NL9202117A

NL9202117A - Gekweekte cellen van Quillaja sp.

Info

Publication number: NL9202117A
Application number: NL9202117A
Authority: NL
Original assignee: Seed Capital Investments
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1992-12-07
Publication date: 1994-05-16

Description

Gekweekte cellen van Quillaja sp.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op gekweekte cellen van Quillaja sp.f een werkwijze voor het bereiden van actieve substanties uit Quillaja sp., verschillende produkten welke de actieve substanties omvatten, een werkwijze voor het bereiden van ImmuunStimulerende COMplexen (ISCOM's) uit de actieve substanties en vaccins en adjuvan-tia welke de ISCOM's bevatten, adjuvans ISCOM-matrix (Lövgren, K. proefschrift, ISBN 91-576-3202-2), het adjuvans Quil A (Dalsgaard, K., Arch. ges. Virusforsch. 44, 243-254 (1974), het adjuvans QS 21 (Jia-Yan Wu, J. Immunology 148, 1519-1525 (1992), en andere saponine adjuvantia.

Immuunstimulerende complexen (zogeheten ISCOM's) zijn negatief geladen pentagonale dodecahedra welke spontaan vormen door het mengen van cholesterol en de saponine van Quillaja sp.. Tijdens de vorming van ISCOM's kunnen eiwitten en andere lipiden geïncorporeerd worden. Van ISCOM's is gevonden dat zij immuunresponsen in sterke mate verhogen en zij worden derhalve gebruikt als een immunologisch adjuvans en drager/afgiftesysteem in bijvoorbeeld vaccins. Quil A, QS 21 en andere saponine adjuvantia zijn produkten die zijn afgeleid van de natuurlijke schors, die immunologische adju-vansaktiviteit heeft in een verscheidenheid van vaccins.

Voor de produktie van ISCOM's is er een groeiende behoefte aan onder andere Quil A. Quil A is een mengsel van de actieve substanties (saponinen) die afkomstig zijn van de schors van de Quillaja sp. boom die voornamelijk in Chili groeit. De natuurlijke bronnen van Quillaja schors zijn beperkt. In feite zijn oude bomen heden ten dage reeds zeldzaam en toch worden nog 1.000 tonnen schors per jaar geëxporteerd uit Chili. Vanwege de toenemende vraag naar actieve substanties (saponinen) voor verschillende doeleinden is in de toekomst een tekort aan het materiaal te verwachten .

Het is derhalve zeer wenselijk andere manieren te vinden voor het isoleren van Quil A en andere actieve substanties van Quillaja sp. (saponinen) voor de vervaardiging van ISCOM's, als adjuvantia en voor verschillende andere toepassingen.

Nu is gevonden dat cellen, weefsels of organen van het Quillaja sp. plantelichaam in vitro gekweekt kunnen worden in een vloeibaar of op een vast medium.

De uitvinding verschaft derhalve gekweekte cellen van Quillaja sp. voor de bereiding van actieve substanties van Quillaja sp.. De gekweekte cellen kunnen afkomstig zijn van een callus-celkweek, waarin weefsels of organen gekweekt worden op een vast medium. De term "callus·1 verwijst naar een amorfe klomp cellen welke hun orgaanvormende capaciteit verloren hebben, en welke klomp gevormd wordt wanneer een fragment van het plantelichaam in weefselkweek gebracht wordt op een vast medium. De zo verkregen callus vertoont een externe vorm die lijkt op het agglutinatieweefsel van het plantelichaam. De gekweekte cellen kunnen eveneens afkomstig zijn van een suspensie-celkweek. De term "suspensie" celkweek verwijst hierin naar een fijne vlokkige dispersie van cellen die gevormd wordt wanneer stukken callus verder geënt en gekweekt worden in een vloeibaar medium onder aerobe omstandigheden.

Volgens de uitvinding kunnen verschillende soorten Quillaja planten gebruikt worden voor weefsel- of suspensie-kweek, bijvoorbeeld Quillaja saponaria Molina, Quillaja smegmadermos, Quillaja brasiliensis en dergelijke.

