CN1653887A - 黄芪不定根组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪不定根组织培养方法,属于中药黄芪组织培养领域。本发明首先采用70%~75%乙醇(V/V)、2%次氯酸钠(V/V)浸泡黄芪种子以消毒灭菌,并接种于MS培养基中培养诱导无菌芽;然后将切下的子叶和芽转到含不同植物生长调节剂的MS培养基中诱导愈伤组织;之后将愈伤组织转到附加吲哚丁酸和激动素的MS培养基中诱导不定根;最后将不定根转接到含相同植物生长调节剂的液体培养基中培养,其生长速度更快。本发明具有过程简单,诱导率高,不定根增殖快等特点。
Description
技术领域:
本发明公开了一种黄芪不定根组织培养方法,属于中药黄芪组织培养领域。
背景技术:
黄芪是豆科黄芪属多年生草本植物,主根入药。黄芪为中药上品,药用历史悠久,临床应用十分广泛。现代药理研究表明,黄芪具有补气固表,利尿脱毒,敛疮生肌,益气补中之功效,可促进机体的体液免疫和细胞免疫。目前随着保健药日益畅销,黄芪的用药量越来越大,天然资源甚感缺乏,加之黄芪用种子繁殖从播种到收获一般要4~5年,而且出苗率很低(30%~40%),病虫害影响严重,使品质和产量均有所下降。利用组织培养方法生产黄芪的有用物质具有很大的发展前景,不仅解决国内外市场之需求,而且也是药材生产的根本性变革。黄芪不定根培养具有生长速率快、含量稳定等优点,具有很好的经济效益和社会效益,而目前尚未见到这方面的有关报道。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种黄芪不定根组织培养的方法。该方法快速可行,可以提供均一的培养物。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。由黄芪种子出发诱导黄芪不定根的方法,其特征在于包括以下过程:将黄芪的种子用70%~75%的乙醇(V/V)浸泡20~30秒后,用无菌水冲洗2~4次后,再用2%次氯酸钠溶液浸泡15~20分钟,然后用无菌水冲洗3~5次,将其接种于不加任何激素的MS培养基中发芽,待无菌芽长到1.0~1.5cm时将芽和子叶分别切下,转接到含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1~4mg/L、α-萘乙酸(NAA)1~4mg/L、6-苄基氨基嘌呤(BA)0~2mg/L的MS培养基中培养,培养17~25天后将形成的愈伤组织切成小块,转接到含有吲哚丁酸(IBA)1~4mg/L、BA 0~2mg/L的MS固体培养基中,经过15~20天的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长18~21天的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
本发明利用生物技术培养黄芪不定根,其生长速率要比原根快得多,并且与细胞培养相比活性次生代谢产物的产率高且比较稳定,为黄芪“GMP”式工业化生产奠定方法基础。
具体实施方式:
实例一:
将内蒙黄芪(购自内蒙古黄芪生产基地)的种子用自来水冲洗干净后,用75%的乙醇浸泡20s,然后无菌水冲洗2~4次,再用2%的次氯酸钠溶液浸泡15min,用无菌水冲洗3~5次后,把种子接种于无激素MS培养基中,培养4d,待芽长到1.0~1.5cm后,将其根中部切成0.5cm的小段,转接到含有2,4-D 1mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基上,20d后将形成的愈伤组织再切成小块,转接到附加IBA 2mg/L和BA 0.2mg/L的MS固体培养基中培养,经过20d的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长20d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
实例二:
将黄芪的种子用自来水冲洗干净后,用72%的乙醇浸泡30s,然后用无菌水冲洗2~4次,再用2%的次氯酸钠溶液浸泡20min,用无菌水冲洗3~5次后,把种子接种于无激素MS培养基中,培养4d,待芽长到1.0~1.5cm后,将其根尖切成0.3cm的小段,转接到附加NAA 1mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基上,18d后将形成的愈伤组织再切成小块,转接到附加IBA 2mg/L和BA0.2mg/L的MS固体培养基中培养,经过18d的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长21d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
实例三:
将黄芪的种子用自来水冲洗干净后,用71%的乙醇浸泡25s,然后用无菌水冲洗2~4遍,再用2%的次氯酸钠溶液浸泡17min,用无菌水冲洗3~5次后,把种子接种于无激素MS培养基中,培养4d,待芽长到1.0~1.5cm后,将其根顶端切成0.4cm的小段,转接到添加NAA 4mg/L的MS固体培养基上,17d后将形成的愈伤组织再切成小块,转接到含有IBA 1mg/L和BA 0.1mg/L的MS固体培养基中培养,经过19d的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长18d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
实例四:
将黄芪的种子用自来水冲洗干净后,用73%的乙醇浸泡23s,然后用无菌水冲洗2~4遍,再用2%的次氯酸钠溶液浸泡19min,用无菌水冲洗3~5次后,把种子接种于MS培养基中,培养3d,待芽长到1.0~1.5cm后,将其子叶切下,转接到添加2,4-D 3mg/L的MS固体培养基上,25d后将形成的愈伤组织再切成小块,转接到添加IBA 2mg/L的MS固体培养基中培养,经过20d的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长21d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
实例五:
将黄芪的种子用自来水冲洗干净后,用70%的乙醇浸泡30s,然后用无菌水冲洗2~4遍,再用2%的次氯酸钠溶液浸泡20min,用无菌水冲洗3~5次后,把种子接种于无激素MS培养基中,培养3d,待芽长到1.0~1.5cm后,将其根中部切成0.7cm的小段,转接到附加NAA 2mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基上,19d后将形成的愈伤组织再切成小块,转接到附加IBA 2mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基中培养,经过16d左右的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长19d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
Claims (1)
1.一种黄芪不定根组织培养方法,其特征在于包括以下过程:
将黄芪的种子用70%~75%的乙醇浸泡20~30秒后,用无菌水冲洗2~4次后,再用2%次氯酸钠溶液浸泡15~20分钟,然后用无菌水冲洗3~5次,将其接种于不加任何激素的MS培养基中发芽;待无菌芽长到1.0~1.5cm时将芽和子叶分别切下,转接到含有2,4-二氯苯氧乙酸1~4mg/L、α-萘乙酸1~4mg/L、6-苄基氨基嘌呤0~2mg/L的MS培养基中培养;培养17~25天后将形成的愈伤组织切成小块,转接到含有吲哚丁酸1~4mg/L、BA 0~2mg/L的MS固体培养基中,经过15~20天的培养即有绒毛状的不定根生成,之后不定根继续生长,将生长18~21天的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养,其生长速度更快。
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