JPH03168080A - 植物組織培養法及び人工種子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は植物組織培養法に関し、更に詳しくは、植物の
組織とか器官もしくはこれらの一部あるいは培養細胞を
培養することによって、増殖や植物体を再生させたりす
る植物組織培養法に関する。

（従来の技術とその課題） 一般に、植物組織培養においては、植物の組織や器官あ
るいは培養細胞を、生長に必要な無機塩類，ビタミン、
糖などのほかに植物ホルモン（オーキシン類、サイトカ
イニン類、ジベレリン類、エチレン等）を加えた培地を
用いて培養し、カルスをつくらせたり、そのカルスを植
え継いで培養を続け有用物質を得たり、またはそのカル
スから植物体を再生（復元）させたりしている。

植物組織培養技術を用いて植物体を再生させる方法とし
ては、出発材料により脱分化系と分化系の２種に大きく
分けられる。脱分化系はカルスや液体培養細胞などの脱
分化した状態を経由して植物体を再生させる方法で、具
体的にはクラスターカルスから多くのシュートを発生さ
せ、発生した各々のシュートから発根させ幼植物体を再
生させる方法や細胞に直接不定胚（体細胞胚）を形戊さ
せ幼植物体にまで再生させる方法がある。不定胚を経由
して植物体を再生させる場合においては、不定胚の生長
は、その段階によって球状胚、心臓型胚、魚雷型胚、或
熟胚の順に生長していくことが知られている。

方、分化系では成長点を含む茎頂、休眠訃、側芽、胚、
種子などが出発材料になり、さらに戊長点を含まない胚
軸、子葉、茎なども用いられる。この系では上述した植
物組織にマルチプルシュートを形成させ、ついでこれら
を切除した単一シュートから連続的にマルチプルシュー
トを発生させる連続シュート生産システムを確立し、最
終的に切除したシュー！・から発根させ幼植物を再生さ
せる方法がある。

脱分化系からの植物体再生においては、培養細胞を長期
間継代培養していると、一般に分化能が低下することが
多く、培養細胞からの不定胚の形戊率やカルスからのシ
ュート、根の形成率は低くなる。また、人為的に不定胚
を誘導する場合、培地の無機塩類組或もさることながら
、植物ホルモンであるオーキシンやサイトカイニンの種
類、濃度、組合せについて検討すること−３ が一般的な手順になっている。しかし、オーキシンやサ
イトカイニンの処理だけでは不定胚形成やカルスからの
シュートや根の形或を誘導できない植物種も多い。特に
不定胚は、魚雷型胚まで生長すると理由は定かではない
が，生長を停止して植物体にまで再分化する率が極めて
低下するという現象が起こる。一方、分化系での植物体
再生では、種々の植物や種々の組織を用いて脱分化系と
同様にオーキシンやサイトカイニンなどの植物ホルモン
の種類、濃度、組合せや、培地の無機塩類、微量有機或
分組或などについて検討されているが、未だに植物や組
織によってはシュー１−・根の形成をしないものもある
。また、脱分化系、分化系のいずれにおいても、植物ホ
ルモンを用いて植物組織培養する場合には、植物ホルモ
ンの種類やその添加量によっては、増殖や分化を阻害す
る等の問題があった。従って、各種の植物組織や器官あ
るいは培養細胞からの不定胚形或率を高め、さらには不
定胚の生長や植物体への再生を効果的に促進さ４ せる方法が望まれるところである。

さらにまた、植物組織培養を利用したクロン植物大量培
養法の一つとして、人工種子の開発が着目され、野菜や
イネなど多くの植物種で実用化に向けて試みがなされて
いる。人工種子は、不定芽や不定胚などの植物体再生組
織を、人工的な胚乳と人工膜によって包埋したものであ
る。人工的な胚乳は、植物体再生組織の栄養を与えたり
発芽を制御する物質を含む部分である。人工膜としては
アルギン酸カルシウムが最適とされているが、その他の
高分子ゲル化剤についても種々検討がされている。かよ
うな人工種子の発芽率を高めるために、人工的な胚乳に
植物ホルモンの一種であるアブシジン酸を添加するとい
う報告もある。しかしながら人工種子を播種したのち、
アブシジン酸が水に溶解拡散するまでに時間を要するた
め、必ずしも発芽率が高まるとは限らない。また、高濃
度の糖などを人工的胚乳部分に添加する方法も提案され
ているが、雑菌の繁殖を促し、生育に支障をきたす場合
がある。従って、人工種子中に不定胚などの植物体再生
組織の生長を促進し、その発芽率を高めることができれ
ば人工種子の実用化が一層進展することになろう。

