有的人参愈伤组织诱导方法中大多数是采取人参根部进行人参愈伤组织的诱导，这是未充分利用人参苗的营养价值。而且，人参根组织由于表面具有很多螺纹和泥沙，在表面消毒阶段中不仅难以清洗，还具有较高的染菌率。反而，若为了提高消毒效率使用高浓度消毒液则会导致植物组织的过度损伤，造成植物组织的枯死。因此，能够有效率地减少人参组织培养过程中发生的染菌问题是在人参组织培养技术中亟待解决的问题。
皮肤伤口愈合是在皮肤中一个重要的生理作用，包括集体动态的平衡、炎症、细胞的增殖、细胞的迁移以及组织的恢复。人皮肤角质形成细胞(Human adult low calcium,high temperature,HaCaT)是构成皮肤表皮层的主要细胞，具有表皮的构成、创伤修复、细胞焦化、细胞因子分泌和免疫监视等功能。在伤口愈合的早期阶短，表皮中角化形成细胞被激活，并迁移到创伤部位诱导伤口的收缩，接着进行细胞的增殖以及皮肤修复的重建。因此，人皮肤角质形成细胞的增殖及迁移的促进是在伤口愈合过程中会缩短皮肤伤口修复的时间。皮肤伤口愈合过程当中为了促进细胞以及组织的重建，新血管的形成也是不可少的过程，新血管形成是由人类脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)而成，新生血管不仅供给修复细胞营养，还提供各种调控因子。因此，新血管形成能力可以促进皮肤创伤修复作用。
本发明中，为了评估人参愈伤组织提取物的皮肤伤口愈合功效，对人参愈伤组织提取物进行人皮肤角质形成细胞划痕实验以及人类脐静脉内皮细胞新血管形成实验而开阔人参愈伤组织作为具有伤口愈合功效的化妆品原料方面的应用性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是由于人参根组织由于表面具有很多螺纹和泥沙，在表面消毒阶段中不仅难以清洗，还具有较高的染菌率，反而，若为了提高消毒效率使用高浓度消毒液则会导致植物组织的过度损伤，造成植物组织的枯死等问题，本发明提供一种人参愈伤组织诱导方法，减少现有的以人参根部来进行人参愈伤组织诱导方法中组织感染问题并充分利用人参苗茎和叶组织的营养价值，使用人参苗中的茎或叶组织进行人参愈伤组织的诱导，确认了该人参愈伤组织诱导培养基条件，对获得的人参愈伤组织组织进行人参愈伤组织提取物的制备，同时，基于人参的丰富的生物活性成分，进一步评估了人参愈伤组织提取物在化妆品领域中作为具有伤口愈合功效原料的应用性，用以解决现有技术导致的缺陷。
为解决上述技术问题本发明提供以下的技术方案：
一种人参愈伤组织诱导方法，其中，包含以下步骤：
获取人参苗组织，将所述人参苗组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于5-15％漂白剂后在70-130rpm的转速下震荡5-25min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次，进行消毒；
将消毒后的人参苗组织切成组织段后接种到人参愈伤组织诱导培养基中，诱导人参愈伤组织，其中，所述人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基、浓度为15-50g/L的蔗糖、浓度为6-8g/L的琼脂、浓度为0.1-5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05-0.5mg/L的噻苯隆。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，所述组织段的长度为0.5-1cm，将所述组织段接种到所述人参愈伤组织诱导培养基后在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出所述人参愈伤组织；
所述人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂、浓度为1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.2mg/L的噻苯隆。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，所述人参愈伤组织诱导培养基的pH值范围为5.6-5.9。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，2.2-6.6g/L的MS培养基可选取浓度为6.075-24.3g/L的SH培养基或浓度为1.605-4.815g/L的B5培养基替代；
所述诱导培养基还包含浓度为0.5-3.5mg/L吲哚丁酸或浓度为0.01-2mg/L的6-苄氨基嘌呤或浓度为0.1-1.5mg/L的1-萘乙酸或浓度为0.1-1mg/L的吲哚-3-乙酸或浓度为0.1-3mg/L的6-糠氨基嘌呤或浓度为1-2mg/L的4-氯苯氧乙酸中一种或几种。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，还包含对所述人参愈伤组织进行继代培养，具体过程如下：
将所述人参愈伤组织用灭菌刀切割成30-150mm×30-150mm的组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，所述固体增殖培养包含浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基、浓度为15-50g/L的蔗糖、浓度为6-8g/L的琼脂、浓度为0.1-5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05-0.5mg/L的噻苯隆，液体培养包含浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基、浓度为15-50g/L的蔗糖、浓度为0.1-5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05-0.5mg/L的噻苯隆。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，将接种量为50-100g/L的所述人参愈伤组织加入至所述液体培养基中在70-100rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，还包含对继代培养的所述人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取，具体包含以下步骤：
将所述人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过60-100目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将所述人参愈伤组织组织粉末与70％-80％的乙醇按照料液比为1:10-100混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到所述人参愈伤组织提取物。
上述的一种人参愈伤组织诱导方法，其中，优选过80目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
所述人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:20混合。
上述的人参愈伤组织提取物在化妆品中的应用。
依据上述本发明一种人参愈伤组织诱导方法提供的技术方案具有以下技术效果：