De conventionele medium-samenstelling voor weefselkweek worden genoemd in de literatuur. Het Medium van White (White P.R. Growth 7:53 (1943)), het Medium van Heller (Heller R. proefschrift Sc. Nat. Paris (1953)), het Medium van Murashige en Skoog (Murashige T. en Skoog F. Physiol. Plant. 15:473 (1962)), het Medium van Linsmaier en Skoog (Linsmaier E.M. en Skoog F. Physiol. Plant. 18, 100 (1965)), en het Medium van Gamborg, Miller en Ojima's (Gamborg O.L., Miller R.A. en Ojima K., Exp. Cell. Res. 50, 151 (1968)), kunnen bijvoorbeeld gebruikt worden in de onderhavige uitvinding. Deze bekende media bestaan uit anorganische substanties en andere sporenelementen welke tot nu toe gebruikt zijn in de media voor de waterkweekmethode voor planten, zoals saccharide, auxinen (groeistimulerende substanties) cytokininen, vitaminen en aminozuren. In het bijzonder worden de volgende gebruikt in deze media: anorganische zouten gekozen uit kaliumchloride, calciumchloride, kaliumnitraat, calciumnitraat, ammoniumnitraat, natriumnitraat, magnesiumsulfaat, kaliumfosfaat, natriumsulfaat, magnesiumnitraat, natriumfosfaat, ijzerchloride, ijzersul-faat, NA2-EDTA (NA2-ethyleendiamine tetra-azijnzuur) , man-gaansulfaat, zinksulfaat, boorzuur, kaliumjodide, kopersul-faat, natriummolybdaten, aluminiumchloride, cobaltchloride, en dergelijke, saccharide gekozen uit sucrose, glucose, fructose, mannose en dergelijke, auxinen zoals 2,4-dichloor-fenoxyazijnzuur, a-naftaleenazijnzuur, indol-3-azijnzuur, cytokinen zoals kinetine, benzylaminopurine, zeatine, 2-isopentenyladenine en dergelijke, vitaminen zoals thiamine hydrochloride, pyridoxine hydrochloride, nicotinezuur, myoinositol, biotine en aminozuren zoals glycine. Tabel 1 toont voorbeelden van conventionele mediasamenstellingen van weefselkweken.

Na2EDTA -- 37,34 37,34

MnS04.4H20 7 22,3 22,3

ZnS04.7H20 3 11,5 8,6 KI 0,75 0,83 0,83

CuS04.5H20 0,0025 0,025 0,025

Mo02 0,00015

NagMoC^. 2H20 — 0,25 0,25 COC12.6H20 — 0,025 0,025

Thiamine. HC1 0,1 0,1 0,4

Pyridoxine.HCl 0,1 0,5

Nicotinezuur 0,5 0,5

Myo-inositol — 100 100

Glycine 3,0 2,0

Kinetine — 0,2 0,2

Indole acetic acid — 2,0 2,0

Sucrose 20000 30000 30000

Voor de weefselkweek van Quillaja sp. volgens de onderhavige uitvinding worden het plantelichaam van Quillaja sp. planten, of fragmenten van blad, stam, wortel, bloem, zaad of andere organen, of weefsels van de plant, gewassen en aan het oppervlake gesteriliseerd, op het steriele agar-medium voor weefselkweek, welke zich in een buis of fles bevindt, die is afgeplugd met katoenwol, cellulose of een plastic dop en één van de samenstellingen heeft zoals beschreven in de bovenstaande tabel 1, geplaatst en bij 25-30°C geïncubeerd.

De fragmenten of organen of weefsels zwellen op en na 2-6 weken wordt wit, geelachtig wit of groenachtig geel callus verkregen. Dergelijke callus kan geleidelijke gezuiverd worden door middel van het herhalen van dezelfde vaste-mediumkweek, dat wil zeggen door het enten van vers vast medium met kleine stukjes callus, die gevormd zijn in de voorgaande vaste-mediumkweek. .

De callus, die door subcultuur op deze wijze hervormd en gezuiverd is op het vaste medium wordt vervolgens geënt in een vloeibaar medium met één van de samenstellingen zoals beschreven in tabel 1, en gekweekt op een schudder bij een temperatuur van 25-30°C gedurende 2-3 weken teneinde een suspensiecelkweek te verkrijgen. Het inoculum is bijvoorbeeld ongeveer 3 g (vers gewicht) callus op 100 ml vloeibaar medium, en de callus vermenigvuldigt zich in de kweekvloei-stoffen in de toestand van een vlokkige suspensie, dat wil zeggen als "Quillaja cellen". Deze Quillaja cellen worden verder gesubkweekt door het herhalen van overeenkomstige schudkweken in vloeibaar medium, dat wil zeggen door het enten van vers vloeibaar medium met een deel van de eerdere gekweekte suspensie, die Quillaja cellen bevatte.