そこで本発明は、植物組織や培養細胞などを効果的に増
殖あるいは分化させたり、植物組織や培養細胞などから
の植物体再生を効率よく促進させたりする改良された植
物組織培養法、並びに、高い発芽率を有する改良された
人工種子を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 上記課題を解決するためには、真核細胞の微細藻類の培
養濾波及び／又は抽出物中の高分子画分及び／又は塩基
性画分を含む培地で、植物の組織とか器官もしくはこれ
らの一部あるいは培養細胞を培養する。また、人工胚乳
に真核細胞の微細藻類の培養濾波及び／又は抽出物を含
ませた人工種子とする。即ち、本発明は、真核細胞の微
細藻類の培養濾波及び／又は抽出物中の高分子画分及び
／又は塩基性画分を含む培地で、植物の組織とか器官も
しくはこれらの一部あるいは培養細胞を培養することを
特徴とする植物組織培養法、並びに、植物体組織を人工
胚乳及び人工膜によって包埋してなる人工種子において
、前記人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培ｒ＆濾液及び
／又は抽出物を含ませてなることを特徴とする人工種子
を要旨とする。

本発明で利用できる真核細胞の微細藻類としては、紅藻
類、緑藻類、黄緑藻類、珪藻類、黄色鞭毛藻類、渦鞭毛
藻類などがある。緑藻類としては、ブラキオモナス（　
Ｂｒａｃｈｉｏｍｏｎａｓ　）属、クラミドモナス（Ｃ
ｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒ
ｅｌｌａ）属、ロボモナス（Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ）属、
ネフェロクラミス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌａｍｙｓ）属、
ネフェロデエラ（Ｎｅｐｈｒｏｄｉｅｌｌａ）属、プロ
トシフォン（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ）属、プロトテカ
（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎ
ｅｄｅｓｍｕｓ）属、セレナストウルム（Ｓｅｌｅｎａ
ｓｔｒｕｉ）属などがあり、具体例としては、ブラキオ
モナス・スブマリナ（Ｂｒａｃｈｉｏｍｏｎａｓ　ｓｕ
ｂｍａｒｉｎａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０　５　９
　７、クラミ７ ドモナス・ドルソベントラリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｄｏｒｓｏｖｅｎｔｒａｌｉｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ
　Ｃ　３　０　５　９　４、クラミドモナス●オウガメ
トス（Ｃｈｌａ＋ｎｙｄｏ＋ｎｏｎａｓ　ｅｕｇａｍａ
ｔｏｓ）ＡＴＣＣ　３　０　４　０　１、クラミドモナ
ス・モノイカ（ＣＭａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｍｏｎｏｉ
ｃａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ３０６２９、クラミドモナス・
プソウダグロエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅ
ｕｄａｇｌｏｅ）Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　１　２　２３５、
クロレラ・エリップソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｅ
ｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　１　１　４
　６　６、クロレラ・ルテオヴイリデイス（Ｃｈｌｏｒ
ｅｌｌａ　ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｊｓ）ＡＴＣＣ　　３
０４０６、クロレラ・ミニアタ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　
ｍｉｎｉａｔａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　３　０　５　４　
６、クロレラ・サツ力ロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　
ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ　ｖａｒ．ｓａｃｃｈａｒ
ｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ　　３０４０８、クロレラ属（
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｐ．）ＡＴ　ＣＣ　１１４６９
．クロレラ・バリエガタ（Ｃｈｌ．ｏｒｅｌｌａｖａｒ
ｉｅｇａｔａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０　４　０　
９、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ　　１１４６８、クロレラ・キ
サンセラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｘａｎｔｈｅｌ．ｌａ）
　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　３　０　４　１１、ロボモナス−８ ６ピリフオーミス（Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ　ｐｊｒｉｆｏ
ｒｍｉｓ）　Ａ　ＴＣＣ　　３０４０３、ネフェロクラ
ミス・スブソリタリア（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌａ＋ｎｙｓ
　ｓｕｂｓｏｌｉｔａｒｉａ）　Ａ　ＴＣＣ　　３０４
３３、ネフェロデエラ・ブレビス（Ｎｅｐｈｒｏｄｉｅ
ｌｌａ　ｂｒｅｖｉｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０　
４　４　０、プロトシフォン・ボテリオイデス（Ｐｒｏ
ｔｏｓｉｐｈｏｎｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ
　Ｃ　　３　０　４　３　６　，プロトテカ５スタッグ
ノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ　ｓｔａｇｎｏｒａ）　Ａ
　Ｔ　ＣＣ　　１６５２８、セネデスムス・ビジュガト
ウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｂｉｊｕｇａｔｕｓ）
　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　１　１　４　６２、セネデスムス
・クウアドリ力ウド（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｑｕａ
ｄｒｉｃａｕｄａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　３　０　４　２
　８などが挙げられる。黄緑藻類としては，ボティリデ
ウム（　Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ミショコッカス（Ｍ
ｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕ
ｓ）属、オフィオシティウム（Ｏρｈｉｏｃｙｔｉｕｍ
）属などがあり、具体例としては、ボティリデウム・ペ
ケリアニウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ　ｂｅｃｈｅｒｊ．
ａｎｕｍ）Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　３　０　６　０　２、ボテ
ィリデウム・シストスム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ　ｃｙｓ
ｔｏｓｕｍ）ＡＴＣＣ　３０５８９、ミショコッカス・
スフ７　工（Ｉセファラス（Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
　ｓｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）ＡＴＣＣ　３　０
　５　９　２、モノダス・セブテラネウス（阿ｏｎｏｄ
ｕｓ　ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ３
０５９３、オフィオシティウム・マジュス（Ｏｐｈｉｏ
ｃｙｔｉｕｍ　ｍａｊｕｓ）Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０
　６　０　１などが挙げられる。黄色鞭毛藻類としては
、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）　ｍなどがあ
り、具体例としては、オクロモナス・ダニ力（Ｏｃｈｒ
ｏｍｏｎａｓ　ｄａｎｉｃａ）ＡＴＣＣ　　３０００４
、オクロモナス・マルハメンシス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａ
ｓ　ｍａｌｈａｎ＋ｅｎｓｉｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ１１
５３２などが挙げられる。

