JP2000060224A - 人工種子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高い発芽率を有する改良された人工種子を提
供すること。 【構成】 植物体組織を人工胚乳及び人工膜によって包
埋してなる人工種子において、前記人工胚乳に真核細胞
の微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませてなる
ことを特徴とする人工種子。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は人工種子に関する。 【０００２】 【従来の技術】一般に、植物組織培養においては、植物
の組織や器官あるいは培養細胞を、生長に必要な無機塩
類、ビタミン、糖などのほかに植物ホルモン（オ−キシ
ン類、サイトカイニン類、ジベレリン類、エチレン等）
を加えた培地を用いて培養し、カルスをつくらせたり、
そのカルスを植え継いで培養を続け有用物質を得たり、
またはそのカルスから植物体を再生（復元）させたりし
ている。 【０００３】植物組織培養技術を用いて植物体を再生さ
せる方法としては、出発材料により脱分化系と分化系の
２種に大きく分けられる。脱分化系はカルスや液体培養
細胞などの脱分化した状態を経由して植物体を再生させ
る方法で、具体的にはクラスタ−カルスから多くのシュ
−トを発生させ、発生した各々のシュ−トから発根させ
幼植物体を再生させる方法や細胞に直接不定胚（体細胞
胚）を形成させ幼植物体にまで再生させる方法がある。
不定胚を経由して植物体を再生させる場合においては、
不定胚の生長は、その段階によって球状胚、心臓型胚、
魚雷型胚、成熟胚の順に生長していくことが知られてい
る。一方、分化系では成長点を含む茎頂、休眠芽、側
芽、胚、種子などが出発材料になり、さらに成長点を含
まない胚軸、子葉、茎なども用いられる。この系では上
述した植物組織にマルチプルシュ−トを形成させ、つい
でこれらを切除した単一シュ−トから連続的にマルチプ
ルシュ−トを発生させる連続シュ−ト生産システムを確
立し、最終的に切除したシュ−トから発根させ幼植物を
再生させる方法がある。 【０００４】脱分化系からの植物体再生においては、培
養細胞を長期間継代培養していると、一般に分化能が低
下することが多く、培養細胞からの不定胚の形成率やカ
ルスからのシュ−ト、根の形成率は低くなる。また、人
為的に不定胚を誘導する場合、培地の無機塩類組成もさ
ることながら、植物ホルモンであるオ−キシンやサイト
カイニンの種類、濃度、組合せについて検討することが
一般的な手順になっている。しかし、オ−キシンやサイ
トカイニンの処理だけでは不定胚形成やカルスからのシ
ュ−トや根の形成を誘導できない植物種も多い。特に不
定胚は、魚雷型胚まで生長すると理由は定かではない
が、生長を停止して植物体にまで再分化する率が極めて
低下するという現象が起こる。一方、分化系での植物体
再生では、種々の植物や種々の組織を用いて脱分化系と
同様にオ−キシンやサイトカイニンなどの植物ホルモン
の種類、濃度、組合せや、培地の無機塩類、微量有機成
分組成などについて検討されているが、未だに植物や組
織によってはシュ−ト・根の形成をしないものもある。
また、脱分化系、分化系のいずれにおいても、植物ホル
モンを用いて植物組織培養する場合には、植物ホルモン
の種類やその添加量によっては、増殖や分化を阻害する
等の問題があった。従って、各種の植物組織や器官ある
いは培養細胞からの不定胚形成率を高め、さらには不定
胚の生長や植物体への再生を効果的に促進させる方法が
望まれるところである。 【０００５】さらにまた、植物組織培養を利用したクロ
−ン植物大量培養法の一つとして、人工種子の開発が着
目され、野菜やイネなど多くの植物種で実用化に向けて
試みがなされている。人工種子は、不定芽や不定胚など
の植物体再生組織を、人工的な胚乳と人工膜によって包
埋したものである。人工的な胚乳は、植物体再生組織の
栄養を与えたり発芽を制御する物質を含む部分である。
人工膜としてはアルギン酸カルシウムが最適とされてい