能够减少现有的以人参根部来进行人参愈伤组织诱导方法中组织感染问题并充分利用人参苗茎和叶组织的营养价值，使用人参苗中的茎或叶组织进行人参愈伤组织的诱导，并确认了该人参愈伤组织诱导培养基条件，对获得的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物制备，同时，基于人参的丰富的生物活性成分，进一步评估了人参愈伤组织提取物在化妆品领域中作为具有伤口愈合功效原料的应用性。
附图说明
图1为本发明中诱导的人参愈伤组织图；
图2为角质形成细胞细胞毒性结果图；
图3为人脐静脉内皮细胞毒性结果图；
图4为角质形成细胞划痕实验观察图；
图5为角质形成细胞划痕实验伤口愈合率结果图；
图6为人脐静脉内皮细胞新血管形成结果图；
图7为人脐静脉内皮细胞新血管形成观察图。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1，获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于5％漂白剂后在70rpm的速度震荡5min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切割成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出人参愈伤组织，其中，人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为2.2g/L的MS培养基、浓度为15g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为0.1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05mg/L的噻苯隆；
对人参愈伤组织进行继代培养：
将人参愈伤组织用灭菌刀切成30-150mm×30-150mm的组织段，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，固体增殖培养包含浓度为2.2g/L的MS培养基、浓度为15g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为0.1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05mg/L的噻苯隆，液体培养包含浓度为2.2g/L的MS培养基、浓度为15g/L的蔗糖、浓度为0.1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05mg/L的噻苯隆；
将接种量为50g/L的人参愈伤组织加入至液体培养基中在70rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周；
对继代培养的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取：
将人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过60目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:10混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到人参愈伤组织提取物。
实施例2，获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于10％漂白剂后在100rpm的速度震荡15min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切割成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出人参愈伤组织，其中，人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为20g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂、浓度为1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.2mg/L的噻苯隆；
对人参愈伤组织进行继代培养：
将人参愈伤组织用灭菌刀切成30-150mm×30-150mm的组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，固体增殖培养包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为20g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂、浓度为1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.2mg/L的噻苯隆，液体培养包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为20g/L的蔗糖、浓度为1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.2mg/L的噻苯隆；
将接种量为80g/L的人参愈伤组织加入至液体培养基中在85rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周；
对继代培养的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取：
将人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过80目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将人参愈伤组织组织粉末与75％的乙醇按照料液比为1:55混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到人参愈伤组织提取物。
实施例3，获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于15％漂白剂后在130rpm的速度震荡25min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出人参愈伤组织，其中，人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为6.6g/L的MS培养基浓度为50g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆；
对人参愈伤组织进行继代培养：
将人参愈伤组织用灭菌刀切成30-150mm×30-150mm的组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，固体增殖培养包含浓度为6.6g/L的MS培养基、浓度为50g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆，液体培养包含浓度为6.6g/L的MS培养基、浓度为50g/L的蔗糖、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆；