上記した微細藻類あるいはその変種や変異株に限ること
なく、天然から分離した海洋性、淡水性の微細藻類も本
発明において利用できる。

更に、これらの菌体は１種または２種以上併用してもか
まわない。

微細藻類の培養は、通常、無機塩類等を含む培地を用い
、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外開放培養で
行い得るが、本発明においては、召的とする微ｍＮ類が
天然にある程度豊富に存在するならば、その菌体の生育
存在する海水あるいは淡水を培養液とすることができる
。

微細藻類培養濾液は上述した培養法で得られる培養液を
遠心分離あるいは濾過などを行って取得されるが、目的
とする培養濾液の生物活性が弱い場合は、前記培養濾液
を減圧濃縮などにより濃縮して用いてもかまわない。こ
の際、濃縮倍率が大きくなり塩濃度が高くなると植物組
織に悪影響を与えることがあるので、電気透析などで植
物組織に悪影響がなくなるまで脱塩して使用するのが望
ましい。

また、微細藻類抽出物は、前記のようにして得られた菌
体または適度に破砕した菌体を常温または加熱した適当
な溶媒と接触させて行い得たものであり、溶媒としては
、菌体によって種々の溶媒を単独または複数併用しても
かまわないが、一般的には水性溶媒が好ましい。水性溶
媒としては、水単独あるいは酸、塩基、塩類、または有
機溶媒を溶解した水溶液などが使用できる。また、メタ
ノール、エタノール、酢酸工１１ チルエステル、エーテル等の有機溶媒で抽出後、有機溶
媒を除去し水に溶解させてもよい。

上述した微細藻類の培養濾液あるいは抽出物からの高分
子画分は、培養濾液あるいは抽出液から一般的な分子量
に基づく分画法、例えば透析、ゲル濾過、限外濾過等で
得ることができる。

高分子画分は、分子量的にはおよそｓ，ｏｏｏ以上の両
分である。このようにして得られた高分子画分は適宜濃
縮あるいは希釈して使用できる。更に、これらの分画液
を減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥し粉末と
したものも使用できる。