De suspensiekweek, die wordt verkregen in de schud-kweek, wordt na opschaling geënt in een vloeibaar medium dat zich bevindt in een bioreactor van pyrex of roestvrijstaal, en gekweekt onder beluchting terwijl voorzichtig geschud wordt. De hoeveelheid inoculum is ééntiende van de totale hoeveelheid medium en intensief schudden is ongunstig omdat de membranen van Quillaja cellen daardoor kunnen breken. De hoeveelheid lucht voor beluchting is 0,2-30 liter/liter medium/minuut en de kweekperiode is 2-3 weken, dat wil zeggen hetzelfde als die van de bovenstaande schudkweek. De opbrengst aan droog gewicht van deze Quillaja cellen is 30-35% van de suiker, die geconsumeerd is in de suspensiekweek en loopt op tot 6,9 g per liter medium. Het zal 2-6 weken duren voor agarmediumkweek en 2-3 weken voor elke vloeibare schudkweek en beluchte vloeistof bioreactorkweek, dus in totaal 6-12 weken voor het verkrijgen van een suspensie, die Quillaja cellen als ruw materiaal voor de bereiding van actieve substanties bevat, waaruit saponinen voor de vorming van ISCOM's geïsoleerd kunnen worden. Wanneer echter de suspensiekweek eenmaal verkregen is in de beluchtingskweek in de bioreactor kan een semicontinu proces toegepast worden waarin één deel van de kweek uit de reactor genomen wordt terwijl een ander deel in de bioreactor gelaten wordt en vers steriel medium toegevoegd wordt aan het overblijvende deel teneinde de kweek van Quillaja cellen voort te zetten.

De actieve substanties die bereid worden uit de gekweekte cellen van Quillaja sp. zijn vooral saponinen. Saponinen zijn glycosiden die wijd verspreid voorkomen in planten. Saponinen bestaan uit een sapogenine dat het aglu-con gedeelte van het molecuul vertegenwoordigt, en verschillende suikers. Het sapogenine is in dit geval een triterpeen en het suikergedeelte kan bestaan uit rhamnose, fucose, arabinose, xylose, galactose, glucose, glucuronzuur en mogelijk andere minder belangrijke suikers.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van actieve substanties uit Quillaja sp., omvattende de stappen van: a) het kweken van cellen van Quillaja sp. in vitro; en b) het bereiden van de celkweekextract dat actieve substanties omvat.

Gevonden is dat het extract van een Quillaja sp. celkweek, welke actieve substanties omvat, in twee fracties gescheiden kan worden, waarbij één fractie niet-dialyseer-baar is en de andere een dialyseerbare fractie is. De term "dialyseerbaar", zoals hierin gebruikt, verwijst naar verbindingen die uit een dialysezak verwijderd worden na dialy-seren van een ruw extract van een Quillaja sp. celkweek tegen zoutoplossing gedurende ongeveer 24 uur. De term "niet-dialyseerbaar", zoals hierin gebruikt, verwijst naar verbindingen die achterblijven in een dialysezak na dialyse-ren van een ruw extract van een Quillaja sp. celkweek tegen zoutoplossing gedurende ongeveer 24 uur.

Zowel de dialyseerbare als de niet-dialyseerbare fractie vertonen interessante eigenschappen. De verbindingen van de dialyseerbare fractie zijn allereerst in staat schuim te induceren in waterige oplossingen. Dit wordt gedemonstreerd door het feit dat het dialysaat snel schuimt wanneer het geschud wordt. Verder kunnen de actieve substanties van de dialyseerbare fractie dienen als emulgatoren voor het produceren van olie-in-water emulsies, welke dezelfde eigenschappen vertonen als de verbindingen van de "Tween" series. Experimenten tonen bijvoorbeeld aan dat 9 ml dialysaat en 1 ml minerale of bio-afbreekbare olie, zoals squalaan, een stabiele emulsie vormen wanneer zij heftig geschud worden of behandeld met ultrasonificatie. De dialyseerbare fracties zijn eveneens in staat ammoniak te binden.

