WO2014168338A1

WO2014168338A1 - 아스트라갈로사이드 iv의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법

Info

Publication number: WO2014168338A1
Application number: PCT/KR2014/001846
Authority: WO
Inventors: 김승훈; 김완기; 강현미; 신아름
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2014-10-16
Also published as: KR20140122533A; KR102033450B1

Abstract

본 발명은 황기 부정근의 대량생산방법에 관한 것으로서, (a)황기 종자를 멸균하여 무균화하는 단계; (b)상기 무균화된 황기 종자의 발아를 유도하는 단계; (c)발아된 황기로부터 식물호르몬을 사용하여 부정근을 유도하는 단계; (d)상기 유도된 부정근을 액체배양하는 단계;및 (e)상기 배양된 부정근을 엘리시터(Elicitor)로 처리하고 생물반응기(Bioreactor)에서 배양하는 단계를 포함함으로써 아스트라갈로사이드 IV(Astragaloside IV)의 함량을 현저히 증가시킨 황기 부정근을 대량으로 생산할 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법

【기술분야】

<ι> 본 명세서에 기재된 내용은 식물조직배양기술을 이용한 황기 부정근의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

【배경기술】

<2> 황기 (Astragali Radix)는 콩과 (Leguminosae)에 속하는 다년생 초본식물인 단 너삼 (Astragalus membranaceus Bunge)의 주피를 벗겨 뿌리를 건조한 것으로， 외부 가 담갈색 또는 황갈색이고 내부는 황백색으로 부드럽고 단 향기가 있다. 또한 신 농본초경에서는 노인에게 특히 효과가 있으며 수명을 연장시키는 작용이 있어서 황 기라 부르며 (노승현， 황인형, TV 본초강목， p332, 1999； 배기환, 민간요법과 한방 요법에 따른 건강지침서 원색도감， p445, 2003), 우리나라에서는 예부터 민간에서 강장제로써 인삼 다음의 보기약으로 쓰이고 있다 (현대생약학， 생약학연구회, 학창 사， 2000； 본초학， 계축문화사， 2000; 생약학， 생약학교재편찬위원회， 동명사， 2001). 황기가 들어있는 처방으로는 황기건중탕, 황기계지오물탕， 십전대보탕， 방 기황기탕 등이 있으며， 생리활성으로는 혈압강하작용, 이뇨작용， 강장작용， 면역증 강작용， 항염작용 등이 보고된 바 있다 (중약대사전， 상해과학기술출판사, vol.l, 1985； Hikino, H. 등， Planta Med. , 30 :297-302, 1976； Tomoda, M. 등， Phytochemistry, 31(1)： 63-66, 1992； Zang, Y. 등， Acta. Pharm. Sin. , 19： 333- 337, 1994) .

o> 황기는 환경부에서 정한 멸종위기동식물 Π급 속하는 종인데， 이것은 자연적 또는 인위적 위협요인으로 개체수가 현저하게 감소되고 있어 현재의 위협요인이 제 거되거나 완화되지 아니할 경우 가까운 장래에 멸종위기에 처할 우려가 있는 야생 식물임을 뜻한다.

<4> 식물조직배양기술은 식물 고유의 전형성능 (Totipotency)을 이용하여 식물체 를 세포나 조직의 형태로 형성하거나 식물체를 다시 재생시킬 수 있는 방법으로써， 조직배양이라는 특수한 환경에서 배지에 영양분， 생장호르몬, 온도 등의 조절함으 로써 실험자의 목적에 맞는 다양한 실험을 실시할 수 있다. 이 기술을 이용하여 식 물이 갖는 고유의 유효성분을 생산하기 위해서는 대량배양 기술이 필요—하며， 여기 에 생물반웅기가 사용된다.

<5> 또한 식물조직배양은 우량한 개체의 대량증식과 무병주의 생산을 통한 식물 재료의 생산에 효과적인 방법으로 알려져 있고, 이러한 방법은 기본적으로 환경적, 시간적 제한없이 식물재료를 생산하기 때문에 약리적 효능이 인정된 식물의 생산에 많이 사용되고 있다.

<6> 종래 형질전환된 황기 모상근으로부터 아스트라갈로사이드 I, II, III를 효 율적으로 생산하기 위한 연구가 이루어진바 있다 (Korean J. Biotechnol. , Vol 21, No. 2). 그러나 상기의 방법은 식물의 상처부위를 통해 식물세포의 게놈 안으로 삽 입된 아그로박테리움 리조젠스 (Agrobacterium rhizogenes)의 T-DNA에 의해 유도되 는 유전자변형된 모상근의 형태로, 식품원료로 사용하는데 제한적이다.