また、上述した方法により得られた微細藻類の培養濾液
あるいは抽出物からの塩基性画分は、有機溶媒抽出によ
る塩基性物質を得る方法として「物質の単離と精製Ｊ　
　（１９７６年発行、大竹、鈴木、高橋、室伏、米原、
東京大学出版会）ｐ２５〜ｐ３１に記載があるような一
般的理論と分両方法に基づいて得ることができる。一般
的な分画操作では、試料水溶液に塩酸などの酸１２ を加えてｐＨ３に調整後、適当な有機溶媒を加え酸性物
質を抽出する。次に、水層のｐＨを水酸化ナトリウムな
どのアルカリを加えてｐＨ工２に調整し適当な有機溶媒
を加えて塩基性物質を抽出する。しかしながら目的に応
じて適宜ｐｎなどの諸条件を変えて抽出を行っても差し
支えない。分画に用いる有機溶媒としては、エチルエー
テル、クロロホルム、酢酸エチル、ブタノールなどを用
いることが多いが、適当な溶媒を適宜選択して用いるこ
とができる。また、上述した方法で得られた塩基性画分
から有機溶媒を除去後、水に溶解させて用いてもよい。

微細藻類の培養濾波及び／又は抽出物からの高分子画分
や塩基性画分の基本培地への添加量は、用いる菌、培養
条件，抽出液量等の条件で変動し、更に各種分画操作後
の有効成分の回収率、液量の増減等不確実な要因が多く
、−概に規定することは困難であるが、有効な添加量は
実験により容易に決めることができる。例えば、クロレ
ラ・ブルガリスＡＴＣＣ１１４−６８、セネデスムス・
ビジュガトウスＡＴＣＣ　　１１４６２を用いる場合に
は、培養濾液については１００倍に濃縮したもの、抽出
液については３ｇ乾燥菌体を１００ｍｌ抽出用液で抽出
したものから上記記載の方法で高分子画分あるいは塩基
性画分の凍結乾燥物を調製し、それぞれ植物組織培養用
の基本培地に対して１〜１０００ｐｐｍの濃度範囲で添
加するなどできるが、添加濃度が高すぎると効果が低下
することがある。

植物組織培養に使用する基本培地や培養方法などは通常
の植物組織培養におけるものと同様である。即ち基本培
地としては、ムラシゲ＆スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
　＆　Ｓｋｏｏｇ）培地（１　９　６　２）（以下ｒＭ
Ｓ培地」と酩記する）を代表的なものとして挙げられる
が、その他の植物組織培養に適した種々の培地、あるい
はそれらの改変培地を適宜選択して使用することもでき
る。更に、微細藻類の培養濾液あるいは抽出液の高分子
画分や塩基性画分の他に、通常の培養に使用される植物
ホルモン、ココナッツミルク、カゼイン分解物や酵母抽
出物等を目的に応じて併せて添加してもよい。

本発明において培養の対象となる植物の種類は、分化全
能性を有し組織培養が可能であれば特に制限はなくどん
な植物でも適用可能である。

これらは植物の組織、器官、あるいはそれらの一部、あ
るいは培養細胞を培養に供することができるが、これら
を初代培養あるいは継代培養したものも培養可能である
。従って、不定胚を形戒させたり、植物体を再生させた
り、また、植物体を再生させるにあたって、カルスを培
養したり、不定胚を培養したり，プロトコーム状球体を
培養したりすることができる。また、人工胚乳にこのよ
うな微細藻類の培養濾波及び／又は抽出物、望ましくは
その高分子画分や塩基性画分を含ませておくことにより
、高い発芽率の人工種子となる。

（実施例） 以下実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。尚
、以下の実施例において使用する二１５ ンジンの培養細胞と不定胚の培養、及び微細藻類の培養
濾液と抽出物からの高分子画分、塩基性画分の調製は下
記のように行った。

