JPS6321470B2

JPS6321470B2 -

Info

Publication number: JPS6321470B2
Application number: JP58043726A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Myamoto; Yoshe Ishida; Hirohiko Oda; Keiichi Ushama
Original assignee: Nitto Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1983-03-15
Filing date: 1983-03-15
Publication date: 1988-05-07
Also published as: JPS59169487A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野：本発明は薬用にんじん（Panax ginseng C.A.
Meyer）組織培養物の培養法、特に、古来より有
用生薬として珍重されている薬用にんじん植物の
生組織の一部を組織培養して得られる組織培養物
を独特の改良培地で培養することにより天然薬用
にんじんと同じ粗サポニンや粗サポゲニンなどの
薬効主成分を多量に含有する薬用にんじん組織培
養物を高率で生産する方法に関する。

従来技術：薬用にんじん例えばオタネにんじん、チクセツ
にんじん、アメリカにんじん、三七にんじんなど
の根は有用漢方薬として珍重され現在でも広く利
用されている。薬効としては、強壮、長生、鎮
静、興奮、利尿作用などが明らかにされている。
植物としての薬用にんじんから得られる生薬の薬
効主成分は、サポニンをサポゲニンである。薬用
にんじんから抽出されるサポニンは多数の成分群
Ro、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、RgおよびRh
を含むが薬効の中心をなすものはRbとRgであ
る。Rbは鎮静作用を有し、Rgは興奮作用を有す
るといわれている。現在、野生の薬用にんじんは
ほとんど存在せず、栽培が行われている。栽培は
大変むずかしく夏季冷涼な高地で排水のよい土地
を用い日覆その他特別な配慮を必要とする。いつ
たん栽培すると20〜50年は同じ場所に連作不能で
あり、その上、収穫までに４〜７年かかる。この
様な理由により非常に高価なものになつている。

薬用にんじん組織培養物を工業的に組織培養す
るには、できるだけ単純な組成の培地を用いて高
収量を得る方法が望ましい。植物組織培養におい
て組織培養物の生長速度を上げかつ組織培養物の
収量を向上させるためには、従来から例えばMS
培地（Murashige and Skoog氏培地）、White氏
培地、Gantheret氏培地、Tulecke氏培地、
Morel氏培地、Linsmaier−Skoog氏培地、
Hildebrandt氏培地などの通常の植物組織培養用
基本培地が用いられ、これにカゼイン分解物、大
豆粉、コーンステイープリカー、さらにはビタミ
ン類を添加する方法が用いられる。しかし、これ
らの方法は、従来から用いられている上記基本倍
地の倍地組成を複雑化し、あるいはせつかく選別
した薬用にんじん組織培養物の性質を変質し薬効
成分の生産を抑制することにもなりかねない。ま
た、栄養源を単に量的に添加することは、微生物
の培養では有効であつても植物組織の培養では生
長阻害を引きおこしかねない。

発明の目的：本発明の目的は、比較的単純な組成の培地を用
いて高収量で薬用にんじん組織培養物を培養する
培養法を提供することにある。本発明の他の目的
は、天然薬用にんじんと同じ薬効成分の粗サポニ
ンや粗サポゲニンを多量含有する薬用にんじん組
織培養物の培養法を提供することにある。

発明の要旨：本発明は、植物生長にlag phaseがあるのは従
来から培地の炭素源として用いられているシユク
ロースの分解に時間がかかるためであり初期成長
を速めるためにはシユクロースの分解生成物の１
つであるグルコースを当初から添加しておけばよ
い；そして、グルコースはタバコ、ニチニチソウ
のような植物生長に阻害的に作用するとの従来の
常識に反し薬用にんじんに対しては炭素源として
極めて有効であるなどの発明者の新しい知見、さ
らには薬用にんじんの組織培養にはグルコースと
シユクロースとの量的バランスも重要である。そ
して硝酸アンモニウムが薬用にんじんの組織培養
物の生長に阻害的に作用するなどの本発明者の新
しい知見に基づいて完成された。

