KR20190086861A - 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스 - Google Patents

헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스 Download PDF

Info

Publication number
KR20190086861A
KR20190086861A KR1020180004924A KR20180004924A KR20190086861A KR 20190086861 A KR20190086861 A KR 20190086861A KR 1020180004924 A KR1020180004924 A KR 1020180004924A KR 20180004924 A KR20180004924 A KR 20180004924A KR 20190086861 A KR20190086861 A KR 20190086861A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
callus
acid
derived
plant
mass production
Prior art date
Application number
KR1020180004924A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102236425B1 (ko
Inventor
김현순
이형규
장지영
김미선
김차영
김혜란
문기범
박지선
암릿파우델
전재흥
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020180004924A priority Critical patent/KR102236425B1/ko
Publication of KR20190086861A publication Critical patent/KR20190086861A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102236425B1 publication Critical patent/KR102236425B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/10—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • A01H1/101—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine or caffeine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/002—Culture media for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/34—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • A01N43/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom six-membered rings
    • A01N43/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom six-membered rings condensed with carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스에 관한 것으로, 본 발명의 헐떡이풀의 뿌리에 소량 함유되어 있는 티아렐릭산은 우수한 천식효과, LTC4 생성 억제, 천식동물에서 IgE, IL-4, -5, -13 생성억제, 기도과민성 개선 효능이 입증된 우수한 천연신약 후보로, 본 발명을 통해 생물반응기내에서 식물전체, 식물조직 혹은 캘러스 유래 식물세포배양을 통하여 무한 증식 및 생산으로 식물자원 고갈 및 환경파괴없이 티아렐릭산의 공급이 가능하므로, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스{Method for producing callus mass-producing Tiarellic acid from Tiarella polyphylla and callus produced by the same method}
본 발명은 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스에 관한 것이다.
헐떡이풀(Tiarella polyphylla)은 범의귀과 (Saxifragaceae)의 헐떡이풀속 식물로서 한국, 중국, 일본 등에 분포하는 다년생 초본으로, 우리나라에서는 유일하게 울릉도에서만 자생하는 식물이다. 울릉도 지역 민간에서는 헐떡이풀 추출물을 "천식약풀"이라 하여 기침, 천식에 사용한 바 있으나 서식 분포가 제한적인 관계로 그리 널리 알려진 식물은 아니다. 헐떡이풀의 성분 및 활성에 관한 연구로는 항보체 활성을 나타낸 올레아놀릭산 배당체가 분리, 보고된 바 있고(Park SH et al., Arch. Pharm. Res., 22(4), pp428-431, 1999), 루판 골격의 트리테르페노이드 화합물로서 티아렐릭산 (tiarellic aicd), 코로솔릭산 (corosolic acid) 및 토르멘틱산 (tormentic acid) 등의 성분이 분리된 바 있으며 (Park SH et al., Arch. Pharm. Res., 25(1), pp57-60, 2002), 조직배양된 섬유아세포에 자외선 조사로 유도한 MMP-1의 발현 및 제1형 procollagen의 발현 억제활성 (Moon HI et al., J. Ethnopharmacol., 98, pp185-189, 2005)이 보고된 바 있다.
식물의 우수한 천연 활성소재를 발굴하여 기업화로 넘어가는 과정에서 소재의 대량 확보가 가장 중요한 관건인 경우가 많다. 예를 들어, 성장이 더딘 목본류, 시료 확보가 제한적인 목본류의 특정 기관 (예, 꽃 또는 뿌리), 몸체 (바이오매스)가 작은 초본류, 종자 확보나 발아가 어려운 소재, 재배시에 유효 성분이 달라지는 경우, 끝으로 활성은 매우 뛰어나나 체내 함량이 매우 적은 경우와 같이 소재의 대량 확보가 어려운 경우 이를 해결할 근본적인 방법이 필요하다. 이에 대한 근본적인 해결법으로 식물조직·세포배양 기술이 유일한 방법으로 주목받고 있다. 식물조직·세포배양 기반 천연 활성소재 대량생산은 자연에 서식하는 식물자원을 직접 채취·활용하는 것이 아니라 생물반응기내 식물전체, 식물조직(부정근, 모상근) 혹은 캘러스 유래 식물세포배양을 통하여 무한 증식, 생산하기 때문에 식물자원 고갈 및 환경파괴로부터 자유로울 수 있으며 보다 적극적인 자연환경 보존 수단으로 활용 가능하기 때문이다.
