JPH0453495A - 粘性多糖類の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、植物Ｕ織を液体培地中でカルス培養すること
により粘性多糖類を大量に生産する方法に関する。粘性
多糖類は、医薬品、化粧品１食品などの素材として利用
される。

［従来の技術］ 従来より植物が有用な粘性多糖類を生産することはよく
知られている。特に、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）
の植物は有用な粘性多糖類を生産するものが多く、トロ
ロアオイ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ　ｍａｎｉｈｏｔＭ
ｅｄｉｃｕｓ）の根の粘性多糖類が古来より和紙の製造
における糊料として用いられているほか、ビート′ 贅アオイ（Ａｌｔｈａｅａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　
Ｌ、）の根、タチアオイの根、およびムクゲの花の粘性
多Ｉｉ類がそれぞれ西洋、中国９日本において、皮膚軟
化剤や粘滑剤、胃腸の刺激緩和剤として薬用に供されて
きた。また、オクラの果実は食用に供され、その中に含
まれる粘性多糖類は独特な食味の重要な要素となってい
る。これらの粘性多糖類については、ムクゲの花（Ｍ、
Ｔｏｍｏｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、
Ｂｕｌｌ。

３５．２３６０−２３６５（１９８７））　、オクラの
果実（Ｍ、Ｔｏｍｏｄａｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈｅｍ、Ｐ
ｈａｒｎ＋、Ｂｕｌｌ、２８．２９３３−２９４０　（
１９８０））。

す〆ヒ ビ冨半＊アオイの根（Ｍ、ＴｏＩＩｌｏｄａ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ。

Ｂｕｌｌ、２８，８２４−８３０（１９８０））、トロ
ロアオイのＩ　　（Ｍ。

Ｔｏａ＋ｏｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ
、Ｂｕｌｌ、２５．３０６１−３０６５１９７７））、
タチアオイの根（Ｍ、Ｔｏｍｏｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ
ｈｅｍ。

Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　３Ｌ２６７７−２６８４（１
９８３））等から抽出された天然物に関して構造が明ら
かにされているが、極度に複雑な構造のため化学合成す
る事は不可能である。従って、現在においてもこれらの
粘性多糖類の生産方法としては、昔ながらの植物体から
の抽出という方法に較っているのが現状である。

このような背景から、植物の細胞培養による粘性子Ｉｉ
類の生産は新しい技術として注目されていた。その初期
の例として、固体培養による植物のカルスからの粘性多
糖類の抽出が試みられ、コロハ（マメ科、Ｔｒｉｇｏｎ
ｅｌｌａ　ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）、ニチニチ
ソウ（キョウチクトウ科、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒ
ｏｓｅｕｓ）、ヒョコマメ（マメ科、Ｃ１ｃｅｒ　ａｒ
ｉｅｔｉｎｕｍ）。

ダイス（マメ科、Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｒａａｘ）、キダチ
タハコ（ナス科、Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｇｌａｕｃａ）
からの抽出が知られている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　１８，６６２−６６３（１９７９））。

しかしこの方法は、カルスを固体培養で増殖させる方法
であり、粘性多糖類の大規模生産には適さない方法であ
る。その後、植物細胞の液体培養による大量増殖系が確
立され、これが植物細胞からの多糖類生産に応用される
ようになってきた。ただし細胞壁成分の多糖類に関する
研究の方が先行し、例えば、液体培養したニンジン（セ
リ科、Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ）細胞の細胞壁から
の多糖類の抽出（Ｐｌａｎｔａ　１６０，４６９−４７
３（１９８４））等の報告がある。さらに、より応用的
な研究として、植物細胞を液体培養した際の培地中への
多Ｗ、ｌの分泌に関する報告もあるが、例えば、固体培
養したカルスからは粘性多糖類が抽出できたダイスの細
胞を液体培養しても培地中には細胞壁成分の多糖類しか
分泌されなかったり（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、、　２６，２８７２９４　（１９８５））、ま
た、アオイ科植物であるワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈ
ｉｒｓｕｔｕｍ）の茎頂分裂組織由来の細胞を液体培養
しても培地中にはやはりグルコースを含んだ細胞壁成分
多糖類と類似した多Ｉ！類しか分泌されず（Ｆｏｏｄ　
Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ　１，３５９−３６３（１
９８７））、粘性多糖類を液体培地中に分泌させること
に成功した例はない。

