JP2936487B2 - 植物組織培養法及び人工種子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物の組織とか器官もしくはこれらの一部
あるいは培養細胞を培養することによって、植物体を再
生させる植物組織培養法及び人工種子に関する。

（従来の技術とその課題） 植物組織培養技術を用いて植物体を再生させること
は、例えば、人工種子の開発に見られるように、近年の
植物バイオテクノロジーの進歩に伴いますます重要にな
りつつある。

この植物組織培養技術を用いての植物体再生法は、出
発材料により脱分化系と分化系の２種に大きく分けられ
る。

脱分化系はカルスや液体培養細胞などの脱分化した状
態を経由して植物体を再生させる方法で、具体的にはク
ラスターカルスから多くのシュートを発生させ、発生し
た各々のシュートから発根させ幼植物体を再生させる方
法と、細胞に直接不定胚（体細胞胚）を形成し、これを
幼植物体にまで再生させる方法とがある。

また、分化系では成長点を含む茎頂、休眠芽、側芽、
胚、種子などが出発材料になり、更に成長点を含まない
胚軸、子葉、茎なども用いられる。この系には、上述し
た植物組織にマルチプルシュートを形成させ、ついでこ
れらを切除した単一シュートから連続的にマルチプルシ
ュートを発生させる連続シュート生産システムを確立
し、最終的に切除したシュートから発根させ幼植物を再
生させる方法がある。

これら脱分化系、分化系のいずれの方法によるにして
も、再生効率を高めるために種々の条件について検討が
なされている。例えば、温度とか光量とか光周期とかと
いった物理的条件、培地の、無機塩類とかビタミンとか
糖といった化学的条件、サイトカイニン／オーキシンの
量比とかジベレリン類やアブシジン酸類などの添加とい
った植物ホルモン条件、更には、用いる植物の齢や組織
に関連する条件とか、固体培養か液体培養（静置培養、
回転培養、振盪培養、タンク培養など）かといった条件
などである。

しかし、未だに、植物組織や培養細胞などを効果的に
増殖あるいは分化させたり、植物組織や培養細胞などか
らの植物体再生を効率よく促進させたりする植物組織培
養法は確立されていない。実際、脱分化系での植物体再
生では、不定胚形成やカルスからのシュートや根の形成
を誘導できない植物種も多い。理由は定かではないが、
魚雷型胚まで生長すると不定胚が生長を停止して植物体
にまで再分化する率が極めて低下するという現象も起こ
っている。また、分化系での植物体再生でも、未だに植
物や組織によってはシュート・根の形成をしないものも
ある。更に、脱分化系、分化系のいずれにおいても、植
物ホルモンの種類やその添加量によっては、増殖や分化
を阻害する等の問題が発生している。また、高い発芽率
を有する人工種子も完成されていない。

各種の植物組織や器官あるいは培養細胞からの不定胚
形成率を高め、さらには不定胚の生長や植物体への再生
を効果的に促進させる方法が望まれるところである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記課題の解決のために光合成原核微
生物に着眼して種々検討を加えてきたが、光合成原核微
生物の中でも、シアノバクテリア、それも特定のものが
特に効果的であることを知見し、本発明を完成させるに
到った。即ち、本発明は、 （１）ヘテロシストを形成したシアノバクテリアの培養
濾液及び／又は抽出物を含む培地で、植物の組織若しく
は器官又はこれらの一部若しくは培養細胞を培養するこ
とを特徴とする植物組織培養法。

（２）植物組織を人工胚乳及び人工膜によって包埋して
なる人工種子において、前記人工胚乳にヘテロシストを
形成したシアノバクテリアの培養濾液及び／又は抽出物
を含ませてなることを特徴とする人工種子。

を要旨とする。

以下、詳述する。

光合成原核微生物の中で、シアノバクテリアには一種
の細胞分化を示す種が認められている。R.Rippkaら（Jo
urnal of General Microbiology,111,1−61（1979））
の分類によりグループIVとＶに属する株がこれに相当す
る。グループIVに属する菌株としては、例えば、アナベ
ナ属（Anabaena）、ノデュラリア属（Nodularia）、シ
リンドロスペルム属（Cylindrospermum）、ノストック
属（Nostoc）、シトネーマ属（Scytonema）、カルトリ
ックス属（Calothrix）がある。また、グループＶに属
する菌株としては、例えば、クロログレオエオフィシス
属（Chlorogloeopsis）、フィシェレラ属（Fsherella）
がある。具体例としては、アナベナ属（Anabaena sp.）
ATCC 29211、ノデュラリア属（Nodularia sp.）ATCC 29
167、シリンドロスペルム属（Cylindrospermum sp.）AT
CC 29204、ノストック属（Nostoc sp.）ATCC 27896、シ
トネーマ属（Scytonema sp.）ATCC 29171、カルトリッ
クス属（Calothrix sp.）ATCC 29156、クロログレオエ
オフィシス・フリットシィ（Chlorogloeopsis fritschi
i）ATCC 27181、フィシェレラ属（Fsherella sp.）ATCC
29114などが挙げられる。また、これらの変種や異種、
その他、天然から分離の海洋性、淡水性の菌株の中にも
存在する。

