JPH03262427A - ポドフィルム属植物の不定胚の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）属植
物の不定胚の調製方法に関する。さらに詳しくはポドフ
ィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）属植物の細胞から該
植物の不定胚を植物組織培養法により効率的に調製する
方法に関する。

〔従来の技術〕

植物の細胞から誘導される不定胚は、該植物の効率的育
種や栽培効率化を目的とする大量増殖の材料として、ま
た人工種子の主要構成要素として産業上の価値を有して
いる。さらに該植物の有用成分の工業的生産を目的とす
る組織培養の原料としての価値も有している。多年草で
あるポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）属植物は
従来より観葉植物として珍重されていたが、近年該植物
にポドフィロトキシン類化合物やフラボノイド類化合物
等の医薬、化粧品分野で有用な物質が含有されることが
明かとなり、産業上の価値を高めるに至った。しかしな
がらポドフィルム属植物の自生地は極めて限られており
、また該植物を栽培するにも増殖速度等に制約があるた
め該植物体や該植物の有用成分の安定な入手に従来から
問題があった。この問題を解決する方法の一つとして、
ポドフィルム属植物の不定胚を利用する該植物の育種、
大量培養、栽培による植物体の供給および該不定胚を原
料とする該植物の組織培養による有用成分の製造が考え
られる。

しかしながら一般に植物の不定胚を再現性良く取得する
ことは極めて困難で、現在のところ限られた植物種に対
する不定胚誘導の報告がなされているにすぎない。さら
に一般に不定胚の誘導は固体培地上でなわれることが多
いため、不定胚の誘導に時間がかかるうえ、不定胚の収
穫に手間がかかり不定胚の工業的な利用の障害となって
いた。

ポドフィルム属植物においては固体培養、液体培養を問
わず現在まで不定胚誘導の例は全く知られていない。

上記のような有用植物の増殖や組織培養の原料を提供す
る手段としての不定胚の取得製造に対していくつかの方
法が提案されている。例えば、植物の未分化細胞に対し
てオーキシン等の植物生長調節物質を添加して培養する
ことにより不定胚を分化誘導せしめる方法と、植物生長
調節物質を使用することなく未分化細胞の培養用の培地
の浸透圧を変化させることにより不定胚を誘導する方法
が知られている。しかしながらこれらの方法も全ての植
物に応用可能ではなく、かつ不定胚誘導の難易、具体的
条件は個々の植物により異なり、ある植物のための条件
をそのまま他の植物に適用することはできない。従って
、ポドフィルム属植物においても該植物に適用可能な不
定胚の誘導方法が必要とされていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、ポドフィルム属植物の不定胚を高効率
で工業的に調製することができる方法を提供しようとす
るものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の課題はポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）
属植物の不定胚を調製する方法において、ポドフィルム
属植物の培養細胞を２重量％以下の糖濃度条件で培養し
、しかる後に糖濃度が２重量％を超える条件で培養する
ことにより不定胚を誘導せしめ、そして該不定胚を収穫
することにより解決される。

〔具体的な説明〕

本発明はポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）　＠
植物の培養細胞を２重量％以下の糖濃度条件で培養し、
しかる後に糖濃度が２重量％を超える条件で培養するこ
とにより該植物の不定胚を分化誘導せしめ、そして所望
により該不定胚を収穫することを特徴とするホトフィル
ム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ）属植物の不定胚の調製方
法に関する。

本発明の方法に用いられるポドフィルム属に属する植物
とは、例えばホトフィルム・ペルタッム（Ｐｏｄｏｐｈ
ｙｌｌｕｍ　ｐｅｔａｔｕｍ）、ホトフィルム・エモデ
ィ　（Ｐ、　ｅｎｏｄｉ）　、ホトフィルム・ヘキサン
ドルム（Ｐ、　ｈｅｘａｎｄｒｕｍ）　、ポドフィルム
・プレイアンツム（Ｐ、ｐｌｅｉａｎｔｈｕｍ）、ポド
フィルムーペルシヘレ（Ｐ、ｖｅｒｓｉｐｅｌｌｅ）な
どのポドフィルム属に属する植物およびそれらの亜種、
変種などは好適に用いることができる。