De dialyseerbare fractie van de actieve substanties, die verkregen zijn uit de gekweekte cellen van Quillaja sp., hebben derhalve eigenschappen die gebruikt kunnen worden voor dezelfde technische doeleinden als extracten van de natuurlijke schors. Voorbeelden van dergelijke technische doeleinden zijn hun gebruik als emulgatoren in voedsel en dranken en in fotografische filmemulsies. Ze zijn eveneens bruikbaar als additieven in de behandeling van afvalwater en slurries omdat de dialyseerbare actieve fractie oppervlakte-korsten afbreekt en ammoniak en geurvorming in afvalwaterfa-brieken, slurrietanks voor vloeibare mest in varkensproduk-tiestallen, slurriecontainers en dergelijke vermindert waardoor microbiële en/of enzymatische afbraak vergemakkelijkt worden en stank van industrieel, huishoudelijk, boerderij- en dierlijk afval verminderd wordt. Ze kunnen eveneens gebruikt worden als een additief voor diervoeders teneinde de geur van hun uitscheidingsprodukten te verminderen en het gebruik van voedsel te verhogen. Hun schuimend vermogen maakt hen bruikbaar als toevoegingen in dranken, zoals frisdranken, of als een schuimproducerend middel in brandblussers. Ze kunnen eveneens gebruikt worden als deter-gentia in bijvoorbeeld shampoos en dergelijke.

De niet-dialyseerbare en mogelijk een deel van de dialyseerbare fractie bevatten de actieve substanties, die bruikbaar zijn als IS COM-vormende en adjuvansmiddelen. De substanties zijn niet-dialyseerbaar omdat zij een sterk intrinsiek karakter voor het vormen van micellen hebben.

Deze micellen hebben het vermogen te complexeren met cholesterol en andere lipiden hetgeen leidt tot de ISCOM-vorming. Maar deze eigenschappen betekenen eveneens dat de vastgehouden substanties hemolytisch zijn voor rode bloedcellen zoals SRBC (schaap rode bloedcellen). Deze hemolytische eigenschap kan gebruikt worden voor hun bepaling in het celkweekex-tract.

De immuunstimulerende complexen of een matrix daarvan volgens de uitvinding worden bij voorkeur geconstrueerd door: a) het bereiden van een niet-dialyseerbare fractie uit een extract van gekweekte cellen van Quillaja sp.; b) het toevoegen van tenminste één lipide en tenminste één detergens aan de niet-dialyseerbare fractie; c) het laten vormen van ISCOM's of ISCOM-matrix; en d) het verwijderen van het detergens.

De op deze wijze bereide ISCOM's zijn zeer geschikt om gebruikt te worden in verschillende vaccins als immunologische adjuvantia.

De gekweekte cellen van de onderhavige uitvinding zijn in vele opzichten voordelig voor het bereiden van actieve substanties van Quillaja sp..

De natuurlijke bron voor de immunologische en ISCOM-vormende substanties is bijvoorbeeld een zeer variabel materiaal, de individuele componenten waarvan moeilijk te scheiden zijn. De gekweekte cellen van de uitvinding zijn een veel betrouwbaardere wijze van produceren van de actieve substanties. Een ander voordeel is dat de celkweekextracten gemaakt kunnen worden onder "goede vervaardigingsprincipes" (gmp) . De gekweekte celprodukten zijn vrij van veel van de (bijvoorbeeld gekleurde) substanties die wel in het natuurlijke extract van de plant voorkomen. Het resulterende produkt is veel homogener.

De celkweken, in het bijzonder de suspensiekweek kan gesubkloneerd worden voor het opzetten van cellijnen, welke individuele substanties zullen produceren in plaats van een groep van verwante substanties, hetgeen het geval is in de natuurlijke plant. In de voorbeelden zal aangetoond worden dat één van de verkregen suspensiekweekcellijnen een meer beperkt saponinepatroon in HPTLC vertoont dan de calluskweek waaruit zij zijn afgeleid, het patroon van welke calluskweek zelf reeds meer beperkt is dan dat van natuurlijke extracten.

De gekweekte cellen voor het bereiden van actieve substanties zullen goedkoper zijn wanneer ze opgeschaald zijn, omdat de fermentatie van een plantsuspensiecelkweek gemakkelijk is en het medium in grote volumen goedkoop is. Verder zullen de actieve substanties veel gemakkelijker te zuiveren en bevestigen zijn dan substanties uit de natuurlijke plant, omdat alle parameters die de produktie en zuivering beheersen op betrouwbare wijze gevolgd kunnen worden.