［発明が解決しようとする課題］ 上記に述べた従来の粘性多糖類の生産方法における問題
点を踏まえ、従来法とは異なる新規な方法によって植物
の組織から大量の粘性多糖類を取得することを目的とす
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明者はアオイ科の植物組織よりカルスを誘導し、寒
天培地上での縫代培養条件を設定し、そのカルスを液体
培養することにより、培地中または細胞内に粘性多糖類
が生成できることを見い出し、この知見に基づき本発明
を完成させるにいたった。

すなわち、本発明は、植物組織を液体培地中でカルス培
養せしめることを特徴とする粘性多糖類の生産方法、更
には、植物組織から粘性多糖類を取得するに際し、 （ａ）　　植物組織の一部をオーキシン及びサイトカイ
ニンを含む基本培地上に培養せしめてカルスを誘導する
工程、 （ｂ）　　誘導された該カルスを寒天培地上で縫代培養
せしめてカルスを増殖する工程、 （ｃ）　　該縫代培養により得られたカルスをオーキシ
ン及びサイトカイニンを含む液体培地中で振盪培養する
工程、 から成る粘性多糖類の生産方法に関する。

本発明で用いる粘性多糖類とは、細胞壁を構成する多Ｉ
ｉ類成分と異なるもので、それ以外の二次代謝産物であ
る多糖類を含有したものをいう。例えば、アオイ科植物
の粘性物質の場合は、細胞壁成分とは完全に異なる多糖
類を主成分とし、これに１〜２割程度の蛋白質が混合さ
れたもので、多糖類を主成分とする粘性物質と呼称する
こともできる。

本発明に通用できる植物は特に限定されず、粘性多糖類
を生産する植物であれば何であっても良い。好ましい植
物としてはアオイ科の植物、より具体的には、ハイビス
カス、オクラ、タチアオイムクゲ等を例示できる。

本発明の植物組織の培養には、該植物組織（組織片）等
を用いて行うことができる。該植物組織として具体的に
は葉２葉柄、子葉２種子等、またはそれらの組織の小片
を例示することができる。

これらの組織は、通常、植物を次亜塩素酸ナトリウムや
エチルアルコールにより滅菌した後に使用される。該植
物組織からカルスを誘導するための培地としては、ムラ
シゲ−スクーグ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇ）　、
　　Ｂ　５　、　　リンスマイヤー−スクーグ（Ｌｉｎ
ｓｍａｉｅｒ−５ｋｏｏｇ）等の基本培地に、植物ホル
モンであるオーキシンを１μＭ〜１０μＨの濃度範囲で
、かつサイトカイニンを０．０１μＭ〜１μＨの濃度範
囲で添加し、通常０．８％の寒天等で固化した培地が用
いられる。ここで、オーキシンとして、２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）　、インドール酢酸（
ＩＡＡ）　、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、　インドー
ル酪酸（ＩＢＡ）　、４−アミノ−３，５，６−トリク
ロロピコリン酸（ｐｉｃｌｏｒａｍ）等が例示できる。

また、サイトカイニンとして、ベンジルアデニン（ＢＡ
Ｐ）　。

カイネチン（Ｋｉｎ）　、　　イソペンテニルアミノプ
リン（ｉｐ−４）、ゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）等が用い
られる。培養は、２５°Ｃ〜３０°Ｃの明条件または暗
条件で行なえばカルスが得られる。

次に、上記の方法で誘導した該カルスを縫代培養するが
、その際、カルス誘導に用いた基本培地にオーキシンを
１μＭ〜１０ｔ１Ｍの濃度範囲で、かつサイトカイニン
を０．０１μＭ〜５ＩＭの濃度範囲で添加し通常０．８
％の寒天等で固化した培地が用いられる。２〜４ケ月で
カルスは２〜５倍に増殖する。

一代培養により得られたカルスは、カルス縫代培養時と
同じオーキシン及びサイトカイニン濃度の基本液体培地
に、一定量のカルスを接種し、暗黒下、振盪培養するこ
とにより、液体培地中または細胞内に大量の粘性子ＩＩ
類を生成する。こうして得られた培地中の該粘性多糖類
の回収は、例えば、濾過または遠心分離などにより細胞
と培養土加え沈澱させること等により得られる。また、
細胞内の粘性釜ＩＪ！類の回収は、細胞を破砕し蒸留水
で抽出し、遠心分離などにより細胞破砕物と抽出液に分
別し、培養上清からと同様の方法で沈澱させることによ
り得られる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