本発明は、薬用にんじんの生組織から得られる
組織培養物を、通常のMS培地（シユクロース１
〜３重量％、硝酸アンモニウム0.165重量％、そ
して硝酸カリウム0.19重量％）に代えてグルコー
スを含有しそして硝酸アンモニウムを当初から実
質的に含有しない修正MS培地で培養するもので
ある。「硝酸アンモニウムを実質的に含有しない」
とは、MS培地としての処方せんから硝酸アンモ
ニウムを積極的に除くという意味であり、他の成
分に由来する不純物として微量含まれる硝酸アン
モニウムまでも除くという意味ではない。この修
正MS培地にはグルコースが約0.2〜約0.8重量％、
好ましくは、約0.4〜約0.6重量％の範囲で含まれ
る。また、培養開始時の上記修正MS培地の炭素
源をグルコース約0.2〜約0.8重量％そしてシユク
ロース約1.0〜約3.0重量％とし、約10〜約20日の
培養ののちシユクロース約１〜約3.5重量％の範
囲で補充して培養を続けるものである。このこと
により上記目的が達成される。

実施例：以下に本発明を実施例に基づいて詳述する。

実施例１炭素源をグルコース０〜0.8重量％およびシユ
クロース１〜３重量％に修正したMS培地150ml
を300mlのエルレンマイヤーフラスコに入れ高圧
滅菌した。寒天0.9％を含むMS固形培地にあらか
じめ培養しておいた薬用にんじん組織培養物８〜
10ｇを上記修正MS培地に接種し毎分90ストロー
クの往復振とう機にて25℃で２週間振とう培養し
た。得られた組織培養物の乾燥重量（50℃の温風
乾燥機により恒重量になるまで乾燥して得た重
量）を測定して得た結果を第１図に示す。シユク
ロース３重量％ではグルコースの添加は組織培養
物の生長にほとんど影響が現われないがシユクロ
ース１〜２重量％ではグルコース約0.2〜約0.8重
量％、特にシユクロース２重量％でグルコース約
0.4〜約0.6重量％の添加で初期生長が促進される
ことが第１図から認められる。

次にグルコースを0.5重量％に固定し、シユク
ロース濃度を1.0〜3.5重量％にわたつて変化させ
た場合の培養２週間後の薬用にんじん組織培養物
の収量を調べた。その結果を第２図に示す。第２
図は２週間の培養ではシユクロース濃度は２重量
％のとき組織培養物収量が最も高いことを示して
いる。単純にMS培地のシユクロース含量を３重
量％に代えて４重量％以上にしても、第３図から
明らかなように、組織培養物の生長がかえつて抑
制される。これらの結果は、結局、グルコースと
シユクロースとの適当なバランスが生長促進効果
をもたらすのであつて、単に炭素源を増加すれば
生長促進されるわけではないことを示している。

このグルコース添加による生長促進効果は２週
間という培養初期だけに認められるのみならず、
第４図に示すように、４週間の培養期間全体を通
じて認められた。第４図に示すように、６週間後
の乾燥重量は４週間培養後の乾燥重量より減少し
た。シユクロース濃度を最初から３重量％含有す
るMS培地に比較し、グルコース0.5重量％および
シユクロース２重量％に修正したMS培地を用い
ることにより、４週間培養後の薬用にんじん組織
培養物の収量は乾燥重量で約40％も向上した。

実施例２培地、培地量、接種組織培養物量およびその他
の培養条件を実施例１と同一にした。そして、シ
ユクロース１重量％とグルコース0.5重量％およ
びシユクロース２重量％とグルコース0.5重量％
とを含む修正MS培地に、培養14日目に４重量％
以下のシユクロースを補充し培養を継続した。培
養４週間後には、第５図に示すように、いづれの
培地についてもシユクロース濃度が１〜3.5重量
％、特に２〜３重量％において薬用にんじん組織
培養物の生重量および乾燥重量は実施例１の場合
よりさらに向上した。乾燥重量は第４図に示した
シユクロース３重量％MS培地の場合の1.9倍、シ
ユクロースを補充しない場合の1.4倍であつた。