これらは、糸状体構造を有しており、細胞分化の形態
としてアキネイト（Akinetes）と呼ばれる胞子を形成し
たりする。ヘテロシスト（Heterocyst）もこの形成され
るもののの一つで、異型細胞である。尚、このヘテロシ
スト細胞は、窒素源が著しく欠乏したときに分化形成さ
れ、形成されたヘテロシスト細胞は窒素固定を行ってい
ることが明らかになっている。

従って、例えば、通常はアンモニウム塩、硝酸塩など
の窒素源を含有した培地で上述した菌株は培養される
が、この窒素源を除いた培地で培養することでヘテロシ
ストを形成できる。このヘテロシストを形成したシアノ
バクテリアの培養濾液や抽出物を利用する。ここで、培
養にあたっての光照射条件は、通常の培養と同様である
が、数百〜１万ルックス程度が好ましい。また、培養
は、通常、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外開
放培養で行い得るが、天然にある程度豊富に存在するな
らば、その菌体の生育存在する海水あるいは淡水を培養
液とすることもできる。

培養濾液は、例えば、適宜一種もしくは二種以上組合
せの菌体の培養液を遠心分離あるいは濾過などを行って
取得されるが、得た培養濾液の生物活性が弱い場合は、
減圧濃縮などにより濃縮して用いてもかまわない。但
し、この際、濃縮倍率が大きくなり塩濃度が高くなると
植物組織に悪影響を与えることもあるので、電気透析な
どで植物組織に悪影響がなくなるまで脱塩して使用する
のが望ましい。

また、培養条件や菌株などにもよるが、培養したシア
ノバクテリアには、通常細胞数個〜十数個に１個の割合
でヘテロシスト細胞が散在している。抽出物は、通常、
必要に応じて適宜破砕した菌体を必要に応じて加熱した
溶媒と接触させて抽出するなどして得られるが、強い生
物活性を有するものを得るには、例えば、フレンチ・プ
レスなどの機械的処理とか、リゾチウムを用いた酵素処
理などにより通常細胞だけを破壊し、ヘテロシスト細胞
だけを分離後、抽出処理を行えばよい。用いる溶媒は、
適宜一種もしくは二種以上の組合せで、一般的には水性
のものが好ましい。例えば、水、酸、塩基、塩類、有機
溶媒を溶解した溶液などである。また、メタノール、エ
タノール、酢酸エチルエステル、エーテルなどの有機溶
剤で抽出後、水性溶媒で抽出することなどもできる。

更に、培養濾液や抽出物は、例えば、高分子画分な
ど、適宜の画分とできる。

高分子画分は、培養濾液あるいは抽出液から一般的な
分子量に基づく分画法、例えば透析、ゲル濾過、限外濾
過等で得ることができる。分子量的にはおよそ8,000以
上の画分である。このようにして得られた高分子画分も
適宜濃縮あるいは希釈して使用できる。更に、これらの
分画液を減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥し
粉末としたものも使用できる。

このような、必要に応じて適宜画分とした培養濾液及
び／又は抽出物の基本培地への添加量は、用いる菌、培
養条件、ヘテロシスト形成率などの条件により一概に規
定することは困難であるが、有効な添加量は実験により
容易に決めることができる。例えば、アナベナ属ATCC 2
9211を用いる場合には、培養濾液については150倍に濃
縮したものを基本培地に対して0.1〜５％（v/v）の濃度
範囲で、また、抽出物についてはヘテロシスト細胞3g菌
体を100ml抽出用液で抽出したものを基本培地に対して
１〜1000ppmの濃度範囲で添加するなどできる。ちなみ
に、添加濃度が高すぎると効果が低下することがある。
尚、植物組織培養に使用する基本培地や培養方法などは
通常の植物組織培養におけるものと同様である。即ち、
基本培地としては、ムラシゲ＆スクーグ（Murashige ＆
Skoog）培地（1962）（以下「MS培地」と略記する）を
代表的なものとして挙げられるが、その他の植物組織培
養に適した種々の培地、あるいはそれらの改変培地を適
宜選択して使用することもできる。更に、通常の培養に
使用される植物ホルモン、ココナッツミルク、カゼイン
分解物や酵母抽出物等を目的に応じて併せて添加しても
よい。また、培養の対象となる植物の種類は、分化全能
性を有し組織培養が可能であれば特に制限はなくどんな
ものでも適用可能である。これらは植物の組織、器官、
あるいはそれらの一部、あるいは培養細胞を培養に供す
ることができるが、初代培養、継代培養いずれのものも
培養可能である。従って、不定胚を形成させたり、植物
体を再生させたり、また、植物体を再生させるにあたっ
て、カルスを培養したり、不定胚を培養したり、プロト
コーム状球体を培養したりすることができる。また、人
工胚乳に必要に応じて適宜画分とした培養濾液及び／又
は抽出物を含ませておくことにより、高い発芽率の人工
種子となる。