（Ｉ）ニンジン培養細胞の作製及び不定胚の培養ニンジ
ンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が１０ａｎ位に生長
したものを約１ｃＩＩ１位に切断し、下記培地中で２５
℃、暗条件下で培養した。培地は基本培地としてＭＳ培
地を使用し、これにシヨ糖３％、オーキシン類の植物ホ
ルモンである２．４−Ｄ　（２．４−ジクロロフェノキ
シ酢酸）ｉｍｇ／Ｑを添加しｐＨ５．５−ｐＨ５．７に
調整した。約１ケ月の培養後、培地中の２，４−Ｄ濃度
を０．１１■／此に減少させた培地に移植し、振盪速度
９０回／分のレシプロ式シェーカーを用いて振盪培養し
た。その後、↓週間に工回の割合で、２．４−Ｄを０．
１１■／Ｑ含む培地に植え継いでニンジン培養細胞を得
た。

また、ニンジン培養細胞は、形態的分化を行って不定胚
を形成することが知られている。そこで、液体培養にて
継代培養した上記培養細胞１６ を２．４−Ｄを含まない基本培地に移植して培養するこ
とにより、不定胚を形成させた。

（ＩＩ）微細藻類培養濾液と抽出物からの高分子画分と
塩基性画分の調製 微細藻類として、オクロモナス・ダニ力（Ｏｃｈｒｏｍ
ｏｎａｓ　ｄａｎｉｃａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０
　０　０　４、クラミドモナス・ドルソベン１ヘラリス
（Ｃｈｌ．ａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｄｏｒｓｏｖｅｎｔ
ｒａｌｉｓ）Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０　５　９　４、
クロレラ・サツ力ロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓａ
ｃｃｈａｒｏｐｈｉ１ａ　ｖａｒ．ｓａｃｃｈａｒｏｐ
ｈｉｌａ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　　３　０　４　０　８、
クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌ（
Ｈａｒ．ｉ．ｓ）　ＡＴＣＣ　　１１４６８、セネデス
ムス・ビジュガトウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｂｉ
ｊｕｇａｔｕｓ）ＡＴＣＣ　　１１４６２、ボティリデ
ウム・ペケリアニウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ　ｂｅｃｈ
ｅｒｉａｎｕｍ）Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　３　０　６　０　２
を用いて調製した。前記微細藻類を各々ＡＴＣＣ指定の
培養条件にて培養後、培養液を遠心濾過し濾液を得、エ
バボレイターで１００倍に濃縮した。この濃縮液をモザ
イク荷電膜脱塩器（デザルトンＤＳ−１０３＝東ソー株
式会社）で脱塩し、０．４５μｍのメンプランフィルタ
ーを用いて濾過し、得られた濾液を微細藻類培養濾液と
した。各々の微細藻類抽出物は菌体を集菌後凍結乾燥し
、水に対して３％になるように菌体を懸濁させ、王００
℃で６０分間熱水抽出し、遠心分離して上澄液を０．４
５μｍメンプランフィルターを用いて濾過して得た。

上述のようにして得られた微細藻類培養濾波及び抽出物
５０ｍｌをビスカゼ（ＶＩＳＫＡＳＥ）社の透析用セル
ロースチューブ（商品名：セルロースチューブ３０／３
２）を用いて蒸留水ＩＬに対して透析した。得られた透
析内液を凍結乾燥を行い、高分子画分としてそれぞれ以
下の実験に供した。

また、微細藻類培養濾液あるいは微細藻類抽出物からの
塩基性画分は以下のように調整した。

上述した微細藻類培養濾波及び微細藻類抽出物それぞれ
にＩＮの塩酸を加えてｐ　Ｈ　３に調整後、クロロホル
ムを加え酸性物質を抽出した。

次に、それぞれの水層のｐ　Ｈを１Ｎの水酸化ナ１−リ
ウムを加えてｐＨ１２に調整し、クロロホルムを加えて
塩基性物質を抽出した。得られた塩基性物質は、クロロ
ホルムを減圧蒸留して除去しｐＨ４の蒸留水に溶解し、
その後、凍結乾燥を行い、供試物質とした。

１　ニンジン　養　胞の培養 シヨ糖３％と２．４−Ｄｔ＆０．１１ｍｇ／ｆｆを含む
ＭＳ培地に（ＩＩ）で調製したクロレラ・ブルガリス、
セネデスムス・ビジュガ１・ウス及びボディリウム・ペ
ケリアニウムの培養濾波及び菌体抽出液を１％添加した
培地、さらにそれらの塩基性画分１００ｐｐｍと高分子
画分１００ｐｐｍを添加した培地及び無添加の培地を用
い、（１）で作製したニンジン培養細胞を２５℃、暗条
件下で１２日間液体振盪培養し、細胞数を調べた。