るが、その他の高分子ゲル化剤についても種々検討がさ
れている。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】かような人工種子の発
芽率を高めるために、人工的な胚乳に植物ホルモンの一
種であるアブシジン酸を添加するという報告もある。し
かしながら人工種子を播種したのち、アブシジン酸が水
に溶解拡散するまでに時間を要するため、必ずしも発芽
率が高まるとは限らない。また、高濃度の糖などを人工
的胚乳部分に添加する方法も提案されているが、雑菌の
繁殖を促し、生育に支障をきたす場合がある。従って、
人工種子中に不定胚などの植物体再生組織の生長を促進
し、その発芽率を高めることができれば人工種子の実用
化が一層進展することになろう。そこで本発明は、高い
発芽率を有する改良された人工種子を提供することを課
題とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
には、人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾液及び／
又は抽出物を含ませた人工種子とする。即ち、本発明
は、植物体組織を人工胚乳及び人工膜によって包埋して
なる人工種子において、前記人工胚乳に真核細胞の微細
藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませてなることを
特徴とする人工種子を要旨とする。 【０００８】本発明で利用できる真核細胞の微細藻類と
しては、紅藻類、緑藻類、黄緑藻類、珪藻類、黄色鞭毛
藻類、渦鞭毛藻類などがある。 【０００９】緑藻類としては、ブラキオモナス（Brachi
omonas）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、ク
ロレラ（Chlorella)属、ロボモナス(Lobomonas)属、ネ
フェロクラミス(Nephrochlamys)属、ネフェロデエラ(Ne
phrodiella)属、プロトシフォン(Protosiphon)属、プロ
トテカ(Prototheca)属、セネデスムス(Scenedesmus)
属、セレナストゥルム(Selenastrum)属などがあり、具
体例としては、ブラキオモナス・スブマリナ（Brachiom
onas submarina)ＡＴＣＣ ３０５９７、クラミドモナス
・ドルソベントラリス（Chlamydomonas dorsoventrali
s)ＡＴＣＣ ３０５９４、クラミドモナス・オゥガメト
ス(Chlamydomonas eugametos)ＡＴＣＣ ３０４０１、ク
ラミドモナス・モノイカ（Chlamydomonas monoica)ＡＴ
ＣＣ３０６２９、クラミドモナス・プソウダグロエ(Chl
amydomonas pseudagloe)ＡＴＣＣ １２２３５、クロレ
ラ・エリップソイデア（Chlorella ellipsoidea)ＡＴＣ
Ｃ １１４６６、クロレラ・ルテオヴィリディス（Chlor
ella luteoviridis)ＡＴＣＣ ３０４０６、クロレラ・
ミニアタ（Chlorella miniata)ＡＴＣＣ ３０５４６、
クロレラ・サッカロフィラ（Chlorella saccharophila
var.saccharophila)ＡＴＣＣ ３０４０８、クロレラ属
(Chlorella sp.)ＡＴＣＣ １１４６９、クロレラ・バリ
エガタ（Chlorella variegata)ＡＴＣＣ ３０４０９、
クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris)ＡＴＣＣ
１１４６８、クロレラ・キサンセラ（Chlorella xanthe
lla)ＡＴＣＣ ３０４１１、ロボモナス・ピリフォ−ミ
ス(Lobomonaspiriformis)ＡＴＣＣ ３０４０３、ネフェ
ロクラミス・スブソリタリア（Nephrochlamys subsolit
aria)ＡＴＣＣ ３０４３３、ネフェロデエラ・ブレビス
（Nephrodiella brevis)ＡＴＣＣ ３０４４０、プロト
