CN110012836A - 一种大规模生产黄芪毛状根的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大规模生产黄芪毛状根的方法，属于黄芪生物技术培育技术领域。其通过诱导黄芪愈伤组织、筛选优质黄芪和大规模生产黄芪毛状根。本发明使用灭过菌的黄芪种子培养无菌苗，以无菌苗诱导出黄芪愈伤组织，改变培养基、培养温度，筛选出增殖稳定、性状稳定的黄芪毛状根，并使用固体培养基和液体悬浮培养大规模生产黄芪毛状根。本发明可在保证黄酮含量的基础上，稳定高产黄芪毛状根，并有生产周期短、生产品质统一、对土地没有破坏性、适应常温生长条件的优点。

Description

一种大规模生产黄芪毛状根的方法
技术领域
本发明涉及一种大规模生产黄芪毛状根的方法，属于黄芪生物技术培育技术领域。
背景技术
黄芪，又名绵芪。多年生草本，高50-100厘米。主根肥厚，木质，常分枝，灰白色。茎直立，上部多分枝，有细棱，被白色柔毛。多年生草本，高50-100厘米。产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。
黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，其有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。由于长期大量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险。为此确定该植物为渐危种，国家三级保护植物。
黄芪性喜凉爽，耐寒耐旱，怕热怕涝，适宜在土层深厚、富含腐殖质、透水力强的沙壤土种植。强盐碱地不宜种植。根垂直生长可达1米以上，俗称"鞭竿芪"。黄芪需长到第三年才能采收，否则有效成分达不到质量要求；如果年久不收，则又极易黑心或木质化。采收时需要大量熟练人工，深挖慢采，避免挖断主根。所以人工种植黄芪费时费力，且对土壤环境影响较大。采收的黄芪也会因为种植的过程及采收的技术不同而造成有效成分区别较大，质量不稳定的缺点。
发明内容
本发明的目的是克服黄芪毛状根中有效成分含量不同、品质不一的不足，同时利用生物技术来保护我们珍贵的土壤资源，提供一种工业化大规模生产黄芪毛状根的方法，可在保证黄酮含量的基础上，稳定高产黄芪毛状根。
本发明的技术方案，一种大规模生产黄芪毛状根的方法，步骤如下：
（1）将经过挑选的黄芪种子灭菌处理后诱导无菌苗；
（2）将无菌苗的叶、根和茎转接至添加植物激素的MS培养基上，诱导愈伤组织；
（3）挑选出颜色最深、生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得米黄色、增殖快、性状稳定的黄芪毛状根A；
（4）将黄芪毛状根A置于18~21℃培育18~24d，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最深、性状最好的黄芪毛状根，逐步将温度提高培养，直至23~27℃，挑选获得黄芪毛状根B；
（5）将黄芪毛状根B进行大规模的气升式液体培养，收集烘干即为富含黄酮的黄芪毛状根。
进一步的，步骤（1）具体步骤为：用质量浓度为75%的乙醇溶液浸泡黄芪种子30~40s，然后无菌水洗涤2~3遍，再用质量浓度为0.1%的氯化汞溶液浸泡15~20min，无菌水清洗3~5遍，接种于MS固体培养基上，进行光照培养得到无菌苗，光照条件为2000~3000Lux，12~16h/d。
进一步的，步骤（2）具体步骤为：将步骤（1）所得无菌苗的叶、根和茎接种于添加了0.3~1.5mg/L 6-BA和0.5~1.5mg/L NAA的MS固体培养基上，避光培养。
进一步的，步骤（3）和步骤（4）中所述筛选培养基均为添加了0.3~1.5mg/L 6-BA和0.5~1.5mg/L NAA的MS固体/液体培养基。
进一步的，步骤（3）和步骤（4）中所述培养时光照条件均为2000~3000Lux，12h/d。
进一步的，步骤（3）和步骤（4）采用筛选培养基进行继代培养时，采用固体培养和液体悬浮培养交叉进行培养。
进一步的，步骤（5）具体步骤为：将黄芪毛状根B进行大规模的气升式培养，气升式培养基为添加了3/4MS液体培养基，光照条件为2000~3000Lux，12h/d，充气量为0.2L/min；然后收集培养物在60-80℃下烘干12-20h，即得到黄芪毛状根。
进一步的，上述MS液体/固体培养基中加入了22~25g/L蔗糖和5.4~5.7g/L琼脂。
本发明的有益效果：本发明改变了培养基和培养温度，筛选出稳定增殖、性状稳定、黄芪毛状根，使用固体培养、液体悬浮培养和气升式培养大规模生产黄芪毛状根。本发明可在保证黄酮含量的基础上，稳定高产黄芪毛状根，并有生产周期短、生产品质统一、适应常温生长条件的优点。
附图说明
图1是种子在固体培养基上培育诱导原生细胞团图。
图2是原生细胞团分化出毛状根生长图。
图3是毛状根液体培养基中生长图。
图4是批量毛状根液体培养基生长图。
图5是烘干后的黄芪毛状根。
具体实施方式
实施例1
（1）使用黄芪种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；灭菌步骤包括，用75%乙醇浸泡30s，无菌水洗涤2遍，0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水清洗3遍，接种于MS固体培养基上，光照2000Lux，12h/d。
（2）将无菌苗（叶、根、茎）转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；诱导培养基为0.4mg/L 6-BA+0.8mg/LNAA+MS+200g/蔗糖+5.6g/L琼脂，培养条件是光照2000Lux，12h/d。
（3）挑选出颜色为深米黄色，生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得米黄色、增殖快、性状稳定的黄芪毛状根A；筛选培养基为0.4mg/L 6-BA+0.8mg/LNAA+MS+200g/蔗糖+5.6g/琼脂，培养条件是光照2000Lux， 12h/d。
（4）将黄芪毛状根A置于18℃培育20天，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最深、性状最好的黄芪毛状根，每隔1个月温度提高3℃培养，直至24℃，挑选获得黄芪毛状根B。
（5）将黄芪毛状根B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的黄芪毛状根。气升式培养基为3/4MS+250g/L蔗糖，2000Lux，12h/d，充气量为0.2L/min。
实施例2
（1）使用黄芪种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；灭菌步骤包括，用75%乙醇浸泡30s，无菌水洗涤3遍，0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水清洗5遍，接种于MS固体培养基上，光照3000Lux，10h/d。
（2）将无菌苗（叶、根、茎）转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；诱导培养基为1.3mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+MS+250g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养条件是光照3000Lux，10h/d。
（3）挑选出颜色最深、接近米黄色，生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得米黄色、增殖快、性状稳定的黄芪毛状根A；筛选培养基为1.3mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA+MS+250g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养条件是光照3000Lux，10h/d。
（4）将黄芪毛状根A置于20度培育15天，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最深、性状最好的黄芪毛状根，每隔1个月温度提高3度培养，直至26度，挑选获得黄芪毛状根B。
（5）将黄芪毛状根B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的黄芪毛状根。气升式培养基为3/4MS+250g/L蔗糖，3000Lux，10h/d，充气量为0.2L/min。
实施例3
（1）使用黄芪种子经过灭菌处理后诱导无菌苗；灭菌步骤包括，用75%乙醇浸泡30s，无菌水洗涤2遍，0.1%氯化汞溶液浸泡15min，无菌水清洗4遍，接种于MS固体培养基上，光照3000Lux，11h/d。
（2）将无菌苗（叶、根、茎）转接至MS添加植物激素的培养基上，诱导愈伤组织；诱导培养基为1mg/L 6-BA+1.5mg/LNAA+MS+250g/L蔗糖+5.8g/L琼脂，培养条件是光照2800Lux，11h/d。
（3）挑选出颜色最深、接近紫红色，生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得紫色、增殖快、性状稳定的黄芪毛状根A；筛选培养基为1mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+MS+230g/L蔗糖+5.8g/L琼脂，培养条件是光照2500Lux，11h/d。
（4）将黄芪毛状根A置于13度培育18天，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最深、性状最好的黄芪毛状根，每隔1个月温度提高2度培养，直至24度，挑选获得黄芪毛状根B。
（5）将黄芪毛状根B进行大规模的气升式培养，收集烘干即为富含黄酮的黄芪毛状根。气升式培养基为3/4MS+250g/L蔗糖，2800Lux，12h/d，充气量为0.2L/min。
生长过程具体如图1-5所示，其中，图1为种子在固体培养基上培育诱导原生细胞团图，图2为生细胞团分化出毛状根，在固体培养基中稳定生长示意图，图3为毛状根转接到液体培养基中继续生长示意图，图4为批量稳定生长中的液体培养基中的毛状根示意图，图5为烘干后的黄芪毛状根示意图。