De onderhavige uitvinding zal verder geïllustreerd worden door middel van de volgende voorbeelden welke op geen enkele wijze de bedoeling hebben de omvang van de uitvinding te beperken.

VOORBEELD 1

Bereiding van gekweekte cellen

De internodiumexplanten van stammen van Quillaja saponaria Molina werden aan het oppervlak gesteriliseerd met eerst waterige ethanol 70°B (1 min.) en NaOCl 20°Ch met een druppel Teepol per liter gedurende 20 minuten (precies tweemaal 10 min.), 3 maal gewassen met steriel gedistilleerd water en op een vast gemodificeerd basaalmedium van Murashi-ge en Skoog (M. en S. Physiol. Plant. 1962 15, 473), welke gewoonlijk gebruikt wordt voor plantencelkweken, geplaatst. De modificaties betreffen koolhydraten: saccharose wordt vervangen door glucose (zelfde concentratie), KI: 0,75 mg/1 in plaats van 0,83, vitamine: thiamine.HC1 1 mg/1, nicotine-zuur 0,1 mg/1, pyridoxine.HCl 0,1 zonder glycine en pH 5,7. Dit medium werd eerder met succes gebruikt voor weefselkweek van Saponaria Officinalis en Gypsophilla paniculata. Aan dit basale medium werden twee fytohormonen toegevoegd: één auxine gekozen uit 2,4 D (2,4-dichloorfenoxyazinezuur), NAA (naftaleenazijnzuur) of IBA (indolboterzuur) in drie concentraties: ΙΟ'5 Μ, 10’6 M of 10'7 M; en één cytokinine gekozen uit kinetine (K) of benzylaminopurine (BAP of BA). Vervolgens werden 54 media bereid en 5 explanten op elk type medium geplaatst in testbuizen van 25 cm lengte en 2,5 cm doorsnede (diameter). Deze buizen werden in een kweekkamer bij 25°C geplaatst met een lichtperiode van klassiek wit neon van 12 uur.

Na 3 tot 6 weken verschenen primaire callussen en deze werden gesubkweekt op het zelfde verse medium. De calluskweken, die op elk medium verkregen werden, worden beschouwd als één originele cellijn. De frequentie van de subkweek van elke cellijn hing af van de groeisnelheid van de cel en varieerde van één tot drie maanden. De cellijnen die na drie maanden niet gesubkweekt waren (dat wil zeggen waarvan de groeisnelheid te laag was) werden weggegooid. Zes maanden na verkrijging van de calluscellijnen (de kortste tijd die nodig is om een cellijn als zo stabiel mogelijk te kunnen beschouwen) werd callusbiomassa van de hoofdcellijnen getest voor het bepalen van het saponinegehalte en van elke calluscellijn werd een eerste celsuspensie opgezet voor het verhogen van de groeisnelheid en daardoor de biomassaproduk-tie. Van één van de suspensiecellijnen, die NAA ΙΟ'5 M/K10'6 M genoemd werd, werd gevonden dat hij een ISCOM-saponine producerende cellijn is.

De cellijn die MS-ANA5/K6-Quil.sap.Mol. genoemd wordt, werd gedeponeerd bij de Deutsche Sammlung von Mi-kroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Mascheroder Weg lb, W-3300 Braunschweig, B.R.D.) en kreeg het depottoegangs-nummer DSM .......