将接种量为100g/L的人参愈伤组织加入至液体培养基中在100rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周；
对继代培养的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取：
将人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过100目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将人参愈伤组织组织粉末与80％的乙醇按照料液比为1:100混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到人参愈伤组织提取物。
实施例4，获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于15％漂白剂后在130rpm的速度震荡25min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出人参愈伤组织，其中，人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为4.815g/L的B5培养基、浓度为40g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆；
对人参愈伤组织进行继代培养：
将人参愈伤组织用灭菌刀切成30-150mm×30-150mm的组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，固体增殖培养包含浓度为2.2g/L的MS培养基、浓度为40g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆，液体培养包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为40g/L的蔗糖、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆；
将接种量为100g/L的人参愈伤组织加入至液体培养基中在100rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周；
对继代培养的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取：
将人参愈伤组织用蒸馏水洗涤2次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过100目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:100混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到人参愈伤组织提取物。
实施例5，获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于15％漂白剂后在130rpm的速度震荡25min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出人参愈伤组织，其中，人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为12.15g/L的SH培养基、浓度为35g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆；
对人参愈伤组织进行继代培养：
将人参愈伤组织用灭菌刀切成30-150mm×30-150mm的组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，固体增殖培养包含浓度为12.15g/L的SH培养基、浓度为35g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆，液体培养包含浓度为12.15g/L的SH培养基、浓度为35g/L的蔗糖、浓度为5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.5mg/L的噻苯隆；
将接种量为100g/L的人参愈伤组织加入至液体培养基中在100rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周；
对继代培养的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取：
将人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过100目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:100混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到人参愈伤组织提取物。
实施例6：获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于10％漂白剂后在100rpm的速度震荡15min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出人参愈伤组织，其中，人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为20g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂、浓度为0.5mg/L吲哚丁酸、浓度为0.01mg/L的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.25mg/L的1-萘乙酸、浓度为0.1mg/L的吲哚-3-乙酸、浓度为0.5mg/L的6-糠氨基嘌呤、浓度为1mg/L的4-氯苯氧乙酸；
对人参愈伤组织进行继代培养：
将人参愈伤组织用灭菌刀切成30-150mm×30-150mm的组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，固体增殖培养包含浓度为4.4g/L的MS培养基、0.5mg/L吲哚丁酸、浓度为0.01mg/L的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.25mg/L的1-萘乙酸、浓度为0.1mg/L的吲哚-3-乙酸、浓度为0.5mg/L的6-糠氨基嘌呤、浓度为1mg/L的4-氯苯氧乙酸，液体增殖培养包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为20g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂、0.5mg/L吲哚丁酸、浓度为0.01mg/L的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.25mg/L的1-萘乙酸、浓度为0.1mg/L的吲哚-3-乙酸、浓度为0.5mg/L的6-糠氨基嘌呤、浓度为1mg/L的4-氯苯氧乙酸，液体培养基培养包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为20g/L的蔗糖、0.5mg/L吲哚丁酸、浓度为0.01mg/L的6-苄氨基嘌呤、浓度为0.25mg/L的1-萘乙酸、浓度为0.1mg/L的吲哚-3-乙酸、浓度为0.5mg/L的6-糠氨基嘌呤、浓度为1mg/L的4-氯苯氧乙酸；