本発明の方法はボドフィルム属植物の細胞を培養する工
程を含むが、この細胞としてはカルスまたは液体培養細
胞の形で用いるのが普通である。

カルスは常法に従って得ることができる。即ち、ポドフ
ィルム属植物の葉、茎及び根等の各部をよく水洗いした
のちエチルアルコール水溶液、次亜塩素酸ナトリウム水
溶液、塩化ベンズアルコニウム水溶液等で殺菌をし、し
かる後に滅菌水で洗浄する。得られた滅菌済みの植物を
試験管、フラスコあるいはシャーレ等に入れである培地
上に置き培養することにより該植物の細胞または組織を
得る。このとき使用する培地としては一般に使用される
植物組織培養に用いられる培地ならば支障なく用いるこ
とができる。このような培地の例として、基本培地とし
てムラシゲ・スクーグの培地、ガンボルグのＢ５培地、
ニッチ＆ニッチの培地、ホワイトの培地等にビタミン類
及び植物生長調節物質を添加したものが好適に使用でき
上記記載のものに限定されない。植物生長調節物質とし
ては例えばインドール−３−酢酸、α−ナフタレン酢酸
、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等のオーキシン、カ
イネチン、６−ベンジルアデニン等のサイトカイニン等
が挙げられる。これらは単独あるいは他の成分と組み合
わせて用いられる。上記のような培地で２０−３０℃で
培養を続けることにより通常１−４週間で目的とするポ
ドフィルム属植物のカルスを得ることができる。このカ
ルスを固体培地あるいは液体培地で培養することにより
容易にポドフィルム属植物の液体培養細胞を得ることが
できる。

本発明でいう培養とは、上記のようにして得られたポド
フィルム属植物の細胞の固体培地上での培養および液体
培地中での培養をさす。固体培地とは後述する培地成分
を含有する含水ゲル上に上述の細胞を置床して培養する
ことである。含水ゲルの例としては、寒天、ゲランガム
などが好適に用いられる。また液体培養とは、上記のよ
うにして得られたポドフィルム属植物の細胞の一部また
は全部が液相の培地に接触する状態における培養条件で
あり、例えば、通気撹拌式培養槽、エアーリフト型培養
槽、往復あるいは回転振盪されている三角フラスコ、ペ
ーパーウィック法を用いる培養方法などがこれに該当す
る。

ポドフィルム属植物の培養物を長期間にわたり生存状態
で維持し又は増殖させるためには一般に２重量％を越え
る糖の存在が好適であるが、本発明はポドフィルム属植
物の細胞例えばカルス、液体培養細胞を、−時的に、且
つ該細胞の生存が維持される程度において糖飢餓状態に
おくことにより不定胚を誘導することを特徴としている
。この様な飢餓状態に置くためには糖濃度を２重量以下
にすればよいが、好ましくは１．５重量％とし、さらに
好ましくは１重量％以下、例えば０．５重量％とする。

糖濃度を０％又はそれに近い低濃度にすることも可能で
あるが、この場合は、培養期間が長期間、例えば１０週
間を越える場合には、植物細胞の死滅が起こり、好まし
くない。

本発明で用いる培養細胞の糖濃度２重量％以下における
培養細胞の培養は、基本培地として、ムラシゲ・スクー
グの培地、ガンボルグのＢ５培地、ニッチ＆ニッチの培
地あるいはこれらを修正した培地を好適に用いることが
できる。また栄養源としてカゼイン加水分解物やココナ
ツ・ミルクを用いることもできる。植物生長調節物質に
ついてはこれを使用しないか、オーキシンとサイトカイ
ニンを両者の濃度がそれぞれ３ｍＭ以下の条件で単独で
あるいは、混合して好適に用いることができる。

この工程における培養期間は、この工程における糖濃度
等により異るが通常２日から１０週間が好適である。

本発明の方法によれば、低糖濃度培地で培養した培養物
を次に通常の糖濃度の培地で培養するが、この場合の糖
濃度は２重量％を越える濃度であればよい。この濃度は
好ましくは２．５重量％以上であり、例えば約３重量％
である。

