CN111296288B - 一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用 - Google Patents

一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用，选用黄芪种子萌发制备无菌黄芪苗，然后用无菌黄芪苗进行后续的愈伤组织培养，无需另外消毒，因为不受消毒剂的影响，所产生的愈伤组织活力强，可长期继代；同时，黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养，均可以获得90％以上的诱导率；在黄芪愈伤组织诱导培养基中施加活性炭和中药提取液，能够明显提高诱导率，并通过愈伤组织中黄芪甲苷的含量。所述方法具有诱导率高，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，培养周期短，黄芪甲苷含量高，操作简单，并能有效阻止褐化的优点。

Description

一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用。
背景技术
黄芪属于豆科多年生草本植物，以根入药，迄今已有2000多年的历史。黄芪的主要药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效，主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷，有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效，是一种常用中草药。
随着人们日益增长的保健观念的强化，黄芪的需求量将会逐年增加，但目前黄芪的野生资源逐年减少，栽培品种下降且面临农药污染和重金属残留等问题的困扰。因此应用现代生物技术提高黄芪的产量，改善其品质，探索工业化生产的可行途径对黄芪的生产具有重要意义，黄芪甲苷是中国药典规定的含测指标，如果能寻找到提高黄芪甲苷含量的人工黄芪产品，将具有良好的开发和应用前景。
数年来，我国科技工作者在黄芪育苗繁殖技术方面做了大量的富有成效的工作，为黄芪良种化栽培奠定了基础。然而，黄芪繁殖采用直播和育苗技术，由于黄芪种子具有硬实性导致存在种子繁殖出苗率低，育苗移栽繁殖周期长，苗木繁殖系数低等问题。为了解决这一问题，采用组织培养方法，不仅可以缩短人工栽培黄芪周期，而且可大量繁殖黄芪幼苗，从而实现黄芪种苗规模化生产。
目前，关于黄芪的组织培养研究报道较多，但是关于用无菌苗进行黄芪离体快速繁殖，、抑制组织培养过程中的褐化问题，以及如何提高组织培养的黄芪中黄芪甲苷的含量等方面的研究比较少。
发明内容
本发明为了解决现有技术的不足，提供一种黄芪愈伤组织的培养方法及其应用，所述方法具有诱导率高，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，培养周期短，黄芪甲苷含量高，操作简单，并能有效阻止褐化的优点。
本发明为了解决上述问题，采用的技术方案是：提供一种黄芪愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
步骤1.黄芪无菌苗的制备
将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入75％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；
步骤2.愈伤组织的诱导培养
将步骤1的黄芪无菌苗切成0.5～1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养10～20d，
所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.5～1.0mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.2～0.6mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，活性炭的质量浓度1-3mg/L，中药提取液10-20g/L，pH为5.8-6.2；
步骤3.愈伤组织的快速培养
将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养10-15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2～3.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度1～3.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，pH值调节为5.8～6.2。
进一步，所述步骤2中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1～0.3g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0～6.0g/L。
进一步，所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种；
进一步，所述步骤2中选择黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养；
进一步，所述MS培养基的每升的组成如下：
大量元素：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO40.8-1.2mM，
微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；
有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM；
进一步，所述步骤2中的中药提取液的制备方法为：按照重量配比5:2:1:1取黄芪、人参、茯苓、罗汉果，加入3-5倍水进行煎煮，过滤后将滤液冻干为粉；精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。
进一步，所述活性炭的粒径为200-400nm。
进一步，本发明的技术方案还包括黄芪愈伤组织的应用，优选提取黄芪愈伤组织中的黄芪甲苷。其中，所述提取黄芪愈伤组织中黄芪甲苷的方法可以是本领域中的常规提取方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明选择由黄芪种子萌发制备无菌黄芪苗，然后用无菌黄芪苗进行后续的愈伤组织培养，无需另外消毒，因为不受消毒剂的影响，所产生的愈伤组织活力强，可长期继代；
(2)本发明选择黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养，均可以获得90％以上的诱导率，同时，在愈伤组织诱导培养基中添加抗氧剂能有效抑制愈伤组织的褐化问题。
(3)本发明在黄芪愈伤组织诱导培养基中施加活性炭和中药提取液，能够明显提高诱导率，并通过愈伤组织中黄芪甲苷的含量。
(4)本发明提供的黄芪愈伤组织的培养方法具有诱导率高，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，培养周期短，黄芪甲苷含量高，操作简单，并能有效阻止褐化的优点。
附图说明
图1是本发明黄芪无菌苗茎切块愈伤组织的生长图
图2是本发明黄芪无菌苗叶片切块愈伤组织的生长图
图3是本发明黄芪无菌胚轴切块愈伤组织的生长图
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
制备MS培养基，所述MS培养基每升的组成如下：
大量元素：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO40.8-1.2mM，
微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；
有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM。
制备中药提取液的方法如下：按照重量配比5:2:1:1取黄芪、人参、茯苓、罗汉果，加入3-5倍水进行煎煮，过滤后将滤液冻干为粉；精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。
不同培养基对黄芪愈伤组织的诱导
(1)黄芪无菌苗的制备：将黄芪种子用自来水浸泡24h后，放入75％乙醇中浸泡3min，用无菌水冲洗5遍；倒入1％升汞溶液浸泡10min；用无菌水冲洗5遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25℃，湿度60％培养，获得黄芪无菌苗；
(2)在无菌条件下，将黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴切割成0.6cm小块后分别接种在添加不同生长激素的培养基上培养，每瓶10块，每组3瓶，20d后计算愈伤组织诱导率，诱导率(％)＝产生愈伤组织的块数/总块数×100％。
表1
序号 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 中药提取液(g/L) 诱导率
1 0.5 0.2 10 96.7
2 0.7 0.2 10 100
3 1.0 0.2 10 93.3
4 0.8 0.2 20 93.3
5 0.8 0.4 20 100
6 0.8 0.6 20 96.7
7 1.0 0.4 10 96.7
8 1.0 0.4 20 100
9 1.0 0.4 30 93.3
从表1的结果可以看到，愈伤组织诱导培养基中6-BA、NAA和中药提取液的不同培养能够影响愈伤组织的诱导率，经试验可以发现，序号2、5和8的愈伤组织诱导培养基具有最高的诱导率。
实施例1
一种黄芪愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