シフォン・ボテリオイデス(Protosiphonbotryoides)Ａ
ＴＣＣ ３０４３６、プロトテカ・スタッグノラ(Protot
heca stagnora)ＡＴＣＣ １６５２８、セネデスムス・
ビジュガトゥス(Scenedesmus bijugatus)ＡＴＣＣ １１
４６２、セネデスムス・クゥアドリカウド(Scenedesmus
quadricauda)ＡＴＣＣ ３０４２８などが挙げられる。 【００１０】黄緑藻類としては、ボティリデウム（Botr
ydium)属、ミショコッカス(Mischococcus)属、モノダス
(Monodus)属、オフィオシティウム(Ophiocytium)属など
があり、具体例としては、ボティリデウム・ベケリアニ
ウム(Botrydium becherianum)ＡＴＣＣ ３０６０２、ボ
ティリデウム・シストスム(Botrydium cystosum)ＡＴＣ
Ｃ ３０５８９、ミショコッカス・スファエロセファラ
ス(Mischococcus sphaerocephalus)ＡＴＣＣ ３０５９
２、モノダス・セブテラネウス(Monodus subterraneus)
ＡＴＣＣ ３０５９３、オフィオシティウム・マジュス
(Ophiocytium majus)ＡＴＣＣ ３０６０１などが挙げら
れる。 【００１１】黄色鞭毛藻類としては、オクロモナス(Och
romonas）属などがあり、具体例としては、オクロモナ
ス・ダニカ(Ochromonas danica)ＡＴＣＣ ３０００４、
オクロモナス・マルハメンシス(Ochromonas malhamensi
s)ＡＴＣＣ１１５３２などが挙げられる。 【００１２】上記した微細藻類あるいはその変種や変異
株に限ることなく、天然から分離した海洋性、淡水性の
微細藻類も本発明において利用できる。更に、これらの
菌体は１種または２種以上併用してもかまわない。 【００１３】微細藻類の培養は、通常、無機塩類等を含
む培地を用い、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋
外開放培養で行い得るが、本発明においては、目的とす
る微細藻類が天然にある程度豊富に存在するならば、そ
の菌体の生育存在する海水あるいは淡水を培養液とする
ことができる。 【００１４】微細藻類培養濾液は上述した培養法で得ら
れる培養液を遠心分離あるいは濾過などを行って取得さ
れるが、目的とする培養濾液の生物活性が弱い場合は、
前記培養濾液を減圧濃縮などにより濃縮して用いてもか
まわない。この際、濃縮倍率が大きくなり塩濃度が高く
なると植物組織に悪影響を与えることがあるので、電気
透析などで植物組織に悪影響がなくなるまで脱塩して使
用するのが望ましい。 【００１５】また、微細藻類抽出物は、前記のようにし
て得られた菌体または適度に破砕した菌体を常温または
加熱した適当な溶媒と接触させて行い得たものであり、
溶媒としては、菌体によって種々の溶媒を単独または複
数併用してもかまわないが、一般的には水性溶媒が好ま
しい。水性溶媒としては、水単独あるいは酸、塩基、塩
類、または有機溶媒を溶解した水溶液などが使用でき
る。また、メタノ−ル、エタノ−ル、酢酸エチルエステ
ル、エ−テル等の有機溶媒で抽出後、有機溶媒を除去し
水に溶解させてもよい。 【００１６】上述した微細藻類の培養濾液あるいは抽出
物からの高分子画分は、培養濾液あるいは抽出液から一
般的な分子量に基づく分画法、例えば透析、ゲル濾過、
限外濾過等で得ることができる。高分子画分は、分子量
的にはおよそ８，０００以上の画分である。このように
して得られた高分子画分は適宜濃縮あるいは希釈して使
用できる。更に、これらの分画液を減圧乾燥、凍結乾
燥、噴霧乾燥等により乾燥し粉末としたものも使用でき
る。 【００１７】また、上述した方法により得られた微細藻
類の培養濾液あるいは抽出物からの塩基性画分は、有機
溶媒抽出による塩基性物質を得る方法として「物質の単
離と精製」（１９７６年発行、大竹、鈴木、高橋、室
伏、米原、東京大学出版会）ｐ２５〜ｐ３１に記載があ
るような一般的理論と分画方法に基づいて得ることがで
