CN111296261B - 一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗方法 - Google Patents

一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，通过黄芪种子进行碱性溶液浸泡、和高浓度乙醇浸泡，并超声处理进而提高黄芪种子的萌芽率，使得幼苗生命力强；且通过施加5‑8％的次氯酸钠溶液或1％的升汞溶液，以及选用无菌水，和对培养基进行灭菌处理，提供一种无菌的生长环境，极大了提高了幼苗的成活率；同时，通过在黄芪种子发芽，以及幼苗生长的不同阶段施加不同的MS培养基，特别时在幼苗生长阶段施加N元素和微量有机物质(肌醇)，极大的提高了黄芪甲苷的含量。

Description

一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗方法
技术领域
本发明涉及一种植物育苗的方法，具体涉及一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗方法，属于植物栽培技术领域。
背景技术
黄芪属于豆科多年生草本植物，以根入药。黄芪的主要药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效，主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷，有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效，是一种常用中草药。国内市场对黄芪的需求极大，主要用于生产黄芪饮片以及中成药和提取物及制剂。
近年来，黄芪产业化种植规模逐年扩大，但是黄芪育苗规模及技术严重滞后，还停留在传统粗放的原始育苗和种植阶段，而在人工栽培黄芪的过程中，育苗的培养直接影响到后期黄芪药材的收率和品质。但是，育苗过程中黄芪种子发芽率很低，不预处理的黄芪种子发芽率仅在15％左右，主要是因为种皮外的致密细胞层和果胶类物质，使黄芪种子通透性差，种芽透壳困难；而且成熟度越好的种子，表面釉质层越厚，如果处理不当，其发芽率很难超过50％。目前黄芪育苗企业常使用60-70℃温水浸泡24小时的做法，虽然可以提高发芽率，有的能达到90％左右，但是出苗时间参差不齐，一般要30-50天才能达到90％左右的出苗率。
因此，对黄芪种子萌发条件的研究是黄芪规范化栽培的前提工作，在黄芪栽培生产中有着十分重要的意义，同时种子萌芽只是第一步，种子萌芽后，对于育苗的培育也极为重要，经过好的培育得到的育苗在一再过程中成活率有显著提高。由于生产需要通常采用“连茬”栽植，因此不得不大量使用化肥和农药，导致土壤微生态严重破坏、品质退化、“农残”超标。
基于上述存在的问题，本发明开发一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，通过本发明的方法使得黄芪种子萌芽率高、育苗生命力强、移栽成活率高，且高的黄芪甲苷含量更具有较大的市场应用价值。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，从而提高黄芪种子的萌芽率，使得幼苗生命力强，移栽成活率高，并且具有高的黄芪甲苷含量。
为实现上述目的，本发明提供一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，包括以下步骤：
(1)取适量黄芪种子，加入2-4倍重的水，调节pH值至10-12，室温处理30-60min后，将水倒掉留下种子；
(2)向步骤(1)中的黄芪种子加入浓度60-75％的乙醇溶液，超声处理时间40-60s后；用水清洗3-5遍；
(3)向步骤(2)中的黄芪种子加入2-4倍重的5-8％的次氯酸钠溶液或1％的升汞溶液浸泡8-15min后，用水清洗3-5遍后沥干；
(4)将步骤(3)中的黄芪种子放入第一MS培养基中进行培养，培养温度为20-30℃，湿度50-60％，培养8-12天进行萌芽，间隔4-6天更换第一MS培养基；
所述第一MS培养基的每升含有如下重量的组分：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM，H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na40-60μM；
(5)将步骤(4)中的发芽黄芪种子加入第二MS培养基继续培养，培养温度为20-30℃，湿度50-60％，间隔4-6天更换第二MS培养基，继续培养获得高黄芪甲苷含量的黄芪幼苗；
所述第二MS培养基的每升含有如下重量的组分：NH4NO3 5-8mM，KCl 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM，H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM，肌醇80-100μM。
进一步，所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子或膜荚黄芪种子，所述水为灭菌自来水；所述步骤(1)中加入氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和/碳酸钾的一种或多种调节pH；
进一步，所述第一MS培养基和第二MS培养基进行预先灭菌处理，所述灭菌处理为加常规加压高温处理；
进一步，所述步骤(5)中继续培养时间为40-120天。
本发明具有以下有益效果：
(1)具有高的萌芽率：本发明通过将黄芪种子进行碱性溶液浸泡、和高浓度乙醇浸泡，并超声处理，使得种皮外的致密细胞层和果胶类物质发生变性，提高通透性，在培养当天即可发芽，在8-12天时萌芽率可达97％以上；
(2)具有高的幼苗成活率：本发明通过施加高浓度乙醇、以及5-8％的次氯酸钠溶液或1％的升汞溶液，以及选用无菌水，和对培养基进行灭菌处理，提供一种无菌的生长环境，极大了提高了幼苗的成活率，防止细菌的污染；
(3)具有高的黄芪甲苷含量：本发明通过在黄芪种子发芽，以及幼苗生长的不同阶段施加不同的MS培养基，特别时在幼苗生长阶段施加N元素和微量有机物质(肌醇)，极大的提高了黄芪甲苷的含量。
附图说明
图1是蒙古黄芪种子在不同培养时间的生长照片。
图2是膜荚黄芪种子在不同培养时间的生长照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，包括以下步骤：
(1)取适量蒙古黄芪种子，加入4倍重的水，加入适量氢氧化钠调节pH值至12，室温处理60min后，将水倒掉留下种子；
(2)向步骤(1)中的黄芪种子加入浓度70％的乙醇溶液，超声处理时间40s后；用水清洗5遍；
(3)向步骤(2)中的黄芪种子加入4倍重的8％的次氯酸钠溶液浸泡15min后，用水清洗5遍后沥干；
(4)将步骤(3)中的黄芪种子放入第一MS培养基中进行培养，培养温度为20℃，湿度60％，培养12天进行萌芽，间隔4天更换第一MS培养基；
所述第一MS培养基的每升含有如下重量的组分：KNO3 5mM，Ca(NO3)2·4H2O 5mM，MgSO4·7H2O 2mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 9μM，ZnSO4·7H2O 0.76μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 50μM；
(5)将步骤(4)中的发芽黄芪种子加入第二MS培养基继续培养，培养温度为25℃，湿度60％，间隔4天更换第二MS培养基，继续培养至120天，获得高黄芪甲苷含量的黄芪幼苗；
所述第二MS培养基的每升含有如下重量的组分：NH4NO3 8mM，KCl 6mM，Ca(NO3)2·4H2O 5mM，MgSO4·7H2O 2mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 9μM，ZnSO4·7H2O0.76μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 50μM，肌醇100μM。
实施例2
一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，包括以下步骤：
(1)取适量膜荚黄芪种子，加入3倍重的水，加入适量氢氧化钾调节pH值至11，室温处理50min后，将水倒掉留下种子；
(2)向步骤(1)中的黄芪种子加入浓度70％的乙醇溶液，超声处理时间60s后；用水清洗5遍；
(3)向步骤(2)中的黄芪种子加入4倍重的1％的升汞溶液浸泡15min后，用水清洗5遍后沥干；
(4)将步骤(3)中的黄芪种子放入第一MS培养基中进行培养，培养温度为20℃，湿度50％，培养12天进行萌芽，间隔4天更换第一MS培养基；
所述第一MS培养基的每升含有如下重量的组分：KNO3 5mM，Ca(NO3)2·4H2O 5mM，MgSO4·7H2O 2mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 9μM，ZnSO4·7H2O 0.76μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 50μM；
(5)将步骤(4)中的发芽黄芪种子加入第二MS培养基继续培养，培养温度为25℃，湿度50％，间隔4天更换第二MS培养基，继续培养至120天，获得高黄芪甲苷含量的黄芪幼苗；
所述第二MS培养基的每升含有如下重量的组分：NH4NO3 8mM，KCl 6mM，Ca(NO3)2·4H2O 5mM，MgSO4·7H2O 2mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 9μM，ZnSO4·7H2O0.76μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 50μM，肌醇90μM。
实施例3
一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，包括以下步骤：
(1)取适量蒙古黄芪种子，加入3倍重的水，加入适量氢氧化钠调节pH值至10，室温处理40min后，将水倒掉留下种子；
(2)向步骤(1)中的黄芪种子加入浓度60％的乙醇溶液，超声处理时间40s后；用水清洗4遍；
(3)向步骤(2)中的黄芪种子加入4倍重的8％的次氯酸钠溶液浸泡10min后，用水清洗4遍后沥干；
(4)将步骤(3)中的黄芪种子放入第一MS培养基中进行培养，培养温度为25℃，湿度55％，培养8天进行萌芽，间隔4天更换第一MS培养基；
所述第一MS培养基的每升含有如下重量的组分：KNO3 6mM，Ca(NO3)2·4H2O 6mM，MgSO4·7H2O 2.5mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 8μM，ZnSO4·7H2O 0.76μM，CuSO4·5H2O 0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 40μM；
(5)将步骤(4)中的发芽黄芪种子加入第二MS培养基继续培养，培养温度为25℃，湿度55％，间隔4天更换第二MS培养基，继续培养至120天，获得高黄芪甲苷含量的黄芪幼苗；
所述第二MS培养基的每升含有如下重量的组分：NH4NO3 7mM，KCl 6mM，Ca(NO3)2·4H2O 5mM，MgSO4·7H2O 2mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 9μM，ZnSO4·7H2O0.76μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 50μM，肌醇100μM。