한편, 한국등록특허 제1163215호에서는 '헐떡이풀 추출물 또는 이로부터 분리된 트리테르펜화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0693400호에서는 '식물 세포 현탁 배양에 의한 코로솔릭산의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 헐떡이풀 식물체의 주로 뿌리에 들어있는 천연물 성분인 티아렐릭산(Tiarellic acid)을 식물세포배양법에 의해 대량생산하기 위해, 헐떡이풀 종자를 무균 기내 발아시켜 생육된 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리로부터 우수한 캘러스 세포를 유도하고자 오옥신과 사이토키닌이 적정 농도로 포함된 헐떡이풀 캘러스 세포배양용 고체배지를 사용하여 백색 혹은 연노란의 캘러스 세포를 유도하고 균질화된 상태로 만드는 계대배양 과정을 거친 후, 티아렐릭산 분석을 수행하여 가장 높은 함량을 보이는 캘러스를 최종 선발하였고, 상기 캘러스가 퇴화없이 지속적으로 유지배양되어 티아렐릭산의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체의 종자를 멸균시킨 후 발아 배지에서 발아시켜, 줄기, 잎 및 뿌리를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 줄기, 잎 및 뿌리 절편체를 생장조절물질이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 배양하여 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 각각 유도 및 증식시키는 단계;
(c) 상기 증식된 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 캘러스 증식 배지에 계대배양하여 각각 증식시키는 단계; 및
(d) 상기 계대배양하여 증식시킨 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 대상으로 티아렐릭산 함량을 각각 측정하여 티아렐릭산 생산성이 우수한 캘러스를 선발하는 단계를 포함하는 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산(Tiarellic acid) 대량 생산용 캘러스의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스(KCTC 18650P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스를 배양하여 티아렐릭산을 생산하는 단계를 포함하는 티아렐릭산의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 기본 배지를 유효성분으로 함유하는 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 헐떡이풀의 뿌리에 소량 함유되어 있는 티아렐릭산은 우수한 천식효과, LTC4 생성 억제, 천식동물에서 IgE, IL-4, -5, -13 생성억제, 기도과민성 개선 효능이 입증된 우수한 천연신약 후보로, 본 발명을 통해 생물반응기내에서 식물전체, 식물조직 혹은 캘러스 유래 식물세포배양을 통하여 무한 증식 및 생산으로 식물자원 고갈 및 환경파괴없이 티아렐릭산의 공급이 가능하므로, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 티아렐릭산(Tiarellic acid, 3,23-dihydroxy-20(29)-lupen-27-oic acid) 화학구조를 나타낸다.
도 2는 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D) 종자의 인 비트로(In vitro) 발아 및 성장을 나타낸다.
도 3은 농도별 TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 캘러스를 유도한 과정을 나타낸다. 배지 조성은 다음과 같다; TP1 (TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L), TP2 (TDZ 0.5 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L), TP3 (TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L), TP4 (TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 1.0 mg/L), TP5 (TDZ 0.5 mg/L + 피클로람 1.0 mg/L), TP6 (TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 1.0 mg/L), TP7 (TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L), TP8 (TDZ 0.5 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L), 및 TP9 (TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L)
도 4는 TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 캘러스를 유도한 결과를 나타낸다.