きる。一般的な分画操作では、試料水溶液に塩酸などの
酸を加えてｐＨ３に調整後、適当な有機溶媒を加え酸性
物質を抽出する。次に、水層のｐＨを水酸化ナトリウム
などのアルカリを加えてｐＨ１２に調整し適当な有機溶
媒を加えて塩基性物質を抽出する。しかしながら目的に
応じて適宜ｐＨなどの諸条件を変えて抽出を行っても差
し支えない。分画に用いる有機溶媒としては、エチルエ
−テル、クロロホルム、酢酸エチル、ブタノ−ルなどを
用いることが多いが、適当な溶媒を適宜選択して用いる
ことができる。また、上述した方法で得られた塩基性画
分から有機溶媒を除去後、水に溶解させて用いてもよ
い。 【００１８】微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物から
の高分子画分や塩基性画分の基本培地への添加量は、用
いる菌、培養条件、抽出液量等の条件で変動し、更に各
種分画操作後の有効成分の回収率、液量の増減等不確実
な要因が多く、一概に規定することは困難であるが、有
効な添加量は実験により容易に決めることができる。例
えば、クロレラ・ブルガリス ＡＴＣＣ １１４６８、セ
ネデスムス・ビジュガトゥス ＡＴＣＣ １１４６２を用
いる場合には、培養濾液については１００倍に濃縮した
もの、抽出液については３ｇ乾燥菌体を１００ml抽出用
液で抽出したものから上記記載の方法で高分子画分ある
いは塩基性画分の凍結乾燥物を調製し、それぞれ植物組
織培養用の基本培地に対して１〜１０００ppmの濃度範
囲で添加するなどできるが、添加濃度が高すぎると効果
が低下することがある。 【００１９】植物組織培養に使用する基本培地や培養方
法などは通常の植物組織培養におけるものと同様であ
る。即ち基本培地としては、ムラシゲ＆スク−グ（Mura
shige＆ Skoog）培地（１９６２）（以下「ＭＳ培地」
と略記する）を代表的なものとして挙げられるが、その
他の植物組織培養に適した種々の培地、あるいはそれら
の改変培地を適宜選択して使用することもできる。更
に、微細藻類の培養濾液あるいは抽出液の高分子画分や
塩基性画分の他に、通常の培養に使用される植物ホルモ
ン、ココナッツミルク、カゼイン分解物や酵母抽出物等
を目的に応じて併せて添加してもよい。 【００２０】本発明において、人工胚乳にこのような微
細藻類の培養濾液及び／又は抽出物、望ましくはその高
分子画分や塩基性画分を含ませておくことにより、高い
発芽率の人工種子となる。 【００２１】 【実施例】以下実施例によって本発明をさらに詳しく説
明する。尚、以下の実施例において使用するニンジンの
培養細胞と不定胚の培養、及び微細藻類の培養濾液と抽
出物からの高分子画分、塩基性画分の調製は下記のよう
に行った。 【００２２】(Ｉ)ニンジン培養細胞の作製及び不定胚の
培養 ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が10cm位に生
長したものを約１cm位に切断し、下記培地中で２５℃、
暗条件下で培養した。培地は基本培地としてＭＳ培地を
使用し、これにショ糖３％、オ−キシン類の植物ホルモ
ンである２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸）１mg／ｌを添加しｐＨ５．５〜ｐＨ５．７に調整し
た。約１ヶ月の培養後、培地中の２，４−Ｄ濃度を０．
１１mg／ｌに減少させた培地に移植し、振盪速度９０回
／分のレシプロ式シェ−カ−を用いて振盪培養した。そ
の後、１週間に１回の割合で、２，４−Ｄを０．１１mg
／ｌ含む培地に植え継いでニンジン培養細胞を得た。ま
た、ニンジン培養細胞は、形態的分化を行って不定胚を
形成することが知られている。そこで、液体培養にて継
代培養した上記培養細胞を２，４−Ｄを含まない基本培
地に移植して培養することにより、不定胚を形成させ
た。 【００２３】(ＩＩ)微細藻類培養濾液と抽出物からの高
分子画分と塩基性画分の調製 微細藻類として、オクロモナス・ダニカ(Ochromonas da
nica)ＡＴＣＣ ３０００４、クラミドモナス・ドルソベ