結果を表−１に示す。

（以下、余白） １０ 表 １ （注１）細胞数は、「植物組織培養の技術」　（↓９８
３年発行、竹内、中島、古谷、朝倉書店）ｐ３８に準じ
て下記のように測定した。また、表の値は、１００万が
嘔位である。セルラーゼ・オノズカＲ−１０を２％、マ
ルセロチー２０ ムＲ−１０をｌ％ドリセラーゼを２％，塩化カルシウム
（ＣａＣ工２・２Ｈ，○）を０．５％、マンニトールを
０．７Ｍそれぞれ用いて、３０℃，６０分間、振幅７、
振盪回数９０回／分で振盪し、次に５０回／分の振盪を
９０分間行ない、遊離してきたプロトプラストの数を０
．１の深さのへモサイトメーターを用いて計測し細胞を
測定した。

２　ニンジン　養細　からの植物体再生シヨ糖３％を含
むＭＳ培地に（ＩＩ）で調製したクロレラ・サッカロフ
ィラ、クロレラ・ブルガリス及びセネデスムス・ビジュ
ガトウス培養濾波及び菌体抽出液をｌ％添加した培地、
それらの高分子画分と塩基性画分を１．５０ｐｐｍ添加
した培地、及び無添加の培地を用い、Ｄ）で作製したニ
ンジン培養細胞を２５℃、暗条件下で３０日間液体振盪
培養し、形威された不定胚について１０日目、２０日目
、３０日目に観察した。

結果を表−２に示す。

（以下、余白） ２ （注３） で割った値（％）。

○：不定胚から発芽、発根の形態の変化が速やかに起こ
り、威長も速かった。

×：不定胚から発芽、発根の形態の変化が速やかに起こ
らなかった。

Ｘ〜○：形態変化が混在。

（実施例３　ニンジン不定胚からの植物体再生ニンジン
不定胚は（１）で得た不定胚から４２５及び８００μｍ
のメッシュを用い４２５〜８００μｍの大きさの不定胚
を選別し使用した。

得られた球状から魚雷型までの不定胚を植物ホルモンを
含まないＭＳ培地で液体振盪培養した。

この際、（ｎ）で調製した微細藻類培養濾波及び菌体抽
出液を１．５％添加した培地、それらの塩基性画分と高
分子画分を２００ｐｐｍ添゛加した培地、及び無添加の
培地を用いた。２５℃、明条件下（２０００ルックス、
１６時間照明）で３０日間培養し、植物体の再生を調べ
た結果を表−３に示す。

（以下、余白） ２３ 表−３ ２４ （注４） ×：或熟胚まで至っていない。

△：胚の生長は認められるが、期間内では植物体の再生
が認められない。

○：威熟胚を経由し、植物体を再生しているものがある
。

◎：グリーニング化が起こり、高率で植物体が再生して
いる。

材料は、カトレア類に属するレリオカトレア（　Ｌ　ａ
ｅｌｉｏｃａｔｔｌｅｙａ）の側芽の生長点付近の分裂
組織から誘導されたプロトコーム状球体（以下、ｒＰＬ
ＢＪと略記する）である。ＰＬＢ培養培地としてはハイ
ポネックス（Ｈｙｐｏｎｅｘ　：　６　．　５−６−１
９）にジャガイモジュース７％、炭素源としてシヨ糖２
％を含むものを使用した。

初期誘導のＰＬＢから威熟したＰＬＢを選び、更に各々
の１個のＰＬＢを４つに分割し、供試用ＰＬＢを調製し
た。

ＰＬＢ培養培地に対して（ＩＩ）で調製した微細藻類培
養濾波及び菌体抽出液を０．５％添加した寒天培地，そ
れらの塩基性画分と高分子両分を１００　ｐｐｍ添加し
た寒天培地と、及び無添加の寒天培地を用い，２５℃、
明条件下（２０００ルックス、１６時間照明）で６０日
間培養し、４０日後の置床ＰＬＢの状態と、６０日後の
増殖したＰＬＢ数と、それからのシュート発生数を調べ
た結果を表−４に示す。