<7> 이에 본 발명자들은 보다 안전성이 확보된 방법으로써 안전한 식물호르몬만 으로 뿌리조직을 유도하여 유전자 변형없는 황기 부정근을 생산하여 아스트라갈로 사이드 IV를 대량으로 생산하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

<s> [선행기술문헌]

<9> [비톡허문헌]

<io> TV본초강목， p332, 노승현, 황인형 , 1999

<ιι> 민간요법과 한방요법에 따른 건강지침서 원색도감， p445, 배기환, 2003

<12> 현대생약학， 생약학연구회, 학창사ᅳ 2000；

<13> 본초학， 계축문화사， 2000;

<14> 생약학, 생약학교재편찬위원회， 동명사， 2001

<15> 중약대사전, 상해과학기술출판사, vol.1, 1985；

<i6> Hikino, H. et al， Planta Med. , 30:297-302, 1976；

<i7> Tomoda, M. et al, Phytochemistry, 31(1)： 63-66, 1992；

<i8> Zang, Y. et al. , Acta. Pharm. Sin. , 19:333-337, 1994

<19> Korean J. Biotechnol. , Vol 21, No.2, 2006

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

<20> 본 발명은 황기의 종자로부터 발아된 특정부위를 이용하여 부정근의 유도조 건을 확립하고 액체배양을 통한 최적 생장조건을 규명한 후， 유효 사포닌인 아스트 라갈로사이드 IV의 함량을 높이기 위한 최적 배양조건을 설정함으로써 유전자 변형 이 없어 안전하면서도 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근을 대량 으로 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

【기술적 해결방법】

<21> 상기의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명의 일 실시예는 <22> (a)황기 종자를 멸균하여 무균화하는 단계;

<23> (b)상기 무균화된 황기 종자의 발아를 유도하는 단계 ;

<24> (C)발아된 황기로부터 식물호르몬을 사용하여 부정근을 유도하는 단계;

<25> (d)상기 유도된 부정근을 액체배양하는 단계; 및

<26> (e)상기 배양된 부정근을 엘리시터 (Elic or)로 처리하고 생물반웅기

(Bioreactor)에서 배양하는 단계를 포함하는 아스트라갈로사이드 IV stragaloside IV)의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법을 제공한다.

【유리한 효과】

<27> 본 발명에 따르면ᅳ 황기의 종자발아체를 이용하여 부정근을 유도함으로써 식 물체를 이용하는 것보다 오염를을 현저히 낮출 수 있다. 또한, 유도된 부정근을 이 용하여 대량으로 생산할 수 있다. 특히 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황 기 부정근의 대량생산이 가능하므로， 궁극적으로 아스트라갈로사이드 IV를 대량생 산할 수 있다.

<28> 이로써， 본 발명에 따른 황기 부정근의 대량생산방법은 화장품 또는 산업 등 다양한산업분야에 활용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

<29> 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 황기 부정근의 대량생산 과정을 나타내 는 도이다.

<30> 도 2a 내지 도 2d는 아스트라갈로사이드 IV의 함량 분석그래프로서 , 도 2a는 대조군으로서 아스트라갈로사이드 IV의 피크, 도 2b는 황기 뿌리 내 아스트라갈로 사이드 IV의 함량, 도 2c는 비교예 1인 황기부정근 내 아스트라갈로사이드 IV의 함 량， 도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 생산된 황기 부정근 내 아스트라갈로사이 드 IV의 함량을 각각 분석하여 나타낸 그래프이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

<31> 본 명세서에서 "부정근' '이라 함은， 줄기에서 2차적으로 발생하는 뿌리를 의 미하는 것으로서， 원뿌리 이외의 부분이라면 발생장소 및 발생원인， 형태를 불문하 는 최광의의 개념이다.

<32>

<33> 이하， 본 발명을 상세히 설명한다.

<34> 황기는 아스트라갈로사이드류 (Astragalosides)의 사포닌과 아스트라갈란

(Astagalan) 계통의 다당류， 캠페를， 퀘르세틴， 이소람네틴, 갈리코신， 포르모노네 틴， 람노시트린, 쿠마타게닌 등의 플라보노이드， 아스파라긴， 글루탐산, 프를린， β-아미노뷰티르산， 아르기닌， 알라닌 등의 아미노산을 함유하고 있다 (Kitagawa, I. el, Chem. Pharm. Bull., 31(2) :709-722, 1983) .

<35> 또한， 황기는 시클로알탄 트리테르펜 글리코사이드 (cycloartane triterpene glycosides)인 아스트라갈로사이드 I~VII를 포함하고 있는데， 아글리콘 (aglycone) 인 시클로아스트라제놀 (cycloastragenol)에 3-, 6-, 그리고 25-번 위치에 1~3개의 당이 결합된 구조를 지니고 있다 (하기 화학식 1 내지 4참조).