ントラリス（Chlamydomonas dorsoventralis)ＡＴＣＣ
３０５９４、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgari
s)ＡＴＣＣ １１４６８、セネデスムス・ビジュガトゥ
ス（Scenedesmus bijugatus)ＡＴＣＣ１１４６２、ボテ
ィリデウム・ベケリアニウム(Botrydium becherianum)
ＡＴＣＣ ３０６０２を用いて調製した。 【００２４】前記微細藻類を各々ＡＴＣＣ指定の培養条
件にて培養後、培養液を遠心濾過し濾液を得、エバポレ
イターで１００倍に濃縮した。この濃縮液をモザイク荷
電膜脱塩器（デザルトンＤＳ−１０３：東ソー株式会
社）で脱塩し、０．４５μｍのメンブランフィルターを
用いて濾過し、得られた濾液を微細藻類培養濾液とし
た。各々の微細藻類抽出物は菌体を集菌後凍結乾燥し、
水に対して３％になるように菌体を懸濁させ、１００℃
で６０分間熱水抽出し、遠心分離して上澄液を０．４５
μｍメンブランフィルターを用いて濾過して得た。 【００２５】上述のようにして得られた微細藻類培養濾
液及び抽出物５０mlをビスカゼ（VISKASE)社の透析用セ
ルロースチューブ（商品名：セルロースチューブ30／3
2）を用いて蒸留水１ｌに対して透析した。得られた透
析内液を凍結乾燥を行い、高分子画分としてそれぞれ以
下の実験に供した。 【００２６】また、微細藻類培養濾液あるいは微細藻類
抽出物からの塩基性画分は以下のように調整した。上述
した微細藻類培養濾液及び微細藻類抽出物それぞれに１
Ｎの塩酸を加えてｐＨ３に調整後、クロロホルムを加え
酸性物質を抽出した。次に、それぞれの水層のｐＨを１
Ｎの水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１２に調整し、クロ
ロホルムを加えて塩基性物質を抽出した。得られた塩基
性物質は、クロロホルムを減圧蒸留して除去しｐＨ４の
蒸留水に溶解し、その後、凍結乾燥を行い、供試物質と
した。 【００２７】実施例１ ニンジン不定胚を用いた人工種子の発芽促進 ニンジン不定胚は(Ｉ)で得た不定胚から２００μｍ及び
４２５μｍのナイロンメッシュを用いて２００〜４２５
μｍの大きさに生長した不定胚のみを選別使用した。選
別された不定胚のほとんどは、球状から初期の心臓型不
定胚であった。このようにして得られた不定胚をＭＳ培
地２５ｍｌ中に懸濁し、包埋剤として３％(W/V)アルギ
ン酸ナトリウムを含む７５ｍｌのＭＳ培地と上記の懸濁
液とを混ぜ合わせ、混液１００ｍｌを得た。このとき、
上記混液１００ｍｌに対して微細藻類培養液及び抽出物
を１％濃度で、更に高分子画分と塩基性画分をそれぞれ
１５０ｐｐｍの濃度で添加した。得られた最終混液を、
５０ｍＭの塩化カルシウム溶液中に滴下することによっ
て、アルギン酸カルシウムからなる人工膜を有する球状
の人工種子を得た。 【００２８】ついで、この人工種子を、無菌的に２５
℃、明条件（２０００ルックス、１６時間照明）で２５
日間培養し、発根、発芽状態を調べた。結果を表１に示
す。 【００２９】 【表１】 【００３０】 【発明の効果】人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾
液及び／又は抽出物を含ませてなる発明の人工種子は発
芽率の高いものたり得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅津 博紀 埼玉県草加市吉町４−１−８ ぺんてる株 式会社草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都小金井市本町４−20−15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 植物体組織を人工胚乳及び人工膜によっ
   て包埋してなる人工種子において、前記人工胚乳に真核
   細胞の微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませて
   なることを特徴とする人工種子。