ｍｌＩ５　）コチョウランのステムカルチャーとコチョ
ウラン（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　）のステムカルチ
ャーを行い幼植物体の或長度合を調べ，ついで成長点お
よび幼葉からのＰＬＢの形或に与える影響を調べた。培
地は基本的には２％シヨ糖とココナツトミルク（１５０
ｇ／Ｑ）　を含むペイシンとウエント（Ｖａ　ｃ　ｉ　
ｎ　　＆　Ｗｅ　ｎ　ｔ）培地（以下、「ＶＷ培地」と
略記する）を用いた。

ステムを腋芽が真ん中にくるように５〜Ｖａｎ位に切り
そろえ表面を殺菌した。（ＩＩ）で調製した微細藻類培
養濾波及び菌体抽出液を０．５％添加した寒天培地、そ
れらの塩基性画分と高分子画分を１００ｐｐｍ添加した
寒天培地と、及び無添加の寒天培地に切りそろえたステ
ムの下端を差込み、２６℃明条件（２　０　０　０ルッ
クス、１６時間照明）下で培養した。腋芽から発生した
幼植物体の或長を培養２ケ月後に観察した結果を表−５
，１に示す。

２７ また、得られた無菌の幼植物体の頂芽及び側芽から成長
点を摘出し、更に開花前のステム腋芽からも無菌的に或
長点を摘出し、（ＩＩ）で調製した微細藻類培養濾波及
び菌体抽出液を１％添加した寒天培地、それらの塩基性
画分と高分子画分を１００ｐｐｍ添加した寒天培地、及
び無添加の寒天培地に置床し、２６゜Ｃ、明条件（２０
００ルックス、１６時間照明）下で培養した。

培養２ケ月後の幼植物体由来の戊長点の活着率とＰＬＢ
の増殖を調べた結果を表−５．２に、ステム腋芽からの
成長点の結果を表−５．３に示す。

更に、前述のステムカルチャーで得られた幼植物体から
の幼葉の葉柄近くの部位を約３ＩＩＩｎ角に切り出し葉
片培養に用いた。ナフタレン酢酸０．１ｐｐｍ、ペンジ
ルアデニン０．１ｐｐｍ添加した基本培地に、（ＩＩ）
で調製した微細藻類培養濾波及び菌体抽出液を１％添加
した寒天培地、それらの塩基性画分と高分子画分を１０
０ｐｐｍ添加した寒天培地、及び無添加の寒天培地に葉
片２８ を置床し、２６℃で１ケ月間暗条件下で培養し、その後
明条件（２　０　０　０ルックス、１６時間照明）下で
培養した。培養３ケ月後の葉片からのＰＬＢの発生率を
表−５．４に示す。

（注６）Δ：第１葉まで発生している。

Ｏ：第２葉が出かかっている。

◎：第２葉まで完全に発生している。

ｌ＼数 ム数 ３１ 表−５．４ ３２ ６　タバコカルスからの植物　の再生 タバコのカルスからの植物体の再生において微細藻類抽
出物及び微細藻類培養濾液の添加による影響について調
べた。

材料は、タバコ（　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ
ｍ　Ｌ．ｃｖ．Ｂ　ｒｉｇｈｔ　Ｙ　ｓｉｌｏω）の茎
の髄組織由来のカルスである。カルスの培養は、ＭＳ培
地を使用し、これに植物ホルモンとしてインドール酢酸
（１■／Ｑ）とカイネチン（０．１ｍｇ／（１）を添加
した寒天培地上で継代培養した。

芽の分化誘導の基本培地としては、ＭＳ培地に植物ホル
モンであるインドール酢酸（０．１■／Ｉｌ！）とカイ
ネチン（ｌ■／Ｑ）を加えた寒天培地を使用した。上記
基本培地に対して、（Ｉｆ）で調製した細藻類培養濾波
及び菌体抽出液を１．５％添加した寒天培地、それらの
塩基性画分と高分子画分を２００ｐｐｍ添加した寒天培
地、及び無添加の寒天培地を作製した。それぞれの培地
に対して、継代培養されたカルスをカミソリの刃を用い
て５角の大きさに切断し、カルス切片を試験管ｌ本にｌ
個の割合で移植したものを各２５本用意し２５℃、明条
件下（２０００ルックス、１６時間照明）で工４日間培
養した結果を表−６に示す。