［実施例］ （１）カルスの誘導 ハイビスカスの葉を採取し、次亜塩素酸ナトリウム溶液
（有効塩素濃度２％）で滅菌後、約５ｍ角に細断しＭｕ
ｒａｓｈｉｇｅ−３ｋｏｏｇ（以下、ＭＳ寒天培地とい
う）に置床し３０°Ｃで培養した。ＭＳ寒天培地には、
オーキシンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２
，４−Ｄ）を０〜１０μ門の範囲で、サイトカイニンと
してカイネチンを０〜１μＨの範囲で各種の濃度に組み
合わせて添加した（組合わせは第１表に示す）。２．４
−Ｄ無添加以外のほぼ全ての条件で黄白色のカルスを得
た。

オクラの種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃
度２％）で滅菌後、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ培
地からビタミン類を除き塩濃度を１０分の１に希釈した
培地（寒天を０．８％で含有する以下１／１０Ｍ５寒天
培地という）に植え、照明下、３０°Ｃで培養した。２
週間後、ｌｏｃｍ程に生育した下胚軸を約５鵬に切り、
ＭＳ寒天培地（培地中の２．４−Ｄとカイネチンの濃度
の組合わせは第２表に示す）に置床し、３０°Ｃで培養
し、第２表に示した様に、全ての条件で暗紫色の粒状の
カルスを得た。

タチアオイの種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩
素濃度２％）で滅菌後、１／ｌ０Ｍ５寒天培地に植え、
照明下、３０°Ｃで培養した。２〜３週間後、６Ｃ１＋
１程に生育した下胚軸を約５１１ＩＩ１１に切り取り、
ＭＳ寒天培地（２，４−Ｄとカイネチンの濃度の組合わ
せは第３表に示す）に置床し、３０°Ｃで培養し第３表
に示した様にカイネチン無添加以外の全ての条件で黄白
色のカルスを得た。

（２）カルスの縫代培養 ハイビスカスのカルスは第４表に示すようにＭＳ寒天培
地中のホルモン濃度の条件を統一して継代した。４種の
条件全てに於いて、カルスは２ケ月で２〜５倍に増殖し
た。

ムクゲのカルスは２．４−Ｄを５，１０μｈでカイネチ
ンを１．５μ台で組み合わせた４種のホルモン濃度条件
の耶寒天培地で継代した。４ケ月で２倍に増殖した。

オクラのカルスは第５表に示すように耶寒天培地中のホ
ルモン濃度を変化させた条件で継代した。

全ての条件でカルスは増殖を続けるが、増殖速度には多
少の差が認められ、（１，０，０１）　（Ｌ　Ｏ，１）
（１，１）　（５，５）　（１０，１）　（（）内の数
値はいずれも順に、縫代培養時の２．４−Ｄ濃度（μＭ
）とカイネチンの濃度（μＭ）を示す。以下も同様）の
ホルモン条件のカルスが良好な増殖を示した。最も速い
ものは２ケ月で４倍に増殖した。

（註） ・十が多いほど増殖が速く、 ＋＋＋ は＋の約２倍 （註） ・十が多いほど増殖が速く、 ＋＋＋ は＋の約２倍 （註） ・十が多いほど増殖が速（、 ＋＋＋ は＋の約２倍 タチアオイのカルスも同様に、第５表に示すようにＭＳ
寒天培地中のホルモン濃度を変化させた条件で継代した
。全ての条件でカル又は増殖を続けるが、（１，０，１
）のホルモン条件並びにカイネチン濃度が１μ−以上の
条件で増殖が良好であった。

最も速いもので、２ケ月で４倍に増殖した。

（３）粘性多Ｉ！類の生産・回収 縫代培養により得た各カルス５ｇを、５００ｄ容のフラ
スコに入れたカルス縫代培養時と同一ホルモン条件にし
たＭＳ液体培地１００ｄに接種し、暗黒下、１２Ｏｒｐ
ｍの速度で振盪培養した。３週間後、この培養液全体を
５０００ｄ容のフラスコに入った同一ホルモン条件のＭ
Ｓ液体培地１０００ｒＩ１１に接種し、暗黒下、１２０
ｒｐｍの速度で更に１ケ月間振盪培養した。