도 5는 티아렐릭산 표준물질의 HPLC 분석 피크를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D.) 식물체의 종자를 멸균시킨 후 발아 배지에서 발아시켜, 줄기, 잎 및 뿌리를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 줄기, 잎 및 뿌리 절편체를 생장조절물질이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 배양하여 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 각각 유도 및 증식시키는 단계;
(c) 상기 증식된 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 캘러스 증식 배지에 계대배양하여 각각 증식시키는 단계; 및
(d) 상기 계대배양하여 증식시킨 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 대상으로 티아렐릭산 함량을 각각 측정하여 티아렐릭산 생산성이 우수한 캘러스를 선발하는 단계를 포함하는 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산(Tiarellic acid) 대량 생산용 캘러스의 제조방법을 제공하며,
바람직하게는, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은
(a) 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D.) 식물체의 종자를 멸균시킨 후 0.5~1.5㎎/l 지베렐린이 포함된 MS 배지에서 발아시켜, 줄기, 잎 및 뿌리를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 줄기, 잎 및 뿌리 절편체를 0.05~0.15㎎/l TDZ 및 0.15~0.25 ㎎/l 피클로람이 첨가된 MS 배지에서 배양하여 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 각각 유도 및 증식시키는 단계;
(c) 상기 증식된 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 캘러스 증식 배지에 계대배양하여 각각 증식시키는 단계; 및
(d) 상기 계대배양하여 증식시킨 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 대상으로 티아렐릭산 함량을 각각 측정하여 티아렐릭산 생산성이 우수한 캘러스를 선발하는 단계를 포함하는 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산(Tiarellic acid) 대량 생산용 캘러스의 제조방법을 제공하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a) 단계의 발아 배지는 0.5~1.5㎎/l 지베렐린이 포함된 MS 배지이며, 바람직하게는 1㎎/l 지베렐린이 포함된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 단계의 유도배지는 0.5~1.5㎎/l TDZ(Tidiazuron) 및 0.15~0.25 ㎎/l 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 배지일 수 있으며, 바람직하게는 1㎎/l TDZ 및 0.2 ㎎/l 피클로람일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 단계의 캘러스 유도 배지는 TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 배지일 수 있으며, 첨가되는 TDZ 및 피클로람 함량은 상기한 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (c) 단계의 캘러스 증식 배지는 TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (d) 단계의 티아렐릭산 생산성이 우수한 캘러스는 잎, 뿌리 또는 줄기 유래일 수 있으며, 바람직하게는 잎 유래 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 헐떡이풀 식물체의 주로 뿌리에 들어있는 천연물 성분인 티아렐릭산을 대량생산하기 위해, 헐떡이풀 종자를 무균 기내 발아시켜 생육된 식물체의 잎, 줄기, 및 뿌리로부터 우수한 캘러스 세포를 유도하는 법, 오옥신과 사이토키닌이 적정 농도로 포함된 헐떡이풀 캘러스 세포배양용 고체배지를 사용하여 백색 혹은 연노란의 캘러스 세포를 유도하여 균질화된 상태로 만드는 계대배양 과정을 거친 후, 티아렐릭산 분석을 수행하여 가장 높은 함량을 보이는 캘러스를 최종 선발, 캘러스의 퇴화없이 지속적으로 유지배양되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D.) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 캘러스는 기탁번호가 KCTC 18650P인 것으로, 한국생명공학연구원에 2018년 01월 08일에 기탁하였다.
또한, 본 발명은 상기 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D.) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스(KCTC 18650P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D.) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스를 배양하여 티아렐릭산을 생산하는 단계를 포함하는 티아렐릭산의 생산 방법을 제공한다. 본 발명을 통해 선발된 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스를 배양하는 방법은 당업계에 일반적으로 이용된 캘러스 배양하는 방법으로, 특별한 방법에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 기본 배지를 유효성분으로 함유하는 헐떡이풀(Tiarella polyphylla D.) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물은 0.1㎎/l TDZ 및 0.2 ㎎/l 피클로람이 첨가된 MS 기본 배지를 유효성분으로 함유하는 것으로, 티아렐릭산을 대량생산하는 헐떡이풀 식물체 유래의 캘러스를 유도 및 증식하는데 효과적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 헐떡이풀 ( Tiarella polyphylla D.) 종자 발아 및 기내 배양
헐떡이풀 종자를 70% 에탄올로 표면소독하고 멸균수로 1회 세척하였다. 세척한 종자를 10% 소듐 히포클로라이드로 멸균시킨 다음 멸균수로 3회 세척하고, 멸균페이퍼에서 건조시켰다. 건조시킨 종자는 MS 기본 배지(MS 염, 80~120mg/L 미오-이노시톨, 비타민 + 3% 수크로스 + 0.8% 아가)에 GA (지베렐린) 1mg/L을 첨가한 발아 배지에서 발아를 유도하였다. 배양조건: 25℃, 장일의 광주기(16 h 명/8 h 암, 45μmol photons m-2s-1 백색광). 발아를 유도한 지 약 2개월 후에 완전한 식물체로 발달하였고 6개월 후 계대배양이 필요한 정도로 생육하였다. 식물체 고유의 특성상 매우 느린 생육을 보이는데 이는 일반 상토에서의 결과와 유사하였다.