<36> 【화학식 1】

<37> Astragaloside I

<38> 【화학식 2】

Astragaloside II

<39> <40> 【화학식 3】

Astragaloside III

【화학식 4】

Astragaloside IV

<43>

<44> 이 중에서도 아스트라갈로사이드 IV는 황기의 대표적인 사포닌의 일종으로 항암 (ant i— cancer), 항피로 (anti-fatigue)， 항고혈압 (ant i -hyper tens ion)， 양성변 력작용 (positive inotro ic action) , ¾·¾ (anti-inflammation) , 경색억제 (anti— infarction) 등 다양한 활성을 나타낸다 (Biol. Pharm. Bull. 33(4)， 641-646, 2010). 그러나 황기의 재배년도에 따른 아스트라갈로사이드의 함량은 재배년도가 증가할수톡 총 아스트라갈로사이드의 양이 감소하고, 전체적으로 아스트라갈로사이 드 IV가 Ι~ΠΙ보다 함량이 적다 (Korean J. Medicinal Crop Sci. 20(5): 372-380, 2012). 따라서， 이를 실질적으로 이용하기 위하여는 황기 자체 내에 함유된 아스트 라갈로사이드 IV만을 사용하는 것으로는 한계가 있으므로 대량으로 생산할 필요성 이 있다. <45>

<46> 따라서， 본 발명은 상기와 같이 인체에 유용한 활성을 나타내는 성분인 아스 트라갈로사이드 IV를 대량생산하기 위하여， 이를 다량 함유하는 황기 부정근을 대 량 생산하기 위한 방법을 제공한다.

<47>

<48> 본 발명의 일 실시예는 황기 부정근의 대량생산방법으로서,

<49> (a)황기 종자를 멸균하여 무균화하는 단계;

<50> (b)상기 무균화된 황기 종자의 발아를 유도하는 단계 ;

<51> (C)발아된 황기로부터 식물호르몬을사용하여 부정근을 유도하는 단계;

<52> (d)상기 유도된 부정근을 액체배양하는 단계; 및

<53> (e)상기 배양된 부정근을 앨리시터 (Elicitor)로 처리하고 생물반웅기

(Bioreactor)에서 배양하는 단계를 포함하는 아스트라갈로사이드 IV(Astragaloside IV)의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법을 제공한다. 도 1은 실제로 본 발명의 일 실시예에 따라 황기 부정근을 대량생산한 과정을 사진촬영하여 나타낸 것이다.

<54> 본 발명의 일 실시예로 상기 (a)단계에서 구체적으로 황기종자는 발아 촉진 을 위해 물에 침지된 다음 클린벤치 (Clean bench, 무균상)에서 70% 에탄올과 2%차 염소산나트륨을 이용하여 표면살균함으로써 멸균하여 무균화 될 수 있다. 이때， 표 면살균 후 황기의 표면에 묻어있는 차염소산나트륨으로 인해 종자가 상하는 것을 방지하기 위하여, 멸균된 증류수로 수세하여 사용한다.

<55> 본 발명의 일 실시예로 상기 (B)단계에서는 황기 종자의 발아를 유도하기 위 하여， 상기 (a)단계에서 표면살균되어 무균화된 황기 종자를 슈크로스 (sucrose)가 첨가된 MS(Murashige & Skoog)배지에 치상함으로써 황기 종자의 발아를 유도할 수 있다. 구체적으로 25士 3°C의 온도조건에서 암 (暗)상태로 배양시킴으로써 발아시킬 수 있으며， 이때 슈크로스는 20~30g/L 또는 30g/L의 농도로 첨가할 수 있다. 슈크 로스가 과량으로 첨가될 경우 배지의 삼투압을 증가시켜 부정근의 분화를 억제할 수 있기 때문이다.

<56> 본 발명의 일 실시예로 상기 (c)단계에서는 발아된 황기로부터 부정근을 유 도하기 위하여, 부정근의 유도부위로는 발아된 황기의 즐기 부위를 사용할 수 있 다. 그리고 이 발아된 황기의 즐기 부위를 식물호르몬인 인돌 -3—부티르산 (indole- 3-butyric acid, IBA), 또는 인돌 -3-부티르산과 키네틴 (Kinetin)을 포함하고 슈크 로스가 첨가된 MS 배지 위에 치상함으로써 부정근을 유도할 수 있다. 구체적으로, 부정근의 유도율을 높이기 위하여 인돌 -3-부티르산은 3~5ppm 또는 5ppm, 키네틴은 0.5~3ppm의 비율로 첨가될 수 있다.

<57> 본 발명의 일 실시예로 상기 (d)단계에서는 유도된 부정근을 액체배양한다.

액체배양은 새로운 배지 및 영양원의 첨가， 배지의 교체, 배양조직의 계대, 배양 중 시료채취 등이 용이하며 배양체의 생장 또한 빠른 장점이 있다 . 구체적으로 본 발명의 일 실시예로서 유도된 부정근을 인돌 -3-부티르산 3~5ppm, 슈크로스 20~30g/L가 첨가된 MS배지 또는 SH(Schenk & Hi ldebrandt)배지에서 4~5주간 액체 배양할 수 있다. 이때 액체배양은 부정근 세포에 물리적 자극을 줌으로써 아스트라 갈로사이드 IV의 생장량 및 생합성을 촉진하기 위하여 배지를 교반시키면서 배양을 실시할 수 있으며， 이때 교반속도는 구체적으로 120~140rpm, 보다 구체적으로 130rpm의 조건으로 교반시키면서 실시될 수 있다. 또한 접종량 역시 부정근의 생장 에 중요한 요소가 되는데, 접종량은 액체배지 lC l 당 유도된 부정근 0.5~2g, 0.8~1.5g또는 lg의 비율로 할 수 있다.

<58> 본 발명의 일 실시예로 상기 (e)단계에서는 (d)단계에서 배양된 황기 부정근 을 대량생산하기 위하여 생물반웅기 (Bioreactor)에서 배양할 수 있다. 이때 아스트 라갈로사이드 IV의 함량을 증가시키기 위하여 앨리시터로 앨리시테이션 (Elicitation)을 실시한 후 생물반웅기에서 배양할 수 있다. 엘리시터를 처리하기 전까지의 시기는 황기 부정근의 생장을 위한 시기이고， 엘리시터 처리 후 1주간 더 배양하는 것은 2차 대사산물인 아스트라갈로사이드 IV의 함량을 증가시키기 위한 시기이다. 엘리시터로는 키토산, 효모추출물 또는 MeJA(Methyl Jasmonate) 등을 사 용할 수 있으며， 보다 구체적으로 MeJA를 사용할 수 있다. 그리고 인돌ᅳ 3-부티르산 3~5mg/L, 슈크로스 20~30g/L가 첨가된 SH 배지에 MeJACMethyl Jasmonate)로 처리된 부정근을 접종하여 암상태로 4~5주간 배양함으로써 실시될 수 있다. 또한， 아스트 라갈로사이드 IV 함량을 효율적으로_ᅵ증가시키기 위해서 상기 배지에서 4~5주간 배 양된 황기 부정근에 80~120 , 90-110 또는 100 μΜ의 MeJA를 처리하고， 6~8일 , 즉 1 주간 더 배양하는 것을 포함할 수 있다.

<59> 또한， 본 발명의 일 실시예에 따른 황기 부정근의 대량생산방법에 사용되는

MS 배지는 MgS0₄.7¾0, CaCl₂.2¾0, KN0₃, NH4NO3, KH₂P0₄, F.e.S0₄.7¾0， Na₂-EDTA,

MnS0₄.4H₂0, ZnS0₄.7H₂0, CuS0₄.5H₂0, CoCl₂.6H₂0, KI , ¾B0₃, Na₂Mo0₄.2H₂0 , 슈크로스， 미오이노시를 (my으 Inositol), 니코틴산 (Nicotin Acid), 피리독신하이드로클로라이 드( (10^ -11(：1), 티아민하이드로클로라이드 (Thiamin-HCl), 글리신 (glycine) 및 아가 (Agar)를 포함할 수 있고， pH는 5.7~5.8일 수 있다. 그리고 SH 배지는 MgS0₄.7H₂0, NH₄H₂P0₄₎ CaCl₂.2H₂0, KN0₃, _. FeS0₄.7H₂0, Na₂-EDTA, MnS0₄.4H₂0,

ZnS0₄.7H₂0, CuS0₄.5H₂0, CoCl₂.6H₂0, KI , ¾B0₃, Na₂Mo0₄.2H₂0 , 슈크로스, 미오이노시 를 (myo-Inos ol), 니코틴산 (Nicotin Acid), 피리독신하이드로클로라이드 (Pyridoxine-HCl), 티아민하이드로클로라이드 (Thiamin-HCl) 및 아가 (Agar)를 포함 할수 있고, pH는 5.7~5.8일 수 있다.

<60>

<6i> 본 발명의 일 실시예로서 상기와 같은 (a)~(e)단계를 포함하는 방법에 의하 면 황기 부정근을 유전자 변형없이도 안전하게 대량으로 생산할 수 있다. 특히 본 발명의 일 실시예에 따르면 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 황기 부정근 총 중량 에 대하여 5~15， 7—12 또는 9~10중량 %로 함유된 황기 부정근을 생산할 수 있다. 이 는 기존 황기의 뿌리 또는 엘리시터를 처리하지 않은 황가 부정근보다 아스트라갈 로사이드 IV가 3배 이상으로 현저히 많이 함유된 황기 부정근의 생산이 가능함을 의미한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

<62> 이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예을 통하여 설명한다. 이는 본 발명 을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예 및 시험예 의 범위로 제한되는 것은 아니다.

