CN105409774A - 一种罗汉果愈伤组织的诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗汉果愈伤组织的诱导方法：（1）暗培养；（2）光培养：转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600？lx；所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2？g/L、6-BA？1.0mg/L,pH6.5；所述复方中药提取液由黄芪，天山雪莲，党参，伸筋草，茯苓，葛根制成。光培养仅仅10天就得到黄白色愈伤组织，且长势良好，分化率高，具体而言是90%以上，而且愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98％以上。

Description

一种罗汉果愈伤组织的诱导方法

技术领域

本发明涉及一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，属于生物领域。

背景技术

罗汉果（Siraitiagrosvenorii）为多年生草质藤本宿茎植物，属葫芦科，其成熟果实具有清热、润肺止咳等功效，是我国特产的传统中药和广西特有的药用植物，原产于广西北部地区。罗汉果种苗主要采用块茎和压蔓进行无性繁殖，繁殖系数低。为了扩大罗汉果的繁殖，国内多家科研院所都在重点研究利用组培快繁方法作为罗汉果种苗繁育的主要手段。目前罗汉果茎段愈伤组织诱导所使用的激素主要有6-BA、IAA、NAA、IBA等。但是效果都不十分理想，诱导时间长，诱导率低，而且炼苗后存活率也不高。

本发明旨在提供一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以快速高效对罗汉果愈伤组织进行诱导，而且诱导率高，诱导时间短，炼苗后存活率也很高。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明针对背景技术存在的问题，提供一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以快速高效对罗汉果愈伤组织进行诱导，而且诱导率高，诱导时间短，炼苗后存活率也很高。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH5.8～6.0；

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5-6份黄芪，3-6份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

本发明首次将中草药萃取液用于一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其效果好，成本低。

中草药的配伍既可选择单味药，也可选择多味药组成的复方，但不是一些药物的简单粗制组合，无“法”无“方”无“配伍”，在理论联系实践基础上，考虑到现代药物本身的性能有选择地将药物配伍起来使用，充分发挥药物的整体作用。

本发明在传统中草药理论的基础上，通过大量实验得到一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在光培养仅仅10天就得到黄白色愈伤组织，且长势良好，分化率高，具体而言是90%以上，而且愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98％以上。

本发明的有益之处在于：

（1）本发明利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以可以在光培养仅仅10天就得到黄白色愈伤组织，且长势良好，分化率高，具体而言是90%以上。

（2）而且愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98％以上。

具体实施方式

实施例1：

罗汉果愈伤组织的诱导的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH5.8。

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份黄芪，3份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

结果：

在10天后，有100株分化成功（一共100株），其分化率高，愈伤组织生长旺盛。

愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98.0％以上。

实施例2：

罗汉果愈伤组织的诱导的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH6.0。

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份黄芪，6份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

结果：

在10天后，有90株分化成功（一共100株），其分化率高，愈伤组织生长旺盛。

愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98.0％以上。

实施例3：

罗汉果愈伤组织的诱导的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH5.9。

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份黄芪，4份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

结果：

在10天后，有95株分化成功（一共100株），其分化率高，愈伤组织生长旺盛。

愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98.0％以上。

实施例4：

罗汉果愈伤组织的诱导的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH6.0。

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份黄芪，5份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

结果：

在10天后，有91株分化成功（一共100株），其分化率高，愈伤组织生长旺盛。

愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98.0％以上。

实施例5：

罗汉果愈伤组织的诱导的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH5.8。

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份黄芪，3份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

结果：

在10天后，有99株分化成功（一共100株），其分化率高，愈伤组织生长旺盛。

愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98.0％以上。

可见，在传统中草药理论的基础上，通过大量实验得到一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在光培养仅仅10天就得到黄白色愈伤组织，且长势良好，分化率高，具体而言是90%以上，而且愈伤组织继代增殖分化出大量无根小苗,再诱导生根成苗,然后炼苗、田间移栽、成活率达98％以上。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种罗汉果愈伤组织的诱导方法，其特征在于，步骤如下：

（1）暗培养：

取健壮且无病虫害嫩梢，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；将灭菌好的茎段切成1cm带腋芽的小段，形态学上端朝上，形态学下端朝下，顶部尽量刚好与培养基表面接触，盖好瓶盖，放在恒温培养箱中进行暗培养，培养的温度为27℃，暗培养10天；

所述暗培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖13.5g/L、琼脂3.5g/L，pH5.8～6.0；

（2）光培养：

转入光培养基进行光培养，每天光照12h/d，光照强度2600lx；

所述光培养的培养基为：以MS为基础培养基，蔗糖12.8g/L、琼脂3.5g/L，复方中药提取液0.2g/L、6-BA1.0mg/L,pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取黄芪，天山雪莲，党参，伸筋草，茯苓，葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉；

精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。

2.权利要求1所述的罗汉果愈伤组织的诱导的方法，其特征在于：

取5-6份黄芪，3-6份天山雪莲，2份党参，1份伸筋草，2份茯苓，0.8份葛根，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，将药液冻干为粉。