实施例4
一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，包括以下步骤：
(1)取适量膜荚黄芪种子，加入3倍重的水，加入适量氢氧化钾调节pH值至12，室温处理50min后，将水倒掉留下种子；
(2)向步骤(1)中的黄芪种子加入浓度60％的乙醇溶液，超声处理时间50s后；用水清洗5遍；
(3)向步骤(2)中的黄芪种子加入4倍重的1％的升汞溶液浸泡15min后，用水清洗5遍后沥干；
(4)将步骤(3)中的黄芪种子放入第一MS培养基中进行培养，培养温度为20℃，湿度56％，培养12天进行萌芽，间隔4天更换第一MS培养基；
所述第一MS培养基的每升含有如下重量的组分：KNO3 4mM，Ca(NO3)2·4H2O 6mM，MgSO4·7H2O 1.8mM，KH2PO4 0.9mM，H3BO3 47μM，MnCl2·4H2O 8μM，ZnSO4·7H2O 0.76μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.2μM，EDTA-Fe-Na 50μM；
(5)将步骤(4)中的发芽黄芪种子加入第二MS培养基继续培养，培养温度为25℃，湿度56％，间隔4天更换第二MS培养基，继续培养至120天，获得高黄芪甲苷含量的黄芪幼苗；
所述第二MS培养基的每升含有如下重量的组分：NH4NO3 7mM，KCl 5mM，Ca(NO3)2·4H2O 4mM，MgSO4·7H2O 2mM，KH2PO4 1mM，H3BO3 46μM，MnCl2·4H2O 9μM，ZnSO4·7H2O0.66μM，CuSO4·5H2O 0.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.25μM，EDTA-Fe-Na 50μM，肌醇80μM。
对比例1
步骤(1)中不含用氢氧化钠调节pH值至12，其余步骤与实施例1完全相同；
对比例2
不含步骤(2)，其余步骤与实施例1完全相同；
对比例3
不施加第二MS培养基，一直使用第一MS培养基培养至120天，其余步骤与实施例1完全相同。
其中，萌芽率＝萌芽种子数/总种子数×100％，测试12天后萌芽率，相关实验结果见表1：
表1
编号 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2
萌芽率％ 100％ 100％ 98％ 97％ 80％ 86％
从表1的结果来看，本发明所述黄芪育苗方法具有高的萌芽率，12天后萌芽率达到了97％以上，而，不经预处理的对比例1和对比例2的萌芽率有明显降低。
采用HPLC，按照参考中华药典2015版本测试条件检测实施例1和对比例3，以及大田栽培的黄芪幼苗中黄芪甲苷的含量，相关实验结果见表2：
表2：
编号 实施例1 对比例3 大田
黄芪甲苷含量(mg/g) 1.86 1.57 1.45
从表2的结果来看，本发明所述黄芪育苗方法能够提高黄芪甲苷的含量，特别是在幼苗生长阶段施加N元素和微量有机物质(肌醇)，极大的提高了黄芪甲苷的含量。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取适量黄芪种子，加入2-4倍重的水，调节pH值至10-12，室温处理30-60min后，将水倒掉留下种子；(2)向步骤(1)中的黄芪种子加入浓度60-75％的乙醇溶液，超声处理时间40-60s后；用水清洗3-5遍；(3)向步骤(2)中的黄芪种子加入2-4倍重的5-8％的次氯酸钠溶液或1％的升汞溶液浸泡8-15min后，用水清洗3-5遍后沥干；(4)将步骤(3)中的黄芪种子放入第一MS培养基中进行培养，培养温度为20-30℃，湿度50-60％，培养8-12天进行萌芽，间隔4-6天更换第一MS培养基；所述第一MS培养基的每升含有如下重量的组分：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM，H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；(5)将步骤(4)中的发芽黄芪种子加入第二MS培养基继续培养，培养温度为20-30℃，湿度50-60％，间隔4-6天更换第二MS培养基，继续培养获得高黄芪甲苷含量的黄芪幼苗；所述第二MS培养基的每升含有如下重量的组分：NH4NO3 5-8mM，KCl 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM，H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM，肌醇80-100μM；所述步骤(5)中继续培养时间为40-120天。
2.根据权利要求1所述的一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，其特征在于：所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子或膜荚黄芪种子。
3.根据权利要求1所述的一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，其特征在于：所述水为灭菌自来水。
4.根据权利要求1所述的一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，其特征在于：所述步骤(1)中加入氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和/碳酸钾的一种或多种调节pH。
5.根据权利要求1所述的一种高黄芪甲苷含量的黄芪育苗的方法，其特征在于：所述第一MS培养基和第二MS培养基进行预先灭菌处理，所述灭菌处理为加常规加压高温处理。
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