本発明で用いる培養細胞の糖濃度２重量％を超える培地
における培養細胞の培養は、基本培地として、ムラシゲ
・スクーグの培地、ガンボルグのＢ５培地、ニッチ＆ニ
ッチの培地あるいはこれらを修正した培地を好適に用い
ることができる。とくにマグネシウムイオンの補強は不
定胚の誘導を加速する好ましい結果をもたらす。また栄
養源としてカゼイン加水分解やココナツ・ミルクを用い
ることもできる。植物生長調節物質についてはこれを使
用しないか、オーキシンとサイトカイニンを両者の濃度
がそれぞれ３ｍＭ以下の条件で単独であるいは、混合し
て好適に用いることができる。

この工程に要する培養期間は通常２日から５週間で、こ
の期間の経過とともに目的とするポドフィルム属植物の
不定胚が培養物中に誘導されてくる。

上述の２つの工程を通じて共通の培養条件として好適に
用いられるものとして、培養温度は１０３０℃、照明は
明暗側条件が挙げられる。さらに糖として使用可能なも
のとして、ショ糖、グルコース、ガラクトースが例とし
て挙げられる。

このようにして得られた不定胚は、そのまま次の培養工
程の材料として用いることができる。あるいは、培養が
固体培地上であればピンセットなどを用いて容易に収穫
することが可能である。また培養が液体培養であれば濾
過などの操作により容易に収穫することができる。

以下の発明を用いることにより、自然環境、人手の困難
等の外部要因に左右されることなく工業的に価値のある
ポドフィルム属植物の不定胚を製造することが可能とな
った。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明は実施例により制限されない。

実施例１ （カルスの形成） 十分水洗したポドフィルム・ペルタツムの根茎を７０％
アルコールを用いて２分間殺菌した。次に１％の次亜塩
素酸ナトリウムにより１分間殺菌した後、滅菌水により
十分に洗浄した。この滅菌した根茎を無菌的雰囲気で長
さ約５　ｍｍにきざみ、ムラシゲ−スクーグ培地（ショ
糖３重量％含有）にα−ナフタレン酢酸１■／し、カイ
ネチン０．２■／Ｌ及びカゼイン加水分解物５０（）■
／Ｌを添加した１％濃度の寒天培地に置床し５週間暗所
で静置培養したところカルスが発生した。このカルスを
数回継代培養した。

（低糖濃度処理） 次に、このカルスを、ショ糖濃度が０．５％のムラシゲ
・スクーグ培地にカゼイン加水分解物５００■／Ｌを添
加した液体培地１００−を含む３０〇−フラスコに移し
た５週間暗所にて２５℃、１３０ｒｐｍの振盪速度で回
転式振盪培養を行った。

（不定胚の形成） その後、培養物をショ糖濃度３重量％のムラシゲ・スク
ーグ培地にα−ナフタレン酢酸１ｍｇ／Ｌ１カイネチン
０．０２ｇ／Ｌ、カゼイン加水分解物５００ｍｇ／Ｌを
添加した液体培地１００ｍ１を含む３０Ｃ１−フラスコ
に移して２週間暗所にて２５℃、１３Ｃ１ｒｐｍの振盪
速度で回転式振盪培養を行った。培養フラスコ内の細胞
の３０重量％が不定胚であった。

比較例１ 実施例１と同様の方法を行った。但し、低濃度処理の段
階の培地として、ショ糖濃度が３重量％でその他の組成
が同じ培地を用いた。この場合、カルスの増殖が続き、
多量のカルスが得られたが不定胚は得られなかった。

比較例２ 実施例１と同様の方法を行った。但し、不定胚の形成の
段階の培地としてショ糖濃度３重量％ではなく０％の培
地を用いた。この場合、不定胚が形成されないのみなら
ず、カルスが死滅していた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ポドフィルム（￥Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ￥）属植
   物の細胞を糖濃度２重量％以下の条件で培養した後、糖
   濃度２重量％を越える条件で培養することにより該植物
   の不定胚を誘導せしめることを特徴とするポドフィルム
   属植物の不定胚の調製方法。