실시예 2. 기내배양 식물체로부터 캘러스 유도
앞 실험의 결과로 얻어진 기내배양 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리를 충분히 확보하였다. 확보된 식물체를 MS 기본 배지와 MS 기본배지에 사이토키닌(cytokinin)류인 TDZ(Tidiazuron) 및 옥신(auxin)류인 피클로람(picloram)을 농도별로 조합하여 잎, 줄기 및 뿌리의 각각 30개씩 절편을 잘라 치상하여 25℃, 암상태의 배양실에서 캘러스를 유도하였다(도 3). 배지조성은 다음과 같다; TP1 (TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L), TP2 (TDZ 0.5 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L), TP3 (TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L), TP4 (TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 1.0 mg/L), TP5 (TDZ 0.5 mg/L + 피클로람 1.0 mg/L), TP6 (TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 1.0 mg/L), TP7 (TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L), TP8 (TDZ 0.5 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L) 및 TP9 (TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L)
잎 조직 치상 후 약 8주 후부터 캘러스가 생성되기 시작하였는데 이 캘러스는 갈변되면서 일부 표면에서 새로운 캘러스가 생성되었다. 4주 간격으로 동일 배지로 계대배양 해주어 계속적으로 캘러스를 유도 증식하였다. 색이 노랗고 비교적 증식이 빠른 새로운 캘러스를 바탕으로 각 배지별 유도율을 조사하였다. 1차로 유도된 캘러스에서 갈변된 후 일부분에서 다시 캘러스가 유도되었기 때문에 증식된 캘러스는 동질화되었다고 판단할 수 있다. 그 결과는 도 4와 같다.
분석결과, 헐떡이풀 캘러스 유도 결과로 보아 잎에서 유도된 캘러스는 초기 유도 후 전체적으로 갈변이 진행된 후 다시 캘러스가 유도되는 양상이었는데, 초기 유도율은 전체적인 배지 조합에서 높게 나타났으나, 캘러스가 갈변된 후 새로운 캘러스가 형성되는 과정에서의 유도율이 배지 조성별로 차이가 났으며, 가장 유도가 잘된 배지 조합은 TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 0.2 mg/L이며, 그 다음으로 TDZ 1.0 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L, TDZ 0.1 mg/L + 피클로람 2.0 mg/L 순서로 유도율이 높았다. 헐떡이풀 캘러스의 동질화 고정작업은 예상외로 간단하게 진행되었는데, 고사된 캘러스에서 새로 분화되는 캘러스를 취하는 과정에서 자연스럽게 동질화 과정도 병행하는 효과도 가지게 되었다.
실시예 3. HPLC에 의한 티아렐릭산 분석
캘러스 증식 과정에서 캘러스의 증식여부, 상태, 생장 속도, 형태 등을 고려하여 HPLC 분석을 위한 각 조직별 최종 캘러스 라인을 선별하였다. HPLC 분석은 아래와 같다. 추출방법; 각 시료의 건조시료 중량 1.25mg/ml의 농도로 용매(메탄올)를 가하고, 상온에서 초음파추출기로 20분 동안 추출하였으며, 총 3회 반복하여 추출액을 합쳤다. 분석용 추출시료의 농도는 메탄올 추출액을 합하여 농축하고 다시 알콜을 가하여 20mg/ml 농도로 맞추고 분석시 2~10ul씩 주입하였다. UHPLC, Waters Acquity UPLC; Column, Acquity UPLC BEH C18 1.7um 2.1*100mm; 용매, 아세토나이트릴 (CAN) (0.1% 포름산) + H2O (0.1% FA); 유량, 0.4ml/min; 검출, 210nm; 주입량, 표준물질 2 ㎕, 샘플 10 ㎕.