Een aantal keuzen in de omstandigheden voor het verkrijgen van deze cellijnen zijn het resultaat van eigen ervaring van de uitvinders. Zo worden bijvoorbeeld interno-diën direct gebruikt in plaats van andere delen van de stam (knoppen en bladeren) omdat door Japanse wetenschappers bij het gebruik van Panax ginseng (Kubo et al., J. Nat. Prod. 1980, 43, 278) en bij het gebruik van Bupleurum falcatum i (Tani et al., J. Chromatogr. 1986, 360, 407) en door uitvinders bij het gebruik van Gypsophila paniculata (Henry et al., Phytochemistry 1991, 30, 1819) gevonden werd dat de saponine biosynthese optrad in het floëemdeel van de stam van de planten die bestudeerd werden. Derhalve wordt het als > het beste beschouwd om het biosynthetische deel van de planten in kweek te zetten voor het verkrijgen van de pro-duktie van de verbinding in vitro. Dat lijkt voor de hand te liggen maar deze mening wordt niet gedeeld door vele deskun- digen op het gebied, omdat gedacht wordt dat de plantecellen in vitro totipotent zouden kunnen worden. Theoretisch zou elke cel van elk deel van een plant in staat moeten zijn te prolifereren terwijl hij zijn biosynthetische eigenschap behoudt, maar tot nu toe is dat niet mogelijk geweest voor een aantal plantespecies, omdat de zeer nauwkeurige molecu-lair-biologische mechanismen die de celproliferatie in planten tot stand brengen tot nu toe slecht begrepen zijn. Het is mogelijk dat één van de specifieke weefsels in de plant die in staat is te prolifereren tot celkweken het cambium is. Aan de andere kant kan het cambium het weefsel zijn waaruit het floëemweefsel in de gehele plant en in in vitro kweken ontstaat.

VOORBEELD 2 Extractieprocedure

Teneinde de afbraak van substanties te vermijden werden de vaste stoffen van zowel de callus- als de suspen-siecelkweek gelyofiliseerd na oogsten. De gelyofiliseerde vaste stoffen werden in de vriezer bij -20°C gehouden tot gebruik.

Voor het maken van een extract werden deze vaste stoffen gewogen en werd 10 maal zoveel water toegevoegd.

Deze suspensie werd eerst gehomogeniseerd door "Ultraturrax" en vervolgens door ultrasone desintegratie (MSE) gedurende 3 x 30 minuten bij maximaal vermogen. Na roeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur werd het mengsel bij 5.000 g gedurende 30 minuten gecentrifugeerd. Het supernatant werd geïsoleerd en opgeslagen bij -20°C tot verdere analyse.

VOORBEELD 3 HPTLC

0,4 microliter van callusextracten van de cellijnen werd als een band opgebracht met gebruikmaking van een Deaga applicator op HPTLC platen, Merck Kieselgel 60 10 x 10 cm.

De platen werden ontwikkeld in een Camag horizontale ontwikkelkamer door het oplosmiddel dat gevormd wordt door 200 mg

CaCl2 . 2 H20, dat is opgelost in 10 ml water + 40 ml methanol + 40 ml chloroform.

De platen werden gedurende 3 minuten in de centrale kamer verzadigd met damp van 10 ml van de oplosmiddelen, waarna de platen gedurende 25 minuten ontwikkeld werden door middel van 2 ml oplosmiddel in het reservoir. De platen werden gedurende 5 minuten gedroogd in een zuurkast, besproeid met een mengsel van geconcentreerd zwavelzuur en methanol 1:1, en in een oven gedurende 10 minuten bij 120°C verhit. De afzonderlijke banden werden densitometrisch gemeten met gebruikmaking van een 256 grey scale scanner en de Apple Macintosh software ScanAnalysis.

Bijna alle callus- en suspensiekweekextracten vertoonden de aanwezigheid van twee hoofdbanden. Deze banden komen in hun migratiesnelheid overeen met overeenkomstige banden, die aanwezig zijn in de extracten van de natuurlijke schors van Quillaja sp., die geïmporteerd wordt uit Zuid-Amerika. Overeenkomstig de natuurlijke verbindingen passeren deze twee banden een dialysemembraan en/of ultrafiltratie-membranen met een cut off van meer dan 10.000, hetgeen aangeeft dat zij geen micellen vormen. Figuur 1 toont de resultaten voor een van de calluscelkweken ("Lc"). "A" geeft het punt van aanbrengen weer. "l" en ”2" geven de twee hoofdbanden weer, die gevonden worden in de HPTLC, en "F" staat voor oplosmiddelfront.

Na dialyse tegen 1 liter zoutoplossing gedurende 24 uur wordt de niet-dialyseerbare fractie, die achterblijft in de dialysezak, onderworpen aan HPTLC. De resultaten worden getoond in figuur 2. ”311 en "4" geven de twee hoofdbanden weer die in de HPTLC gevonden worden.