（実施例） 以下、最初に使用するものなどについて述べ、次い
で、試料として代表的なニンジンを利用しての一例を挙
げるが、本発明は、これらに限定されるものではない。

（Ｉ）シアノバクテリアのヘテロシスト形成 アナベナ属ATCC 29211を、窒素源を除いたBG11倍地
（ATCC指定の倍地）により培養した。25℃、2000ルック
ス、の光照射（12時間明暗サイクル）下における通気培
養である。

（II）培養濾液と抽出物の調製 ＜ｉ＞培養濾液の調製 上記（Ｉ）で得た培養物を遠心濾過して濾液を得、エ
バポレイターで100倍に濃縮した。この濃縮液をモザイ
ク荷電膜脱塩器（デザルトンDS−103:東ソー株式会社）
で脱塩し、0.45μｍのメンブランフィルターを用いて濾
過した。

＜ii＞抽出物の調製 上記（Ｉ）で得た培養物から菌体を集菌し、洗浄後、
リゾチウム処理（濃度1mg/ml、37℃、30分）し、超音波
処理で通常細胞を破壊した。これを遠心分離してヘテロ
シスト細胞を得、更に、凍結乾燥し、水に対して３％に
なるように懸濁させ、100℃で60分間熱水抽出し、遠心
分離して上澄液を0.45μｍメンブランフィルターを用い
て濾過した。

＜iii＞比較例用培養濾液の調製 上記（Ｉ）において窒素源を除かないBG11培地を用い
て培養物を得、これを上記（II）＜ｉ＞と同様に処理し
た。

＜iv＞比較例用抽出物の調製 上記（Ｉ）において窒素源を除かないBG11培地を用い
て培養物を得、これを上記（II）＜ii＞と同様に処理し
た。

（III）高分子画分の調製 上記（II）＜ii＞で得た抽出物50mlをビスカゼ（VISK
ASE）社の透析用セルロースチューブ（商品名：セルロ
ースチューブ30/32）を用いて蒸留水１に対して透析
して透析内液を得、これを凍結乾燥を行った。

（IV）ニンジン不定胚の培養 ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が10cm位に
生長したものを約1cm位に切断し、下記培地中で25℃、
暗条件下で培養した。培地は基本培地としてMS培地を使
用し、これにショ糖３％、オーキシン類の植物ホルモン
である2,4−Ｄ（2,4−ジクロロフェノキシ酢酸）1mg/
を添加しpH5.5〜pH5.7に調整した。約１ケ月の培養後、
培地中の2,4−Ｄ濃度を0.11mg/に減少させた培地に移
植し、振盪速度90回／分のレシプロ式シェーカーを用い
て振盪培養した。その後、１週間に１回の割合で、2,4
−Ｄを0.11mg/含む培地に植え継いでニンジン培養細
胞を得た。

そして、このような液体培養により継代培養した培養
細胞を2,4−Ｄを含まない基本培地に移植して培養する
ことにより、不定胚を形成させた。

（実施例１）ニンジン不定胚からの植物体再生 ニンジン不定胚は上記（IV）で得た不定胚から425及
び800μｍのメッシュを用い425〜800μｍの大きさの不
定胚を選別し使用した。得られた心臓型から魚雷型まで
の不定胚を、植物ホルモンを含まないMS培地に上記（I
I）＜ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％添加した培地で液
体振盪培養した。

（実施例２）同上 実施例１において、植物ホルモンを含まないMS培地
に、上記（II）＜ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％添加
する代わりに上記（II）＜ii＞で調製した抽出物を150p
pm添加して使用した以外、すべて実施例１と同様にし
た。