７セントポーリア　　からの　　　の 活コ（ ナフタレン酢酸（１■／党）とカイネチン（１■ｌ０を
含むＭＳ培地を基本培地とし、（ＩＩ）で調製した微細
藻類培養濾波及び菌体抽出液を２％添加した寒天培地、
それらの塩基性画分と高分子画分を２００ｐｐｍ添加し
た寒天培地、及び無添加の寒天培地を作製した。それぞ
れの３００■容の三角フラスコ中の寒天培地に５位に切
断したセントポーリア葉柄を置床し、置床後１週間は暗
所培養し、その後２０℃、明条件（２０００ルックス、
１６時間照明）で３０日間培養し、発生したシュート及
び葉の状態を観察した。

その結果を表−７に示す。

（以下、余白） 一３５ ８　ニンジン　　　の生 ニンジン不定胚は、（１）で得た不定胚から１４８μｍ
及び２００μｍのナイロンメッシュを用いて大きさ１４
８〜２００μｍの不定胚を選別した。選別された不定胚
のほとんどは球状から初期の心臓型不定胚であった。

このようにして選別された不定胚を、植物ホルモンを含
まないＭＳ培地で液体振盪培養して生長させ、あるいは
植物体にまで再生させた。

この際、（ｎ）で調製した微細藻類培Ｉｉ！濾液及び菌
体抽出液を１％添加した培地、それらの塩基性画分と高
分子画分を１００　ｐｐｍ添加した培地、及び無添加の
培地を用いて、２５℃、暗条件下（２０００ルックス，
１６時間照明）１２日間培養し、不定胚の生長状態を調
べた結果を表一８に示す。

（以下、余白） 表 ８ （注１０）全不定胚数：培地１０ｍｌ当りの不定胚数（
植物体を含む）。

（注１１）或熟不定胚形或率：８００μｍのメッシュを
通過しない成熟不定胚の形或率。

（注１２）植物体形成率：グリーニングし、発芽発根し
ているものの形或率。

９　ニンジン　　胚を用いた人工種子のニンジン不定胚
は（１）で得た不定胚から２００μｍ及び４２５μｍの
ナイロンメッシュを用いて２００〜４２５μｍの大きさ
に生長した不定胚のみを選別使用した。選別された不定
胚のほとんどは，球状から初期の心臓型不定胚であった
。

このようにして得られた不定胚をＭ　Ｓ　Ｈ’＋地２５
ｍｌ中に懸濁し、包埋剤として３％（Ｗ／Ｖ）アルギン
酸ナ１・リウムを含む７５ｍ１のＭＳ培地と上記の懸濁
液とを混ぜ合わせ、混液１００ｍｌを得た。このとき、
上記混液１００ｎ＋１に対して微細藻類培養液及び抽出
物を１％濃度で、更に高分子画分と塩基性画分をそれぞ
れ１５０ｐｐｍの濃度で添加した。得られた最終混液を
、５０ｍＭの塩化カルシウム溶液中に滴下することによ
って、アルギン酸カルシウムからなる人工膜を有する球
状の人工種子を得た。

ついで、この人工種子を、無菌的に２５℃、３９ 明条件（２０００ルックス、１６時間照明）で２５日間
培養し、発根、発芽状態を調べた。結果を表−９に示す
。

一４〇一 の個数で割った値 （発明の効果） 真核細胞の微細藻類の培養濾波及び／又は抽出物中の高
分子画分及び／又は塩基性画分を含む培地で培養する本
発明の植物組織培養法によれば、植物の組織とか器官と
かこれらの一部やあるいは培養細胞といったものの培養
、増殖を効果的に促進させることができ、不定胚に形成
、植物体の再生を促進させることができる。

また、人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾波及び／
又は抽出物を含ませてなる発明の人工種子は発芽率の高
いものたり得る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）真核細胞の微細藻類の培養濾波及び／又は抽出物
   中の高分子画分及び／又は塩基性画分を含む培地で、植
   物の組織とか器官もしくはこれらの一部あるいは培養細
   胞を培養することを特徴とする植物組織培養法。
2. （２）植物体組織を人工胚乳及び人工膜によって包埋し
   てなる人工種子において、前記人工胚乳に真核細胞の微
   細藻類の培養濾波及び／又は抽出物を含ませてなること
   を特徴とする人工種子。