步骤1.黄芪无菌苗的制备
将蒙古黄芪种子用自来水浸泡24h后，放入75％乙醇中浸泡3min，用无菌水冲洗5遍；倒入1％升汞溶液浸泡10min；用无菌水冲洗5遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25℃，湿度60％培养，获得黄芪无菌苗；
步骤2.愈伤组织的诱导培养
将步骤1的黄芪无菌苗的茎切成1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养20d，
所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.7mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.2mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度10g/L，活性炭的质量浓度2mg/L，中药提取液10g/L，pH为5.8；
步骤3.愈伤组织的快速培养
将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度2mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度8g/L，柠檬酸质量浓度0.8g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.3g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L，pH值调节为5.8。
图1是实施例1所述黄芪愈伤组织的生长图，其中，A是茎切块，B是茎切块愈伤组织。
实施例2
一种黄芪愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
步骤1.黄芪无菌苗的制备
将膜荚黄芪种子用自来水浸泡24h后，放入75％乙醇中浸泡3min，用无菌水冲洗5遍；倒入1％升汞溶液浸泡10min；用无菌水冲洗5遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25℃，湿度60％培养，获得黄芪无菌苗；
步骤2.愈伤组织的诱导培养
将步骤1的黄芪无菌苗的叶片切成0.6cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养20d，
所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.8mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.4mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度10g/L，活性炭的质量浓度2mg/L，中药提取液20g/L，pH为6.0；
步骤3.愈伤组织的快速培养
将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度2mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度8g/L，柠檬酸质量浓度0.7g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.3g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L，pH值调节为5.8。
图2是实施例2所述黄芪愈伤组织的生长图，其中，A是叶片切块，B是叶片切块愈伤组织。
实施例3
一种黄芪愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
步骤1.黄芪无菌苗的制备
将蒙古黄芪种子用自来水浸泡23h后，放入75％乙醇中浸泡2min，用无菌水冲洗5遍；倒入1％升汞溶液浸泡10min；用无菌水冲洗5遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25℃，湿度60％培养，获得黄芪无菌苗；
步骤2.愈伤组织的诱导培养
将步骤1的黄芪无菌苗的胚轴切成1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养20d，
所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度1mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.4mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度10g/L，活性炭的质量浓度2mg/L，中药提取液20g/L，pH为5.8；
步骤3.愈伤组织的快速培养
将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度2mg/L、蔗糖质量浓度45g/L、琼脂质量浓度8g/L，柠檬酸质量浓度0.8g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.2g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度6.0g/L，pH值调节为5.8。
图3是实施例3所述黄芪愈伤组织的生长图，其中，A是胚轴切块，B是胚轴切块愈伤组织。
对比例1
步骤2中的愈伤组织诱导培养基不含中药提取液，其余步骤与实施例1完全一致。
愈伤组织中黄芪甲苷的测定：采用HPLC，按照参考中华药典2015版本测试条件检测实施例1-3，以及对比例1中黄芪甲苷的含量，相关实验结果见表2：
表2：
编号 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
黄芪甲苷含量(mg/g) 2.23 2.25 2.30 1.59
从表2的结果来看，本发明制备得到的黄芪愈伤组织中含有较高的黄芪甲苷含量，且添加中药提取液后，能提高黄芪甲苷的含量。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1.黄芪无菌苗的制备
将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入75％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；
步骤2.愈伤组织的诱导培养
将步骤1的黄芪无菌苗切成0.5～1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养10～20d，
所述愈伤组织诱导培养基： MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.5～1.0mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.2～0.6mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，活性炭的质量浓度1-3mg/L，中药提取液10-20g/L，pH为5.8-6.2；
其中MS培养基含有大量元素：KNO3 4-6mM，Ca（ NO3) 2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM，微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM；
其中制备中药提取液的方法如下：按照重量配比5： 2： 1： 1取黄芪、人参、茯苓、罗汉果，加入3-5倍水进行煎煮，过滤后将滤液冻干为粉；精确称取100 mg冻干粉，加入1mL PBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10 min，取上清液过滤，分装并-20℃保存；
步骤3.愈伤组织的快速培养
将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养10-15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2～3.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度1～3.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，pH值调节为5.8～6.2。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种。
3.根据权利要求1所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述步骤2中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1～0.3g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0～6.0g/L。
4.根据权利要求1所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述步骤2中选择黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养。
5.根据权利要求1所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述活性炭的粒径为200-400nm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法制备的黄芪愈伤组织的应用，其特征在于：提取黄芪愈伤组织中的黄芪甲苷。
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