将接种量为80g/L的人参愈伤组织加入至液体培养基中在85rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周；
对继代培养的人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的提取：
将人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过80目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:20混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到人参愈伤组织提取物。
对比例1：获取人参根组织，将人参根组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于5％漂白剂后在70rpm的速度震荡5min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参根组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周，其中，人参根组织接种培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂。
对比例2：获取人参根组织，将人参根组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于10％漂白剂后在100rpm的速度震荡15min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参根组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周，其中，人参根组织接种培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂。
对比例3：获取人参根组织，将人参根组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于15％漂白剂后在130rpm的速度震荡25min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参根组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周，其中，人参根组织接种培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂。
对比例4：获取人参苗茎组织或人参苗叶组织，将人参根组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于10％漂白剂后在100rpm的速度震荡15min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次；
然后，将人参苗茎组织或人参苗叶组织切成长度为0.5-1cm的组织段后接种到pH值范围为5.6-5.9的人参愈伤组织诱导培养基后，在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周，其中，培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂。
(1)人参外植体表面消毒后染菌率实验：
现有的人参愈伤组织诱导的方法中大多数是采取人参根部后进行愈伤组织的诱导，然而，人参根表面消毒过程当中，因人参根部表面上的很多螺纹，不易清洗表面残留的土沙并其消毒处理后的感染率较高，因此，提高表面消毒效率是在人参组织培养过程中需要解决的问题之一，本发明中为了减少人参外植体消毒过程中的染菌率，用人参苗茎或人参苗叶进行了表面消毒而进行比较；
采用对比例1、对比例2、对比例3与六个实施例中的人参苗茎或人参苗叶进行染菌率对比，该结果如表1；
染菌率的计算公式为：
表1：人参外植体不同部位的表面消毒后感染率结果
表1结果中可见，对比例1、对比例2、对比例3的染菌率分别为97.62％、95.14％、89.17％，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的染菌率分别为62.14％、54.48％、36.24％、40.89％、37.56％和53.27％，该结果表示，所有实施例的染菌率与对比例1相比表示低，这意味着用人参苗茎或人参苗叶的表面消毒方法与用人参根的表面消毒方法相比可带来更有效率的消毒结果。
(2)人参愈伤组织诱导实验：
用灭菌手术刀将从(1)中得去的无菌人参苗茎或人参苗叶组织切割成0.5-1.5cm×0.5-1.5cm，然后接种于愈伤组织培养基后在25±2℃，避光条件下进行培养36周，每培养皿中接种10个，平行3个，人参愈伤组织诱导率计算公式为：
人参愈伤组织条件中的愈伤组织诱导率为如表2，由表2和图1可知，对比例4的人参愈伤组织诱导率为0％，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的人参愈伤组织诱导率分别为38.34％、63.64％、21.59％、34.71％、42.22％、30.17％，该结果表明，本发明中所有实施例中可诱导人参愈伤组织，实施例1至6中，培养3-6周后诱导出人参愈伤组织，其颜色显乳白色。
表2：人参愈伤组织诱导率及诱导状态
(3)细胞增殖率测试
进行角质形成细胞伤口愈合实验和人脐静脉内皮细胞新血管形成实验之前，为了确定两种细胞在样品的实验浓度(100μg/ml)中确认是否具有细胞增殖活性进行了本测试。
对角质形成细胞(HaCaT)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板中，每孔的细胞接种数分别为3×104个/孔和1.5×104个/孔。细胞铺板24h后，向每孔用含1％双抗的高糖DMEM冲洗1-2次，加入100μg/ml浓度的样品。处理样品后，将已接种的细胞孔板继续在饱和湿度、37℃，5％CO2条件培养箱中培养24h；此后，加入5mg/mL浓度的MTT溶液20μL后，放入饱和湿度、37℃，5％CO2条件培养箱中孵育2h；从96孔板吸掉上清后，每个孔板中加入100μL的异丙醇，避光条件下震荡混匀待测，用酶标仪检测570nm波长处吸光值；
计算方式：
测定结果如图2和3所示，，实施例1至6当100μg/ml浓度时，对人皮肤角质形成细胞和人类脐静脉内皮细胞中中该细胞存活率为均100％以上实施例1至6在实验浓度中均对人皮肤角质形成细胞和人类脐静脉内皮细胞具有细胞的增殖能力。
(4)细胞划痕实验
细胞迁移是由细胞的化学信息组织化的多个阶段的过程，角质形成细胞的迁移过程是在皮肤表面的伤口修复过程中通过细胞的快速增长及移动的作用，促进伤口的愈合，为了确认人参愈伤组织提取物在人皮肤角质形成细胞中的伤口愈合能力，该细胞中进行了划痕实验。
在24孔板中，每孔中接种2X105个/孔人皮肤角质形成细胞后，加入含10％牛血清、1％双抗的高糖DMEM培养基，在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养24h。待细胞汇聚度为80％时，用含1％双抗的高糖DMEM进行冲洗，用200μl规格枪头在细胞表面水平划个痕后加入已稀释好的100μg/mL浓度的样品，对照组为含1％双抗的高糖DMEM培养基，然后在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中继续孵育，每时间间隔分别在0h、24h、48h拍摄以及测量划痕面积后，用ImageJ软件处理伤口愈合率。