（実施例３）同上 実施例１において、植物ホルモンを含まないMS培地
に、上記（II）＜ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％添加
する代わりに上記（III）で調製した高分子画分を50ppm
添加した以外、すべて実施例１と同様にした。

（比較例１）同上 実施例１において、植物ホルモンを含まないMS培地
に、上記（II）＜ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％添加
する代わりに上記（II）＜iii＞で調製した培養濾液を
1.5％添加して使用した以外、すべて実施例１と同様に
した。

（比較例２）同上 実施例１において、植物ホルモンを含まないMS培地
に、上記（II）＜ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％添加
する代わりに上記（II）＜iv＞で調製した抽出物を150p
pm添加して使用した以外、すべて実施例１と同様にし
た。

（比較例３）同上 実施例１において、植物ホルモンを含まないMS培地
に、上記（II）＜ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％添加
することなく使用した以外、すべて実施例１と同様にし
た。

以上、各例のものについて、25℃、明条件下（2000ル
ックス、16時間照明）で７日間培養し、植物体再生率
（不定胚のグリーニング及び発芽発根を認められたもの
の率）を調べた結果を表−１に示す。

（実施例４）ニンジン不定胚を用いた人工種子の発芽促
進 ニンジン不定胚は上記（IV）で得た不定胚から425μ
ｍ及び800μｍのナイロンメッシュを用いて425〜800μ
ｍの大きさに生長した不定胚のみを選別使用した。選別
された不定胚のほとんどは、球状から初期の心臓型不定
胚であった。

このようにして得られた不定胚をMS培地25ml中に懸濁
し、包埋剤として３重量％のアルギン酸ナトリウムを含
む溶液75mlと混ぜ合わせ、混液100mlを得た。このと
き、上記混液100mlに対して上記（II）＜ｉ＞で調製し
た培養濾液を1.5％濃度で添加した。得られた最終混液
を、50mMの塩化カルシウム溶液中に滴下することによっ
て、アルギン酸カルシウムからなる人工膜を有する球状
の人工種子を得た。

（実施例５）同上 実施例４において、混液100mlに対して上記（II）＜
ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％濃度で添加する代わり
に上記（II）＜ii＞で調製した抽出物を150ppm添加した
以外、すべて実施例４と同様にした。

（実施例６）同上 実施例４において、混液100mlに対して上記（II）＜
ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％濃度で添加する代わり
に上記（III）で調製した高分子画分を50ppm添加した以
外、すべて実施例４と同様にした。

（比較例４）同上 実施例４において、混液100mlに対して上記（II）＜
ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％濃度で添加する代わり
に上記（II）＜iii＞で調製した培養濾液を1.5％添加し
て使用した以外、すべて実施例４と同様にした。

（比較例５）同上 実施例４において、混液100mlに対して上記（II）＜
ｉ＞で調製した培養濾液を1.5％濃度で添加する代わり
に上記（II）＜iv＞で調製した抽出物を150ppm添加して
使用した以外、すべて実施例４と同様にした。

（比較例６）同上 実施例４において、混液100mlに対して上記（II）＜
ｉ＞で調製した培養濾液を添加することなく使用した以
外、すべて実施例４と同様にした。

以上、各例の人工種子について、無菌的に25℃、明条
件（2000ルックス、16時間照明）で25日間培養し、発芽
率を調べた結果を表−２に示す。

（発明の効果） ヘテロシストを形成したシアノバクテリアの培養濾液
及び／又は抽出物を含む培地で培養する本発明の植物組
織培養法によれば、植物の組織とか器官とかこれらの一
部やあるいは培養細胞といったものの培養、増殖を効果
的に促進させることができ、不定胚に形成、植物体の再
生を促進させることができる。

また、人工胚乳にヘテロシストを形成したシアノバク
テリアの培養濾液及び／又は抽出物を含ませてなる本発
明の人工種子は発芽率の高いものたり得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅津 博紀 埼玉県草加市吉町４―１―８ ぺんてる 株式会社草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２―41―13 府中第三 住宅２―304 審査官 坂田 誠 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A01H 4/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヘテロシストを形成したシアノバクテリア
   の培養濾液及び／又は抽出物を含む培地で、植物の組織
   若しくは器官又はこれらの一部若しくは培養細胞を培養
   することを特徴とする植物組織培養法。
2. 【請求項２】植物組織を人工胚乳及び人工膜によって包
   埋してなる人工種子において、前記人工胚乳にヘテロシ
   ストを形成したシアノバクテリアの培養濾液及び／又は
   抽出物を含ませてなることを特徴とする人工種子。