培養終了時の、各培養細胞の生重量を第６表に示す。

培養終了後の各培養液をそれぞれ濾紙で細胞と培養上清
に分別した。培養上清はロータリーエバポレーターで約
１７３に濃縮した後、２倍容のエタノールを加え上滑中
の粘性多１１１１を沈澱させた。

この沈澱物を遠心分離により回収し、これを約１００ｄ
の蒸留水に溶解した後凍結乾燥した。

また、分別した細胞は乳鉢中で乳棒で押しつぶして破砕
し、これに１０倍量の蒸留水を加えて室温で１時間型は
んして多糖を抽出した。この液を１０、０００　ｇで３
０分間遠心して細胞破砕物と抽出液に分別し、この抽出
液に２倍容のエタノールを加え粘性多Ｉｉ類を沈澱させ
た。この沈澱物を遠心分離により回収し、これを約１０
０１１の蒸留水に溶解した後、凍結乾燥した。各培養液
から得られた培養上清の沈澱物の乾燥重量と、細胞抽出
物の沈澱物の乾燥重量を第６表に示した。

また、母植物と比較するために、これとは別にハイビス
カスの葉、オクラの果実からもＴｏｍｏｄａらの方法（
Ｍ、Ｔｏｍｏｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａ
ｒｍ、　Ｂｕｌｌ、。

２８　、２９３３−２９９（１９８０）　ニ従って粘性
多糖類を抽出した。ハイビスカスの葉、並びにオクラの
果実から種子を除いたものをパワーホモゲナイザーによ
り６．００Ｏｒｐｍで１０分間破砕した。これに１０倍
量の蒸留水を加え、室温で１時間型はんした。この懸濁
液を１０，０００ｇで３０分間遠心し、細胞破砕物と抽
出液（１回目）に分離した。抽出液に２倍容のエタノー
ルを加えて沈澱物を生じさせ、遠心分離により沈澱物を
回収した。細胞破砕物には再度１０倍量の蒸留水を加え
た後、上記と同様にして抽出液（２回目）を得た。これ
に２倍量のエタノールを加えて沈澱物を得た。１回目と
２回目の抽出液から得られた両法澱物を合わせ、約２０
０ｄの蒸留水に溶解し凍結乾燥した。両組織から回収し
た沈澱物の乾燥重量を第６表に示した。

なお、回収した各沈澱物の糖含量については、蒸留水に
それぞれ溶解し、フェノール−硫酸法により定量した。

定量のための標準糖としてはグルコースを使用した。各
沈澱物中の糖含量はグルコース換算重量として第６表に
示した。

ハイビスカス、オクラ、タチアオイいずれの場合も、培
養上清から著量の粘性多糖類が回収され、特にオクラで
は、２．４−０１０μ門、カイネチン１μＨの実験区で
、細胞生重量当り母植物の果実から得られるよりも多く
の粘性多Ｗ！類が得られることが分かった。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、植物組織から著量の粘性多Ｉｉ
類を取得できることから、実用化が期待される。

特許出願人　　魚　　住　武　　司 法の素株式会社

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物組織を液体培地中でカルス培養せしめること
   を特徴とする粘性多糖類の生産方法
2. （２）植物組織から粘性多糖類を取得するに際し、 （ａ）植物組織の一部をオーキシン及びサイトカイニン
   を含む基本培地上に培養せしめてカルスを誘導する工程
   、 （ｂ）誘導された該カルスを寒天培地上で継代培養せし
   めてカルスを増殖する工程、 （ｃ）該縫代培養により得られたカルスをオーキシン及
   びサイトカイニンを含む液体培地中で振盪培養する工程
   、から成る請求項（１）記載の方法
3. （３）植物組織がアオイ科植物の組織である請求項（１
   ），（２）記載の方法
4. （４）アオイ科植物がハイビスカス，オクラ，タチアオ
   イ，ムクゲから選ばれる請求項（３）記載の方法
5. （５）請求項（１）の方法により得られる粘性多糖類