<63> 또한， 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사 상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가 능함은 명백한사실이다.

<64>

<65> [실시예 1 내지 20] 황기부정근의 생산

<66> 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 아스 H라갈로사이드 IV가 다량 함유된 황기 부정근을 하기와 같이 생산하였다.

<67>

<68> 황기의 종자를 이용한 발아

<69> 황기 종자는 아람종묘에서 구입한 국내산 황기 종자를 사용하였다. 본 실험 에 사용한 모든 배지와 기구는 121^°C, 1.5기압으로 20분간 고온, 고압 멸균하여 페 트리디쉬 (Petri-dish)에 각각 30 ml씩 분주하여 사용하였다.

<70> 먼제 황기 종자의 발아를 촉진하기 위하여 황기 종자를 수듯물에 24시간 침 지시켰다. 침지된 종자를 클린벤치에서 70% 에탄올에 약 1분， 2% 차염소산나트륨에 약 15분 동안 각각 표면살균한 후, 표면에 묻어있는 차염소산나트륨으로 인해 종자 가 상하는 것을 방지하기 위하여 멸균된 증류수로 3회 수세하였다. 표면살균된 종 자는 슈크로스가 30g/L 첨가된 하기 표 2의 조성을 갖는 MS 고체배지에 치상하여 발아를 유도하였으며, 25±3^°C의 온도에서 암상태로 배양실에서 배양하였다.

<71> 그 결과， 배양 후 5일부터 황기 종자가 발아하기 시작하였고 줄기가 신속하 게 신장되었다.

<72>

<73> 부정근 유도

<74> 발아 후 자라난 줄기 부위를 약 1~2 cm로 절단하여 부정근 유도를 위한 재료 로 사용하였다.

<75> 절편은 하기의 표 1과 같이 인돌 -3-부티르산과 키네틴을 각각 0.5, 1， 3,

5mg/L의 조합으로 MS배지에 첨가하여 페트리디쉬당 6개씩， 총 12개씩 각각 치상하 였고, 25±3t：， 암상태로 배양실에서 배양하면서 부정근 유도 양상을 조사하였다. 부정근 유도에 사용된 MS 배지의 조성은 하기 표 2의 조성과 동일하다.

<76> 【표 1】

<77>

<78> 황기 부정근의 액체배양

<79> 황기 부정근을 하기 표 2와 같은 조성을 가지는 MS 배지와 SH 배지에 인돌ᅳ 3-부티르산 lmg/L, 슈크로스 30g/L를 첨가하여 액체배양을 하였다.

<80> 이때 고체배지에서 유도된 부정근 (실시예 12)을 lg 취하여 100 ml 배지가 들 어있는 250ml 삼각플라스크에 접종하여 4주간 130rpm으로 교반하여 액체배양하였 다.

<81> 【표 2】

<82>

<83> 황기 부정근의 생물반응기 배양

<84> 황기 사포닌 분석 및 제품화를 위해서는 많은 양의 건조상태의 부정근이 필 요하므로， 생물반웅기를 이용하여 배양하였다.

<85> 인돌 -3-부티르산 lmg/L, 슈크로스 30g/L가 첨가된 2L의 SH 배지가 들어있는

5L의 생물반응기에 부정근 65g을 접종하여 암상태로 5주간 배양하였다. 이때 황기 부정근의 아스트라갈로사이드 IV 함량 증가를 위하여 4주 배양된 황기 부정근에 lOOyM MeJA를 처리하고， 1주간 더 배양하여 부정근을 생산하였다.

[비교예 1] 엘리시터 처리하지 않은 황기 부정근

생물반응기 배양에 있어서 엘리시터인 MeJA를 처리하지 않고 5주간 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 비교예 1의 황기 부정 근을 생산하였다.

[시험예 1] 호르몬 조성에 따른 부정근 유도율

상기 부정근 유도단계에서 실시예 1~20의 배양조건 중, MS 배지에 포함된 인 돌 -3-부티르산과 키네틴 농도에 대한 부정근의 유도율 (%)을 분석하여 하기의 표 3 에 나타내었다.

이때 부정근의 유도율 (%)은 하기 수학식 1과 같이 계산하였으며, 부정근이 유도된 절편수는 캘러스 (callus)와 부정근이 같이 유도된 조직도 포함하여 계산하 였다.

【수학식 11

【표 3]

(단위 : %) 상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 인돌 -3-부티르산이 3~5ppm, 키네틴 0.5~3ppm일 때 부정근의 유도을아 높게 나타났으며， 특히 인돌 -3-부티르산이 5ppm 이고, 키네틴이 0.5~3ppm인 경우에는 유도율이 100%로 나타 다. <ioo> [시험예 2] 호르몬 농도에 따른 부정근 생장량

<ιοι> 상기 부정근 유도단계에서 실시예 1~20의 배양조건 중, MS 배지에 포함된 호 르몬 중 인돌 -3-부티르산의 농도에 따른 부정근 생장량 (g)을 측정하여 , 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.

<102> 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<103> 【표 4】

<104> 상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 인돌 -3-부티르산의 농도가 lppm일 때 가 장 높은 생장량을 보였다. 그러나， 그 이상 과량으로 첨가되는 경우에는 부정근이 생장하였지만 캘러스화 되는 비정상적인 생장이 나타나는 문제점이 있었다.

<105>

<106> [시험예 3] 배지에 따른 부정근 생장량

<107> 상기 황기 부정근 (실시예 2)의 액체배양단계에서의 배지의 종류에 따른 부정 근 생장량을 측정하였으며， 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

<108> 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<109> 【표 5】

<uo> 상기 표 5에서 확인되는 바와 같이 생장량에 큰 차이는 없었으나， SH 배지에 서 보다 높은 생장량을 나타내었다.

<111>

<112> [시험예 4] 슈크로스 농도에 따른 부정근 생장량

<113> 상기 고체배지에서 유도된 부정근 (실시예 8)을 lg씩 총 4g취하고, 슈크로스 가 1， 3, 5, 7%의 농도， 즉 슈크로스가 10, 30, 50, 70 g/L첨가된 것을 제외하고는 각각 표 2와 동일한 조성인 SH배지가 100ml， 인돌 -3-부티르산이 lmg/L 들어있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하여， 4주간 130rpm로 교반하여 액체배양을 하였다. <114> 그리고 상기 황기 부정근의 액체배양단계에서의 슈크로스 농도에 따른 부정 근 생장량을 측정하였으며， 그 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

<115> 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<116> . 【표 6】

<ιΐ7> 상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 농도가 3%인 슈크로스 배지 처리구에서 높은 생장량을 나타내었고.과량으로 첨가되는 경우 생장이 억제되었다.

<118>

<119> [시험예 5] 교반속도에 따른 부정근 생장량

<120> 상기 고체배지에서 유도된 부정근 (실시예 8)을 lg씩 총 3g 취하고， 표 2와 동일한 조성인 SH배지가 100ml， 인돌 -3-부티르산이 lmg/L 들어있는 250ml의 삼각플 라스크에 접종하여 4주간 100， 130， 150rpm으로 각각 달리 교반하여 액체배양을 하 였다.

<121> 그리고 상기 황기 부정근의 액체배양단계에서의 교반속도에 따른 부정근 생 장량을 측정하였으며， 그 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.

<122> 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<123> 【표 7】

<124> 상기 표 7에서 확인되는 바와 같이 교반속도가 130rpm인 처리구에서 높은 생 장량을 나타내었고 이보다 낮거나 높은 교반속도에서는 생장량이 다소 감소하였다.

<125>

<126> [시험예 6] 초기 접종농도에 따른 부정근 생장량

<127> 상기 고체배지에서 유도된 부정근 (실시예 8)을 각각 0.5， 1, 2g씩 취하고, 표 2와 동일한 조성인 SH배지가 lOOuil, 인돌 -3-부티르산 lmg/L가 들어있는 250ml의 삼각플라스크에 접종하여 4주간 130rpm으로 교반하여 액체배양을 하였다.

<128> 상기 황기 부정근의 액체배양단계에서의 액체배지 lOOinl 당 초기 접종농도에 따른 부정근 생장량을 측정하였으며, 그 결과를 하기의 표 8에 나타내었다. <129> 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<130> 【표 8】

<ΐ3ΐ> 상기 표 8에서 확인되는 바와 같이 초기 접종농도가 lg인 처리구에서 접종량 대비 보다 높은 생장량을 나타내었고 이보다 적거나 많은 접종농도에서는 생장량이 다소 감소하였다.

<132>

<133> [시험예 7] 엘리시터 종류에 따른 부정근 생장량

<134> 상기 황기 부정근 (실시예 2)의 생물반응기 배양단계에서, 엘리시터를 각각 키토산, 효모 추출물 또는 MeJA를 처리하여 엘리시터의 종류에 따른 부정근 생장량 을 측정하였다. 그리고 부정근내 함유된 아스트라갈로사이드 IV의 함량 (%)를 측정 하여 , 그 결과를 하기의 표 10에 나타내었다.

<135> 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<136> 또한, 부정근내 함유된 아스트라갈로사이드 IV의 함량은 하기와 같이 측정하 였다.