计算方式：
由图5可知，对照组的48h后的伤口愈合率为41.3％，实施例1至6的48h后伤口愈合率分别为59.45％、60.77％、62.28％、65.37％、53.94％和51.01％，表示在48h后实施例1至6和对照组相比促进角质形成细胞的细胞愈合，说明具有伤口愈合效果。图5中，以本文中放的实施例图为代表所有实施例的观察结果。
(5)新生血管形成实验
新生血管不仅供给修复细胞营养，还提供各种调控因子，因此，新血管形成过程可以说是皮肤创伤修复的关键作用，因此，本发明中采用小管形成实验模拟了人参愈伤组织提取物对体外新生血管生成情况。
将基质胶加入到在预冷的96孔板中，转移至37℃下孵育30min待基质胶聚合。在聚合好的基质胶上面分别加入样品后，在饱和湿度、37℃、5％CO2环境下再进行孵育30min。然后，向每孔中接种1.5X104个/孔人类脐静脉内皮细胞后在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中孵育10h之后用显微镜采集新血管的形成以及计数形成的新血管数。
如图6所示，孵育10h之后对照组的新生血管形成数为21个，实施例1至6的新生血管形成数分别为57个、52个、59个、58个、62个、70个，与对照组相比，实施例1至6处理的心血管形成明显改善，其特征是新生血管的数量增加，管状结构完整，说明伤口愈合过程中促进新血管的生成。新血管生成观察结果图7中，以本文中放的实施例图为代表所有实施例的观察结果。
综上，本发明的一种人参愈伤组织诱导方法，能够减少现有的采用人参根部愈伤组织诱导中组织感染问题并充分利用人参苗的营养价值，使用人参苗中的茎或叶部组织进行人参愈伤组织的诱导，并确认了该人参愈伤组织诱导培养基条件。然后，进行了人参愈伤组织提取物的制备。最后，基于人参的丰富的生物活性成分，进一步进行了人参愈伤组织提取物在化妆品领域中作为具有皮肤伤口愈合功效原料的应用性。
以上对发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改做出若干简单推演、变形或替换，这并不影响发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，包含以下步骤：
获取人参苗组织并进行消毒；
将消毒后的人参苗组织切割成组织段后接种到人参愈伤组织诱导培养基中，诱导人参愈伤组织，其中，所述人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基、浓度为15-50g/L的蔗糖、浓度为6-8g/L的琼脂、浓度为0.1-5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05-0.5mg/L的噻苯隆。
2.如权利要求1所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述人参苗组织为人参苗茎组织或人参苗叶组织，其消毒的过程如下：
将所述人参苗茎组织或人参苗叶组织在自来水中冲洗表面后，再在70％乙醇溶液中清洗30s-60s，随后浸泡于5-15％漂白剂后在70-130rpm的转速下震荡5-25min，随后在无菌环境下用灭菌蒸馏水冲洗4-5次。
3.如权利要求2所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述组织段的长度为0.5-1cm，将所述组织段接种到所述人参愈伤组织诱导培养基后在25±2℃的温度条件下，避光培养3-6周诱导出所述人参愈伤组织；
所述人参愈伤组织诱导培养基包含浓度为4.4g/L的MS培养基、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7g/L的琼脂、浓度为1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.2mg/L的噻苯隆。
4.如权利要求3所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述人参愈伤组织诱导培养基的pH值范围为5.6-5.9。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基可选取浓度为6.075-24.3g/L的SH培养基或浓度为1.605-4.815g/L的B5培养基替代；
所述人参愈伤组织诱导培养基还包含浓度为0.5-3.5mg/L吲哚丁酸或浓度为0.01-2mg/L的6-苄氨基嘌呤为0.1-1.5mg/L的1-萘乙酸或浓度为0.1-1mg/L的吲哚-3-乙酸或浓度为0.1-3mg/L的6-糠氨基嘌呤1-2mg/L的4-氯苯氧乙酸中一种或几种。
6.如权利要求5所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，还包含对所述人参愈伤组织进行继代培养，具体过程如下：
将所述人参愈伤组织用灭菌刀切割成30-150mm×30-150mm组织段后，转移到继代培养基中进行每隔3-6周周期的固体增殖培养，反复1-2次后进行液体增殖培养，其中，所述固体增殖培养包含浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基、浓度为15-50g/L的蔗糖、浓度为6-8g/L的琼脂、浓度为0.1-5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05-0.5mg/L的噻苯隆；
液体培养包含浓度为2.2-6.6g/L的MS培养基、浓度为15-50g/L的蔗糖、浓度为0.1-5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、浓度为0.05-0.5mg/L的噻苯隆。
7.如权利要求6所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，将接种量为50-100g/L的所述人参愈伤组织加入至所述液体培养基中在70-100rpm转速、温度25±2℃、避光条件下培养3-5周。
8.如权利要求6或7所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，还包含对继代培养的所述人参愈伤组织进行人参愈伤组织提取物的制备，具体包含以下步骤：
将所述人参愈伤组织用蒸馏水洗涤两次后，采用烘干或冻干方法进行干燥后粉碎，过60-100目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
将所述人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:10-100混合后进行搅拌提取，并过滤得到滤液；
将过滤后的滤液减压浓缩至无乙醇得到所述人参愈伤组织提取物。
9.如权利要求8所述的一种人参愈伤组织诱导方法，其特征在于，优选过80目筛后得到人参愈伤组织组织粉末；
所述人参愈伤组织组织粉末与70％的乙醇按照料液比为1:20混合。
10.权利要求8、9任一权利要求所述的人参愈伤组织提取物在化妆品中的应用。
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