実施例３培地、培地量、接種組織培養物量およびその他
の培養条件を実施例１と同様にして、シユクロー
ス２重量％と３重量％の補充時期を検討した。そ
の結果を第６図に示す。第６図に示すように、培
用開始後約10日〜約20日目の補充に効果が認めら
れ、特に14日目の補充により収量が著しく増大す
ることが認められた。なお、補充に際しては、シ
ユクロース濃厚溶液が培養開始時の培養液容量の
10％以下の量で添加された。シユクロースの補充
量は、培養開始時の培地重量G1、シユクロース
補充液重量G2そしてこのシユクロース補充液中
のシユクロース重量G3とすると、G3／G1＋G2×100 で算出される。

実施例４グルコース濃度を０％そしてシユクロース濃度
を２重量％と３重量％に設定し、かつ硝酸アンモ
ニウムを実質的に含有しない修正MS培地を用い
たこと以外はすべて実施例１と同様の培養条件で
薬用にんじん組織培養物を培養した。その結果を
硝酸アンモニウムを含有するMS培地を用いた比
較例と共に第７図に示す。第７図から明らかなよ
うに、硝酸アンモニアを含有しないMS培地で培
養すると、シユクロース濃度のレベルにかかわり
なく、薬用にんじん組織培養物の収量は、乾物量
で40〜60％程度向上した。これは全培養期間を通
じて認められた。

硝酸アンモニウムによる生長抑制効果は、他の
Gamborg培地などでも認められたが、MS培地に
おいて顕著でありしかもその倍地の調製が容易で
ある。

実施例５実施例１のグルコース・シユクロースの量的バ
ランス効果と、実施例４の硝酸アンモニアの除去
による生長促進効果とを組合せることにより、第
８図に示すように、薬用にんじん組織培養物の生
産性はさらに向上した。その収量は、従来の３重
量％シユクロース含有MS培地や２重量％シユク
ロース含有MS培地による収量の約1.3〜２倍であ
る。

実施例６実施例１のグルコース・シユクロースの量的バ
ランス効果、実施例２および３のシユクロースの
途中補充効果、および実施例４の硫酸アンモニア
の除去による生長促進効果を組合わせることによ
り、第９図に示すように、薬ににんじん組織培養
物の生産性はさらに向上した。この図から明らか
なように、その収量は、従来の３重量％シユクロ
ース含有MS培地による収量の約1.8〜2.5倍であ
る。

なお、本発明の実施例で用いた薬用にんじんか
ら組織培養物を取得する方法として、次の方法が
用いられた。薬用にんじんをよく水洗い後、茎と
根部分に分けて大きく切断し、例えばサラシ粉濾
液の様な殺菌剤にて滅菌し、その後滅菌水にてよ
く洗滌する。そして無菌的に適当な大きさ（例え
ば0.5〜1.0cm）に切断し組織片を寒天培地上に置
く。この寒天培地に含まれる培地としては各種の
無機塩にビタミン類、糖類を加えて成る既知の植
物組織培養用培地が用いられ得る。生長調節物質
としては、オーキシン類としてβ−インドール酢
酸（IAA）、α−ナフタリン酢酸（NAA）、２・
４−ジクロルフエノキシ酢酸（２・４−Ｄ）、そ
して、サイトカイニン類としてカイネチン、ジベ
レリンがそれぞれ単独または組合わせて添加され
る。こうすることにより、カルス化（脱分化）が
なされうる。ココナツミルク、酵母、カゼイン加
水分解物（カザミノ酸）等を単独または組合せて
添加することにより効率よくカルス化が行われう
る。カルス化は、暗所下、23〜28℃の条件で植物
培養片の細胞を増殖させることにより１週間目頃
より始まり約４週間でカルス化する。しかしなが
ら、このようにして得られる薬用にんじんカルス
にはサポニンやサポゲニンなどの薬効成分は含ま
れない。カルスが再分化していないからである。