Claims (8)

1.一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是步骤如下：
（1）将经过挑选的黄芪种子灭菌处理后诱导无菌苗；
（2）将无菌苗的叶、根和茎转接至添加植物激素的MS培养基上，诱导愈伤组织；
（3）挑选出颜色最深、生长良好的愈伤组织，在筛选培养基上继代培养，获得米黄色、增殖快、性状稳定的黄芪毛状根A；
（4）将黄芪毛状根A置于18~21℃培育18~24d，在筛选培养基上多次继代，不断挑选颜色最深、性状最好的黄芪毛状根，逐步将温度提高培养，直至23~27℃，挑选获得黄芪毛状根B；
（5）将黄芪毛状根B进行大规模的气升式液体培养，收集烘干即为富含黄酮的黄芪毛状根。
2.如权利要求1所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是步骤（1）具体步骤为：用质量浓度为75%的乙醇溶液浸泡黄芪种子30~40s，然后无菌水洗涤2~3遍，再用质量浓度为0.1%的氯化汞溶液浸泡15~20min，无菌水清洗3~5遍，接种于MS固体培养基上，进行光照培养得到无菌苗，光照条件为2000~3000Lux，12~16h/d。
3.如权利要求1所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是步骤（2）具体步骤为：将步骤（1）所得无菌苗的叶、根和茎接种于添加了0.3~1.5mg/L 6-BA和0.5~1.5mg/L NAA的MS固体培养基上，避光培养。
4.如权利要求1所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是：步骤（3）和步骤（4）中所述筛选培养基均为添加了0.3~1.5mg/L 6-BA和0.5~1.5mg/L NAA的MS固体/液体培养基。
5.如权利要求1所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是：步骤（3）和步骤（4）中所述培养时光照条件均为2000~3000Lux，12h/d。
6.如权利要求4所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是：步骤（3）和步骤（4）采用筛选培养基进行继代培养时，采用固体培养和液体悬浮培养交叉进行培养。
7.如权利要求1所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是步骤（5）具体步骤为：将黄芪毛状根B进行大规模的气升式培养，气升式培养基为添加了3/4MS液体培养基，光照条件为2000~3000Lux，12h/d，充气量为0.2L/min；然后收集培养物在60-80℃下烘干12-20h，即得到黄芪毛状根。
8.如权利要求1-7之一所述大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征是：所述MS液体/固体培养基中加入22~25g/L蔗糖、5.4~5.7g/L琼脂。
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