<137> 상기 서로 다른 엘리시터를 처리하여 생산된 부정근올 각각 건조한 후 균일 하게 분쇄하여 50호 체를 통과시킨 후 분말 0.5g을 취하였다. 메탄을 20mL을 넣고 30분간 초음파 추출을 한 후 여과한 후, 잔류물에 메탄을 20mL을 첨가해 위의 과정 을 두 번 반복 추출하였다. 여과액을 모두 모아 감압농축하고, 농축물을 메탄을 10mL에 녹인 후 이 증 ΙΟμΙ를 취하여 검액으로 하였으며, 하기 표 9에 기재된 조 건으로 HPLC분석하였다.

<138> 【표 9】

<139>

<140> 그 결과 각 엘리시터 처리 황기 부정근 총 중량에 대한 분리된 아스트라갈로 사이드 IV의 함량 (¾>)을 하기 표 10에 나타내었다.

<141> 【표 10】

<142> 상기 표 10에서 확인되는 바와 같이 엘리시터 MeJA 처리구에서 보다 높은 생 장량을 나타내었을 뿐만 아니라， 부정근내 함유된 아스트라갈로사이드 IV의 함량 (^도 가장 높게 나타났다.

<143>

<1 4> [시험예 8] 엘리시터 처리시기에 따른 부정근 생장량

<!45> 상기 황기 부정근 (실시예 2)의 생물반웅기 배양단계에서의 엘리시터 처리시 기에 따른 부정근 생장량과 아스트라갈로사이드 IV 함량을 측정하였다. 2, 3, 4, 5 주간 각각 배양한 후 엘리시터를 처리하고, 그 후 각각 1주간을 더 배양하여 함량 을 측정하였다. 이때 엘리시터를 처리하기 전까지의 시기는 황기 부정근의 생장을 위한 시기이고, 엘리시터 처리 후 1주간 더 배양하는 것은 2차 대사산물인 아스트 라갈로사이드 IV의 함량을 증가시키기 위한 시기이다.

<146> 그리고 엘리시터의 처리시기를 달리하였을 때의, 결과를 하기의 표 11에 나 타내었다.

<147> ^' 이때 부정근의 생장량은 배지를 제거한 상태의 생장완료 후의 부정근의 무게 에서 초기에 접종한 고체배지에서 유도된 부정근의 무게를 뺀 생체량으로 계산하였 다.

<148> 또한， 부정근내 함유된 아스트라갈로사이드 IV의 함량 (%)은 상기의 시험예 7 에서 사용된 방법과 동일한 방법으로 HPLC를 이용하여 분석하였다.

<149> 【표 11】

<150> 상기 표 11에서 확인되는 바와 같이 배양 4-5주 후에 MeJA를 처리한 경우가 부정근 생장량과 아스트라갈로사이드 IV 함량이 높은 것으로 나타났으며, 그 차이 는 크지 않았다. 따라서 엘리시터 처리의 최적시기는 4주후 MeJA를 처리한 경우가 가장 효율적이라 판단된다.

<151>

<152> [시험예 9] 황기 부정근의 아스트라갈로사이드 IV분석

<153> 황기 뿌리， 상기 비교예 1 및 상기 실시예 2에서 생산된 부정근을 건조한 후 균일하게 분쇄하여 50호 체를 통과시킨 후 분말 0.5g을 취하였다. 메탄을 20mL을 넣고 30분간 초음파 추출을 한 후 여과한 후， 잔류물에 메탄올 20/riL을 첨가해 위의 과정을 두 번 반복 추출하였다. 여과액을 모두 모아 감압농축하고, 농축물을 메탄 올 10mL에 녹인 후 이 중 ΙΟμΙ를 취하여 검액으로 하였으며， 상기 표 9에 기재된 조건과 같은 조건으로 HPLC분석하였다. 그 결과 분리된 아스트라갈로사이드 IV의 함량 (%)을 도 2a 내지 도 2d 및 하기 표 12에 나타내었다. 이때 아스트라갈로사이트 IV의 함량 %의 기준은 각각 황기뿌리, 미처리 황기부정근， MeJA 처리 황기부정근의 총 중량이다.

<154> 【표 12】

상기 표 12 및 도 2a 내지 도 2d에서 확인되는 바와 같이， 본 발명의 방법에 따라 생산된 황기 부정근은 3배 ~ 4배 이상의 아스트라갈로사이드 IV의 함량을 나 타냄을 확인할 수 있었다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

(a)황기 종자를 멸균하여 무균화하는 단계;

(b)상기 무균화된 황기 종자의 발아를 유도하는 단계;

(c)발아된 황기로부터 식물호르몬을 사용하여 부정근을 유도하는 단계;

(d)상기 유도된 부정근을 액체배양하는 단계; 및

(e)상기 배양된 부정근을 엘리시터 (Elicitor)로 처리하고 생물반웅기 (Bioreactor)에서 배양하는 단계를 포함하는 아스트라갈로사이드 IV(Astragaloside IV)의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법.

【청구항 2】

제 1 항에 있어서， 상기 (b)단계는 무균화된 황기 종자를 슈크로스 (sucrose) 가 첨가된 MS(Murashige & Skoog)배지에 치상하여 발아를 유도하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생 산방법 .

【청구항 3】

제 2 항에 있어서， 상기 MS 배지는 MgS0₄.7¾0, CaCl₂.2H₂0, KN0₃, H₄N0_3>

KH₂P0₄, FeS0₄.7H₂0, Na₂-EDTA, MnS0₄.4H₂0, ZnS0₄.7H₂0, CuS0₄.5H₂0, CoCl₂.6H₂0, KI ,

H₃B0_3> Na₂Mo0₄.2H₂0, 슈크로스， 미오이노시틀 (myo-Inositol )， 니코틴산 (Nicotin

Acid), 피리독신하이드로클로라이드 (Pyridoxine— HC1), 티아민하이드로클로라이드 (Thiamin— HC1), 글리신 (glycine) 및 아가 (Agar)를 포함하고, pH가 5·7~5·8인 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방 법.

【청구항 4】

제 2 항에 있어서, 상기 (b)단계에서 슈크로스는 20~30g/L로 첨가되는 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방 법.

【청구항 5】

제 1 항에 있어서， 상기 (c)단계는 발아된 황기의 줄기 부위를 식물호르몬으 로 인돌 -3ᅳ부티르산 (indole-3-butyric acid, IBA) 또는 인돌 -3-부티르산과 키네틴 (Kinetin)을 포함하고 슈크로스가 첨가된 MS(Murashige & Skoog) 배지 위에 치상하 여 부정근을 유도하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 황기 부정근의 대량생산 방법 .

【청구항 6】

제 5 항에 있어서 , 상기 (c)단계에서 인돌 -3-부티르산과 키 네틴은 3 ppm:0.5~3ppm의 비율로 첨가되는 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법 .

【청구항 7】

제 1 항에 있어서， 상기 (d)단계는 유도된 부정근을 인돌 -3-부티르산이 3~5ppm, 슈크로스가 20-30g/L 첨가된 MSCMurashige & Skoog)배지 또는 SHCSchenk & Hi ldebrandt ) 배지에서 120~140rpm의 조건으로 교반시키 면서 4~5주간 액체배양하는 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생 산방법 .

【청구항 8]

제 7 항에 있어서， 상기 SH 배지는 MgS0₄.7H₂0_; NH₄H₂P0₄, CaCl₂.2H₂0, ΚΝ0₃'

FeS0₄.7H₂0, Na₂-EDTA, MnS0₄.4¾0, ZnS0₄.7H₂0, CuS0₄.5H₂0, CoCl₂.6H₂0, KI , H₃B0₃,

Na₂Mo0₄.2H₂0, 슈크로스， 미오이노시를 (myo-Inosi tol )， 니코틴산 (Nicot in Acid) , 피 리독신하이드로클로라이드 (Pyridoxine-HCl ) , 티 아민하이드로클로라이드 (Thi amin- HC1 ) 및 아가 (Agar)를 포함하고， pH가 5.7~5.8인 것을 특징으로 하는 아스트라갈로 사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법 .

【청구항 9】

제 7 항에 있어서 , 상기 MS 또는 SH 배지에 대한 유도된 부정근의 접종량은 배지 100ml당 유도된 부정근 0.5~2g의 비율임을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법 .

【청구항 10】

제 1 항에 있어서 , 상기 (e)단계에서 상기 엘리시 터는 MeJA(Methyl Jasmonate)인 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부 정근의 대량생산방법 .

【청구항 11】

제 10 항에 있어서， 상기 (e)단계는 인돌 -3-부티르산 3~5mg/L, 슈크로스 20~30g/L가 첨가된 SH 배지에 MeJA로 처 리된 부정근을 접종하여 4~5주간 배양하는 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생 산방법 .

[청구항 12】

제 11 항에 있어서 , 상기 4~5주간 배양된 황기 부정근에 80~120？의 MeJA를 처리하고 6~8일간 더 배양하는 것을 특징으로 하는 아스트라갈로사이드 IV의 함량 이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법 .

【청구항 13】

아스트라갈로사이드 IV의 함량이 황기 부정근 총 증량에 대하여 5~15 중량 % 로 함유된 황기 부정근 .

【청구항 14]

제 13 항에 있어서， 상기 황기 부정근은 제 1항 내지 제 12항 중 어느 하나 의 항의 방법에 의해 생산된 것인 황기 부정근 .

【청구항 15】

제 1 항 내지 제 12 항 증 어느 하나의 항의 방법에 의해 생산된 황기 부정