VOORBEELD 4 Hemolytische bepaling

Seriële tweevoudige verdunningen van plantecel-kweekextracten worden gemaakt in 0,85% NaCl. Aan 1,5 ml van deze verdunningen wordt 0,5 ml van een schaap rodebloedcel-suspensie toegevoegd (gewassen en gestandariseerd op een O.D. waarde van 28 bij 510 nm). Na mengen door middel van omkering gedurende 10 minuten worden de monsters gecentrifugeerd bij 2000 x G gedurende 5 minuten. De supernatanten worden spectrofotometrisch bij 510 nm gemeten en de waarden worden gebruikt als een maat voor hemolyse (hemoglobine-, vrijgifte).

De resultaten worden getoond in figuur 4. Het positieve suspensiekweekextract "L", dat hierin eveneens "Ls" genoemd wordt, vertoont een belangrijk hogere hemoglo-bine-vrijgifte dan het laagproducerende suspensiecelkweekex-tract "K" en dan de nietproducerende suspensiecelkweek "M", die hierin eveneens "Ms" genoemd wordt.

21 extracten van calluskweken (A1 tot P in tabel 2), die bij verschillende omstandigheden gekweekt zijn werden in dezelfde bepaling getest en vertonen een variabel gehalte aan hemolytische substanties: hoger naar mate de gestippelde lijn bij de respectieve letter langer is. De calluskweek L in tabel 2 is de basis van suspensiekweek L die hierin eveneens "Ls" genoemd wordt.

Tabel 2

Hemolyse-index Calluskweekextracten Ouillaia saponaria Molina

Wanneer arbitraire interpolaties gemaakt worden in de hemo-lysecurve met gebruikmaking van een absorptie op 0,5 als eindpunt worden de volgende waarden verkregen: A' 2.5--- B' 1.2- C' 24------------------------ D' 1.9 — E' 1.4- E" 1.4- F 7.5-------- i Fi 8.5--------- F" 3.8---- F"' 4.5----- G 9.0--------- I 2.4— I' 3.6---- J 5.0----- K 50-------------------------------------------------- L 20-------------------- M 7.0------- N 7.0------- 0 20-------------------- O' 40---------------------------------------- P 3.4--- VOORBEELD 5 ISCOM-vormend vermogen Eén ml extract "Ls" (suspensiecelkweek L) wordt gedialyseerd tegen 1 liter zoutoplossing gedurende 24 uur.

Aan een niet-dialyseerbare fractie van het extract wordt 10 microliter lipidemengsel toegevoegd (cholesterol en fosfa-tidylcholine elk in een concentratie van 20 mg/ml in een 20% waterige oplossing van het detergens MEGA 10). Het mengsel wordt door omkeren gemengd gedurende een minimum van 1 uur teneinde de reactie te laten verlopen. Het wordt opnieuw gedialyseerd tegen 1 liter zoutoplossing voor het verwijderen van het detergens. De inhoud van de dialysezak wordt nu onderzocht op ISCOM matrixstructuren in de electronenmicro-scoop (EM) door negatieve kleuring met 2% uranyl acetaat op met koolstof beklede grids. Figuur 3 toont een EM foto die toont dat ISCOM's gevormd zijn.

VOORBEELD 6 i Adjuvansbepaling in cavia's

Uit densitometrische analyse van de HPTLC platen van de niet-dialyseerbare fractie van de extracten werd geschat dat de gelyofiliseerde calluskweek "Lc'' ongeveer 1% hemoly-tische/ISCOM matrix vormende substanties bevatte. De gelyo-i filiseerde suspensiecelkweek "Ls" bevatte ongeveer 0,5%. De "Ls" suspensiecelkweek werd geproduceerd uit de "Lc" calluskweek en aangezien beide belangrijke hoeveelheden (ongeveer hetzelfde als in de natuurlijke schors) hemolytische en ISCOM vormende saponinen bevatten, werden de extracten van deze twee vormen van kweken getest op immunologische adju-vansaktivteit. Het suspensiecelkweekextract "Ms", dat deze substanties niet produceerde, werd meegenomen als een negatieve controle. Het adjuvans Quil A, dat geëxtraheerd is uit de natuurlijke schors, diende als een positieve controle.

Een totaal van 30 cavia's is gebruikt voor elke geteste substantie. Drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd met ovalbumine als antigeen en drie onafhankelijke experimenten met geïnactiveerd parvovirus van het varken (PPV) als antigeen. Elke individuele groep bestond uit vijf cavia's. Er werden vijf groepen getest met het antigeen ovalbumine of het antigeen PPV.

Groep 1: Zoutcontrole

Groep 2: + Quil A, 50 microgram, positieve controle.

Groep 3: + callusextract "Lc", 50 microgram.

Groep 4: + suspensie-extract "Ls", 50 microgram.

Groep 5: + suspensie-extract "Ms", 50 microgram, negatieve controle.

De resultaten worden getoond in de figuur 5. Beide extracten "Lc" en "Ls", onafhankelijk van het feit of ze verkregen waren uit callus- of suspensieplantecelkweek (na dialyse), hadden dezelfde adjuvansaktiviteit in cavia's als Quil A van de natuurlijke plant. Het extract "Mc" dat negatief was voor hemolytische saponinen was eveneens negatief voor adjuvansaktiviteit.

De onderhavige uitvinding verschaft gekweekte cellen van Quïllaja sp. en een werkwijze voor het bereiden van actieve substanties daaruit, welke actieve substanties gebruikt kunnen worden voor verschillende doeleinden zoals ISCOM vorming en als emulgatoren, detergentia, schuimmidde-len en dergelijke.

Claims

1. Gekweekte cellen van Quillaja sp. voor de bereiding van actieve substanties van Quillaja sp..

2. Gekweekte cellen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de actieve substanties saponinen zijn.

3. Gekweekte cellen volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de cellen afkomstig zijn van een callus-weefselkweek.

4. Gekweekte cellen volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de cellen afkomstig zijn van een suspensie-celkweek.

5. Gekweekte cellen volgens één der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het Quillaja sp. een species is gekozen uit de groep die bestaat uit Quillaja saponaria Molina, Quillaja smegmadermos, Quillaja brasiliensis.

6. Gekweekte cellen van Quillaja saponaria Molina verkrijgbaar onder DSM toegangsnummer ......

7. Actieve substanties geëxtraheerd uit gekweekte cellen van Quillaja sp..

8. Preparaat, omvattende actieve substanties, die geëxtraheerd zijn uit gekweekte cellen van Quillaja sp..

9. Preparaat volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het preparaat een niet-dialyseerbare fractie van de actieve substanties van Quillaja sp. omvat.

10. Preparaat volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het preparaat een dialyseerbare fractie van de actieve substanties van Quillaja sp. omvat.

11. Werkwijze voor het bereiden van actieve substanties van Quillaja sp. omvattende de stappen van: a) het kweken van cellen van Quillaja sp. in vitro; en b) het bereiden van een extract van de gekweekte cellen omvattende de actieve substanties.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het celextract gedialyseerd wordt teneinde een dialyseerbare en niet-dialyseerbare fractie te verkrijgen.

13. Schuimmiddel, omvattende de dialyseerbare en/of de niet-dialyseerbare fractie van een extract van gekweekte cellen van Quillaja sp..

14. Emulgator, omvattende de dialyseerbare en/of de niet-dialyseerbare fractie van een extract van gekweekte cellen van Quillaja sp..

15. Ammoniakbindend middel, omvattende de dialyseerbare en/of de niet-dialyseerbare fractie van een extract van gekweekte cellen van Quillaja sp..

16. Werkwijze voor het bereiden van immuunstimule-rende complexen (ISCOM's) of immuunstimulerende complexma-trix (ISCOM matrix), omvattende de stappen van: a) het bereiden van een niet-dialyseerbare en/of dialyseerbare fractie van een extract van gekweekte cellen van Quillaja sp.; b) het toevoegen van tenminste één lipide en tenminste één detergens aan de niet-dialyseerbare fractie; c) het laten vormen van de ISCOM's of de ISCOM matrix; en d) het verwijderen van het detergens.

17. Immuun-stimulerende complexen bereid door middel van de werkwijze volgens conclusie 16.

18. Immuun-stimulerende complexmatrix bereid door middel van de werkwijze volgens conclusie 16.

19. Immunologisch adjuvans, omvattende immuunstimulerende complexen bereid door middel van de werkwijze volgens conclusie 16.

20. Immunologisch adjuvans, omvattende immuunstimulerende complexmatrix bereid door middel van de werkwijze volgens conclusie 16.

21. Immunologisch adjuvans, omvattende de dialyseerbare en/of de niet-dialyseerbare fractie van extracten van gekweekte cellen van Quillaja sp..