薬用にんじんカルスを再分化させるために、こ
れをインドール、酪酸2ppm、サイトカイニン
0.1ppmを含有するMS培地に置床し白色光を100
〜2000ルツクスの状態で照射する。カルスは再分
化する。同時に、株の選別をおこなつて天然薬用
にんじんと同様の薬効主成分粗サポニンおよび粗
サポゲニンを含有する組織培養物を得る。本株の
粗サポニン含量は乾燥重量で約７〜10％の程度で
あつた。

発明の効果：本発明によれば、炭素源と窒素源とを修正した
MS培地を用いることにより、天然の薬用にんじ
んと同様の薬効主成分である粗サポニンや粗サポ
ゲニンを含有する薬用にんじん組織培養物の収量
を従来のMS培地による収量の約1.8〜2.5倍に高
めうることができる。本発明による収量の増大
は、従来の培地が主として汎用性を重視して作ら
れたのであつて特定の植物組織の培養用に開発さ
れたものではないことに起因するものと思われ
る。本発明では、いうまでもなく、従来から用い
られているカゼイン分解物、大豆粉、コーンステ
イープリカー、廃糖密、ビタミン類などの添加を
否定するものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図はシユクロース濃度を特定したときのグ
ルコース濃度と薬用にんじん組織培養物収量との
関係を示すグラフ、第２図はグルコース濃度を特
定したときのシユクロース濃度と薬用にんじん組
織培養物収量との関係を示すグラフ、第３図はシ
ユクロース濃度を変えたときの培養期間と薬用に
んじん組織培養物収量との関係を示すグラフ、第
４図はシユクロース・グルコース修正MS培地お
よび無修正MS培地と薬用にんじん組織培養物収
量との関係を示すグラフ、第５図はシユクロース
補充濃度と薬用にんじん組織培養物収量との関係
を示すグラフ、第６図はシユクロース補充時期と
薬用にんじん組織培養物収量との関係を示すグラ
フである。第７図は硝酸アンモニウムのみを修正
したMS培地を用いたときの薬用にんじん組織培
養物の収量を示すグラフ、第８図は硝酸アンモニ
ウムとグルコースとを修正したMS培地を用いた
ときの薬用にんじん組織培養物の収量を示すグラ
フ、そして第９図はさらにシユクロースを補充し
た修正MS培地を用いたときの培養４週間後の薬
用にんじん組織培養物収量を従来のシユクロース
３重量％培地の場合と比較して示した棒グラフで
ある。

Claims

【特許請求の範囲】１薬用にんじんの生組織から得られる組織培養
物を、グルコースを含有しそして硝酸アンモニウ
ムを実質的に含有しない修正MS培地で培養する
薬用にんじん組織培養物の培養法。２前記グルコース濃度が約0.2〜0.8重量％であ
る前記特許請求の範囲第１項に記載の薬用にんじ
ん組織培養物の培養法。３薬用にんじんの生組織から得られる組織培養
物を、グルコースを含有しそして硝酸アンモニウ
ムを実質的に含有しない修正MS培地に接種して
培養を開始し、約10〜約20日の培養後、シユクロ
ースを補充して培養を続ける薬用にんじん組織培
養物の培養法。４前記培養開始時のグルコース濃度が約0.2〜
約0.8重量％でかつシユクロース濃度が約1.0〜約
3.0重量％であり、そして前記シユクロースの補
充濃度が約１〜約3.5重量％である前記特許請求
の範囲第３項に記載の薬用にんじん組織培養物の
培養法。