분석결과, 생장실에서 자란 헐떡이풀 뿌리에서 얻어진 티아렐릭산 함량은 67.9 ㎍/100mg 반면, 본 실험의 각기 다른 식물생장조절제 처리를 통하여 얻은 캘러스에서 확보한 티아렐릭산 함량은 가장 높은 것이 약 4배의 증가이며, 구체적으로는 TP1: 272 ㎍/100mg, TP6: 255 ㎍/100mg, TP7: 169 ㎍/100mg의 결과를 보였다(표 1).
본 실험을 통하여 원 식물체 대비 4배 가량 높은 함량을 보이는 캘러스를 포함 세 종류의 캘러스를 확보하였으며 이들 중 가장 높은 함량을 보인 처리구는 흥미롭게도 일반적으로 예상 가능한 뿌리-유래의 캘러스가 아닌 TDZ 0.1 + 피클로람 0.2 mg/l 조건에서 유도된 잎-유래의 캘러스이다. 따라서, 상기 잎 유래 캘러스 TP1을 기탁번호가 KCTC 18650P인 것으로, 한국생명공학연구원에 2018년 01월 08일에 기탁하였다.
Figure pat00001
한국생명공학연구원 KCTC18650P 20180108

Claims (8)

  1. (a) 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체의 종자를 멸균시킨 후 발아 배지에서 발아시켜, 줄기, 잎 및 뿌리를 유도하는 단계;
    (b) 상기 유도된 줄기, 잎 및 뿌리 절편체를 생장조절물질이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 배양하여 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 각각 유도 및 증식시키는 단계;
    (c) 상기 증식된 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 캘러스 증식 배지에 계대배양하여 각각 증식시키는 단계; 및
    (d) 상기 계대배양하여 증식시킨 줄기, 잎 및 뿌리 유래의 캘러스를 대상으로 티아렐릭산 함량을 각각 측정하여 티아렐릭산 생산성이 우수한 캘러스를 선발하는 단계를 포함하는 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산(Tiarellic acid) 대량 생산용 캘러스의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유도배지는 0.5~1.5㎎/l TDZ(Tidiazuron) 및 0.15~0.25 ㎎/l 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 캘러스 증식 배지는 0.05~0.15㎎/l TDZ(Tidiazuron) 및 0.15~0.25 ㎎/l 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 티아렐릭산 생산성이 우수한 캘러스는 잎 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스.
  6. 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스(KCTC 18650P).
  7. 제5항 또는 제6항의 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스를 배양하여 티아렐릭산을 생산하는 단계를 포함하는 티아렐릭산의 생산 방법.
  8. TDZ(Tidiazuron) 및 피클로람(picloram)이 첨가된 MS 기본 배지를 유효성분으로 함유하는 헐떡이풀(Tiarella polyphylla) 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물.
KR1020180004924A 2018-01-15 2018-01-15 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스 KR102236425B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180004924A KR102236425B1 (ko) 2018-01-15 2018-01-15 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180004924A KR102236425B1 (ko) 2018-01-15 2018-01-15 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190086861A true KR20190086861A (ko) 2019-07-24
KR102236425B1 KR102236425B1 (ko) 2021-04-06

Family

ID=67480981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180004924A KR102236425B1 (ko) 2018-01-15 2018-01-15 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102236425B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102250377B1 (ko) * 2019-11-07 2021-05-11 재단법인 전주농생명소재연구원 헐떡이풀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물
KR102319658B1 (ko) * 2021-03-05 2021-11-02 주식회사 다산씨엔텍 록샘파이어 유래의 이차대사물질을 생산하기 위한 록샘파이어 캘러스의 제조방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070002725A (ko) * 2005-06-30 2007-01-05 주식회사 삼양제넥스 식물 세포 현탁 배양에 의한 코로솔릭산의 제조방법
KR20080104094A (ko) * 2007-05-26 2008-12-01 한국생명공학연구원 헐떡이풀 추출물 또는 이로부터 분리된 트리테르펜화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070002725A (ko) * 2005-06-30 2007-01-05 주식회사 삼양제넥스 식물 세포 현탁 배양에 의한 코로솔릭산의 제조방법
KR20080104094A (ko) * 2007-05-26 2008-12-01 한국생명공학연구원 헐떡이풀 추출물 또는 이로부터 분리된 트리테르펜화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용조성물

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102250377B1 (ko) * 2019-11-07 2021-05-11 재단법인 전주농생명소재연구원 헐떡이풀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물
KR102319658B1 (ko) * 2021-03-05 2021-11-02 주식회사 다산씨엔텍 록샘파이어 유래의 이차대사물질을 생산하기 위한 록샘파이어 캘러스의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102236425B1 (ko) 2021-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102033450B1 (ko) 아스트라갈로사이드 iv의 함량이 증가된 황기 부정근의 대량생산방법
Labrooy et al. Influence of N6-benzyladenine and sucrose on in vitro direct regeneration and microrhizome induction of Kaempferia parviflora Wall. ex Baker, an important ethnomedicinal herb of Asia
US20180220608A1 (en) A Method for Increasing the Content of Notoginsenoside R1 in Panax Notoginseng
Teshome et al. In vitro callus induction and shoot regeneration from leaf explants of Glinus lotoides (L.)—an important medicinal plant
Verma et al. In vitro mass multiplication of Acorus calamus L.—an endangered medicinal plant
Thong-On et al. Field evaluation of in vitro-induced tetraploid and diploid Centella asiatica (L.) Urban
Tandon et al. Statistical optimization of in vitro callus induction of wild and cultivated varieties of Mucuna pruriens L.(DC.) using response surface methodology and assessment of L-Dopa biosynthesis
Krishnan et al. Elicitation effect on the production of asiaticoside and asiatic acid in shoot, callus, and cell suspension culture of Centella asiatica
Zhao et al. A culture system for the stable and high-efficiency proliferation of adventitious roots of Panax notoginseng and ginsenoside accumulation
Purohit et al. Efficient plant regeneration through callus in Zanthoxylum armatum DC: an endangered medicinal plant of the Indian Himalayan region
KR102236425B1 (ko) 헐떡이풀 식물체 유래의 티아렐릭산 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 캘러스
Langhansova et al. Regulation of tissue differentiation by plant growth regulators on tTCLs of Panax ginseng adventitious roots
Sivanandhan et al. Elicitation approaches for withanolide production in hairy root culture of Withania somnifera (L.) Dunal
CN112293250B (zh) 一种甘松愈伤组织细胞的培养方法
CN105052581B (zh) 一种提高三七中人参皂苷Rg1含量的方法
Siva et al. Enhanced production of psoralen through elicitors treatment in adventitious root culture of Psoralea corylifolia L
Pramanik et al. Tissue culture of the plant Pluchea indica (L.) Less. and evaluation of diuretic potential of its leaves
KR101947695B1 (ko) 고삼 식물체 유래의 마키아인 대량 생산용 캘러스의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 마키아인 대량 생산용 캘러스
Rangaraju et al. Improved production of withanolides in adventitious root cultures of Withania somnifera by suspension culture method
CN103109745A (zh) 一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法
Sarje et al. A pharmacognostic and pharmacological review on Canna indica Linn
Kumar et al. Effect of plant growth regulators on germination of seed of Podophyllum hexandrum in high altitude region of Ladakh, India
Nandagopal et al. Effect of phytohormones on micropropagation and phytochemical studies of Aerva lanata (Linn.) Juss. ex Schult-A seasonal and vulnerable plant
Bączek et al. Secondary Metabolites of Various Eleuthero (Eleutherococcus senticosus/Rupr. et Maxim./Maxim) Organs Derived from Plants Obtained by Somatic Embryogenesis
Agarwal et al. In vitro clonal propagation and phytochemical analysis of Momordica charantia. Linn

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant