JP3134138B2 - 植物成長調節剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物組織培養における
植物の成長、分化、物質生産、物質変換などの調節制御
とか、農業や園芸などにおける植物の増産増収、成長促
進、老化防止などの植物生理状態の調節制御等とかとい
ったことに有効な植物成長調節剤に関する。

【０００２】

【従来の技術とその課題】本発明者らは、光合成原核微
生物の培養濾液や抽出物中の核酸画分、蛋白質画分、多
糖画分が植物の再生促進に有効な成分であることを知見
し、先に出願をした（特開平３−２２７９０５号公報参
照）。

【０００３】本発明は、その後の更なる検討によるもの
で、特定の多糖が植物成長調節機能を有効に発揮する植
物成長調節物質たり得るという知見に基づくものであ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、リポ多糖を植
物成長調節物質とする植物成長調節剤を要旨とする。

【０００５】以下、光合成原核微生物の培養濾液や抽出
物に関する本発明者らの検討からの履歴に沿った形で詳
述する。

【０００６】光合成原核微生物には、例えば、シアノバ
クテリア類として、ＡＴＣＣ２７１８１などのクロログ
レオピシス属（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｉｓｉｓ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ２９３７１などのデルモカルパ属（Ｄ
ｅｒｍｏｃａｒｐａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３３０４７な
どのアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）、ＡＴＣ
Ｃ２９２１５などのスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ
ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２７１４４、ＡＴＣＣ２７１９
４、ＡＴＣＣ２９５３４、ＡＴＣＣ２７１７０などのシ
ネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ２７９０４などのノストック属（Ｎｏ
ｓｔｏｃ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２７９０６などのオスシ
ラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ま
た、光合成細菌類として、ロドシュ−ドモナス・アシド
フィラ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄ
ｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ２５０９２、ロドシュ−ドモナ
ス・ルティラ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒ
ｕｔｉｌａ）ＡＴＣＣ３３８７２、ロドシュ−ドモナス
・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１７０２４、ロドシュ
−ドモナス・ブラスティカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）ＡＴＣＣ３３４８５、ロ
ドシュ−ドモナス・ビリディス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１９５６７な
どのロドシュ−ドモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．）、ハロバクテリウム・クチルブルム
（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｒｕｂｒｕ
ｍ）ＡＴＣＣ３３１７０、ハロバクテリウム・メディテ
ラネイ（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉｔｅｒ
ｒａｎｅｉ）ＡＴＣＣ３３５００、ハロバクテリウム・
サッカルボルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃ
ｃｈａｒｏｖｏｒｕｍ）ＡＴＣＣ２９２５２、ハロバク
テリウム・サリナリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１９７００、ハロバ
クテリウム・ソドメンセ（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ３３７５５などのハロ
バクテリウム属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．）、ロドスピリラム・テヌエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ ｔｅｎｕｅ）ＡＴＣＣ２５０９３、ロドス
ピリラム・モリシアナム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕ
ｍ ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎｕｍ）ＡＴＣＣ１４０３１、
ロドスピリラム・ホトメトリクム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ２
７８７１、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐ
ｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）ＡＴＣＣ２７７、ＡＴ
ＣＣ１７０３１などのロドスピリラム属（Ｒｈｏｄｏｓ
ｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．）のもの、あるいは、これら
の変種や変異株がある。

【０００７】成育存在水からこれら光合成原核微生物を
得、これをそのまま使用してもよいが、収量安定化を図
る上で培養し、その培養液を遠心分離あるいは濾過など
を行い、更に必要に応じて減圧濃縮をなどをなして得た
濾液とか、菌体を必要に応じて適宜破砕し、これを適当
な溶媒と接触させて得た抽出物とかには、例えば、植物
体再生促進の機能がある。このことは、上述した先の出
願以前に既に本発明者らが明らかにしているところであ
る。ちなみに、培養には、光合成体の一般的な培地、例
えば、ＢＧ１１培地、ＡＳＭ−１培地、Ｚ８培地（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１６７巻、ｐ．８〜９参照）など
を利用してタンク培養とか屋外開放培養とかによって行
える。菌体量が十分ならば成育存在水をそのまま培養液
に利用してもよい。また、抽出のための溶媒には、菌体
によって種々のものを単独または複数併用できるが、一
般的には水性溶媒を使用するのが好ましい。水性溶媒と
しては、水単独でも、酸、塩基、塩類、界面活性剤、酵
素、有機溶媒といったものを適宜溶解した水溶液などで
あってもよい。また、メタノ−ル、エタノ−ル、ホルム
アミド、ジエチレングリコ−ル、ジメチルスルホキシ
ド、クロロホルムなどの有機溶媒で抽出後、有機溶媒を
除去し、水に溶解させるといったように多段階抽出も可
能である。

【０００８】上記培養濾液にしても抽出物にしても、こ
れらには、少なくとも分画前においては種々の成分が含
有されており、先の出願における核酸、蛋白質、多糖の
それぞれの画分使用が有効であったことからも窺われる
ように、植物成長調節機能を有効に発揮する成分も複数
存在している。また、核酸、蛋白質多糖画分についても
複数のものが存在する可能性がある。既に明らかにされ
ている植物成長調節物質は、植物ホルモン様化合構造物
をはじめとして、低分子物質が多く、蛋白質性や多糖類
の高分子物質に植物成長調節機能を有する物質が単離さ
れた例はなく、分離選択により物質の特徴を明らかにす
ることは、植物組織培養における植物の成長、分化、物
質生産、物質変換などの調節制御とか、農業や園芸など
における植物の増産増収、成長促進、老化防止などの植
物の生理状態の調節制御を人為的に行なうことに対して
大きな選択の幅を広げることになりきわめて有用であ
る。

【０００９】この点、本発明者らが思い立ったのは、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による選択分
離である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下における
電気泳動法であり、蛋白質の混合物を構成成分に分画す
るための手法として一般に知られており、この思い立っ
た時点においては、蛋白質と一体的な多糖が存在し、こ
れが有効成分としての本質かも知れないという期待も含
んだものであった。

【００１０】そこで、種々の培養濾液や溶媒抽出液を準
備し、これらをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動させ、バンド部分を切り出し、成分としての有効性を
確認するという作業を継続していったところ、まず、判
明したのは、出発原料としての抽出物からの夾雑物の除
去を予め施した物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動パタ−ンの比較と活性の確認である。尚、夾雑物
の除去は、酸、アルカリ、塩類、有機溶媒などを用いて
の分別沈殿法、ゲル濾過法、陰イオン交換体、陽イオン
交換体などを用いてのイオン交換法、超遠心法などの適
宜精製・分画法や、酵素を用いての分解・低分子化法な
どが利用でき、例えば、代表的な夾雑物である蛋白質や
核酸の排除には、トリクロロ酢酸、ＳＤＳ−フェノ−
ル、クロロホルムなどの有機溶媒や、塩化亜鉛、硫安な
どの塩類を用いて沈殿させたり、ペプシン、パパイン、
トリプシン、プロナ−ゼ、プロテア−ゼ、ペプチダ−
ゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅなどの酵素を用いて分解・
低分子化したり、更に、このように分解・低分子化した
ものに対して、透析、ゲル濾過、限外濾過などを行った
りすればよい。

【００１１】そしてまた判明したのは、後述実施例に一
例を示すように、夾雑物を除去したものにおいて形成さ
れたバンド部分と、これに対応するバンド部分で夾雑物
を除去しないものにおいて形成されたバンド部分に位置
するものは、ともに、植物成長調節機能を有するという
ことである。具体的には、それぞれの対応バンド部分を
切り出し、粉砕後、ＳＤＳ含有トリス緩衝液で振盪抽出
し、限外濾過膜を用いて濾過することによりＳＤＳを除
去し、エタノ−ルを加えて沈殿したものを回収し、これ
を試験に供したのであるが、このことより、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動でバンドを形成する多糖
に植物成長調節物質の本質というべきものが存在すると
いう確信を抱くに到ったのである。ここで、多糖である
ことについては、ＰＡＳ染色法を用いて確認した。これ
は、多糖を過ヨウ素酸で酸化するとアルデヒドが遊離さ
れ、シッフ反応陽性となることを利用したもので、マッ
クマナス（Ｊ．Ｅ．ＭｃＭａｎｕｓ，１９４６，１９４
８）、ホッチキス（Ｒ．Ｄ．Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ，１９
４８）以来、多糖の組織科学的検出に用いられている。
切り出したバンド部分のものに対するヘキソサミン、キ
シロ−ス、グルコ−ス、ガラクト−スといったものにつ
いての同定、及び、デオキシ糖であろうと推測される未
同定部分の存在を確認している。

【００１２】それでは、このＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動でバンドを形成した多糖は何かというこ
とになる。夾雑物の除去処理、特に、蛋白質の除去処理
の有無に拘らないということにより、上述した期待に固
執することなく、蛋白質とは独立したものであると考え
るのが自然であることは言うまでもない。これに関して
は、出発原料に光合成原核微生物を用いたことに鑑みれ
ば、多くの文献もあるように、常識的にはリポ多糖とい
うことになる。分離選別の過程は一般的なリポ多糖に対
するものと異なっているが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動後ＰＡＳ染色により確認できること、リ
ボ多糖が熱安定であること、一般的抽出法で得た得るＰ
ＳのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のＰＡ
Ｓ染色バンド位置が抽出精製されたものと一致すること
から、リボ多糖であることが考えられた。即ち、ここに
到って、光合成原核微生物以外のものに対する検討、及
び、リポ多糖として確認されているもの自体を用いての
検討の必要性が生じた訳である。

【００１３】リポ多糖は、細菌、特にグラム陰性菌につ
いてよく知られている。外膜構成成分の一つであって細
胞自体のバリヤ−となる抗原物質となり、また、分類学
的な鑑別性状の一つとして医学、生化学、細菌学などの
種々分野において研究対象とされている。ここで、光合
成原核微生物以外のグラム陰性菌には、例えば、化学合
成原核微生物として、ＡＴＣＣ９０２７、ＡＴＣＣ１３
５２５などのシュ−ドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２５９３５などのズ−グロエ属
（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ７９４４１な
どのグルコノバクタ−属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ．）、ＡＴＣＣ７４８６などのアゾトバクタ−属
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１４４
８０などのリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ１０３２４などのブラヂリゾビウム属
（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ
１１１５７などのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３５０６７などの
メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ１９０６９などのメチロコッカス属
（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、ＡＴＣＣ２９
２５２などのハロバクテリウム属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２５８６２などのハロコ
ッカス属（Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ
２７０６１などのアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３３４４５などのアセトバ
クタ−属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ＡＴＣ
Ｃ３３３３３などのスピリリュウム属（Ｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１１３３１などのアクアスピ
リリュウム属（Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ２７３７４などのキャンピロバクタ−
属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ
１５１５３、ＡＴＣＣ２３７１６などのエシェリシア属
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１９４
７６などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌａ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ１０７８７などのサイトバクタ−属
（Ｃｉｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ４３５２
などのクレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ２９９３０などのシゲラ属（Ｓｈｉｇ
ｅｌｌａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３３０２８などのエンテ
ロバクタ−属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、
ＡＴＣＣ２７１１７などのセラチナ属（Ｓｅｒｒａｔｉ
ｎａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１９６９２などのプロテウス
属（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１１９５３−
Ｂ１などのビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、ＡＴ
ＣＣ７９６６などのアエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２５９１５などのフォトバクテ
リウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、
ＡＴＣＣ７４６１などのクロモバクテリウム属（Ｃｈｒ
ｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３３８
６１などのフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３３３９１などのヘモ
フィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）、ＡＴ
ＣＣ８４８２などのバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２５５６３などのフゾバ
クテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ７７５７などのデサルフォビブリオ属
（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ２
９１７５などのブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂ
ｒｉｏ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１９２０５などのセレノモ
ナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ
９７９３などのナイセリア賊（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ２９５２３などのモラクセラ属（Ｍｏ
ｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１４９８７などの
アシネトバクタ−属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ１３５１１などのパラコッカス属（Ｐ
ａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１１０４１な
どのランプロペヂア属（Ｌａｍｐｒｏｐｅｄｉａ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ１７７４７などのベイロネラ属（Ｖｅ
ｉｌｌｏｎｅｌａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１４１２３など
のニトロバクタ−属（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．）、ＡＴＣＣ１９７１８などのニトロソモナス属
（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１９
７０７などのニトロソコッカス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ１５４６６などのチオバ
シラス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｕｓ ｓｐ．）、Ａ
ＴＣＣ３３８８９などのチオマイクロスピラ属（Ｔｈｉ
ｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、ＡＴＣＣ３３９０
９などのサルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓ
ｐ．）のもの、あるいは、これらの変種や変異株があ
る。

【００１４】そこで、一般的な抽出法に沿って分離選別
されたリポ多糖を用いての活性確認を行なったところ、
後述実施例に一例を示すように結果は満足できるもので
あった。また、バイオ試薬として市販されているリポ多
糖そのものを用いても、植物成長調節機能の発揮を認め
ることができた。ここで、市販品の一例としては、ベ−
ゼル（Ｐａｅｓｅｌ）社の、リポポリサッカライドクロ
マトグラフィカリ−ピュアリファイド（Ｌｉｐｏｐｏｌ
ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ）シリ−ズやリポポ
リサッカライドフェノ−ルエクストラクト（Ｌｉｐｏｐ
ｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ−Ｐｈｅｎｏｌ Ｅｘｔ
ｒａｃｔ）シリ−ズなどがある。

【００１５】リポ多糖を植物成長調節物質として用いる
にあたり、夾雑物の除去処理をし、なるべく精製度の高
いものを用いた方が機能上好ましいのは勿論である。し
かし、高価なものになってしまう。合成物の使用も一つ
の方法であるが、植物の組織培養技術や栽培技術の習熟
度の影響の大きさも考慮すると、むしろ、用途に応じて
精製度の選択をする方が実際的である。例えば、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりバンド形成し
た部分が特定の分子量部分に集中するのを利用して特定
範囲の分子量部分を取り出して用いることもできる。
尚、本発明の植物成長調節剤は、濃縮液、希釈液、乾燥
粉末など適宜状態で保存されてよく、例えば、農薬や肥
料などに対する添加物としておくことなどもできる。ま
た、使用にあたっては適宜濃度で用いればよく、その
際、他の植物成長調節剤を併用しても構わない。

【００１６】

【実施例】

＜実施例１＞シネココッカス属ＡＴＣＣ２７１９４をＡ
ＴＣＣ指定の培養条件にて培養後、遠心分離して集菌
し、更に、凍結乾燥した。これを水に対して３％の重量
割合（以下、同様）で懸濁して６０分間沸騰（熱水抽
出）後、遠心分離し、上澄液を０．４５μｍのメンブラ
ンフィルタ−にて濾過した。得た抽出液をレムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）の方法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動させた。使用したゲルは市販の１８％プ
レキャストゲル（テフコ株式会社製、ＳＤＳ ＰＡＧＥ
ｍｉｎｉ）である。ゲル１レ−ンに対するＰＡＳ染色
（過ヨウ素酸シッフ反応による染色）によるバンド確認
をした上、蛋白質分子量マ−カ−のレインボ−マ−カ−
（アマシャム社製のＲＰＮ．７５５；オブアルブミン４
６，０００、カルボニックアンヒドラ−ゼ３０，００
０、トリプシンインヒビタ−２１，５００、リゾチ−ム
１４，３００、アプロチニン６，５００、インスリンＡ
鎖２，３５０、インスリンＢ鎖３，４００、単位：ダル
トン）を基準にして９，４００ダルトンにあたるゲルを
切り出し、粉砕後、０．１％ＳＤＳ含有トリス緩衝液
（ｐＨ８．４）で振盪抽出し、分画分子量６，０００の
限外濾過膜ＡＩＰ−００１３（旭化成工業株式会社製）
を用いて濾過することによりＳＤＳを除去し、３倍量の
エタノ−ルを加えて沈殿回収し、凍結乾燥品を得た。

【００１７】＜実施例２＞実施例１において、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動させる前の抽出液に対
して核酸と蛋白質の除去処理を以下のとおり行って得た
凍結乾燥品を用いて実施例１と同様にＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動させた以外は、すべて実施例１
と同様にして凍結乾燥品を得た。

【００１８】抽出液５０ｍｌをセルロ−スチュ−ブ３０
／３２（ビスカゼ社製）を用いて蒸留水１ｌに対して透
析し、その透析内液を凍結乾燥した。この乾燥物をｐＨ
８．０のトリス緩衝液に溶解し、核酸分解酵素ベンゾン
ヌクレア−ゼ（メルク社製）を酵素：基質＝１：１０の
比率で添加して核酸を低分子化後、蛋白質分解酵素プロ
テナ−ゼＫ（メルク社製）を酵素：基質＝１：１０の比
率で添加して蛋白質、ペプチドを低分子化し、これら低
分子化したものを除去する為に分画分子量６，０００の
限外濾過膜ＡＩＰ−００１３（旭化成工業株式会社製）
を用いて濾過し、更に、フェノ−ル及びクロロホルムで
残存蛋白質を除去した。この溶液に３倍量のエタノ−ル
を加え、生じた沈殿物を回収して蒸留水に溶解し、４倍
量のエタノ−ルを加えて再び沈殿させ、回収した沈殿物
を０．３Ｍ酢酸カリウム溶液（ｐＨ８．３）に溶解し、
０〜４℃で撹拌しながらエタノ−ルを添加して沈殿さ
せ、その後も、エタノ−ル濃度を次第に高めながら回収
した沈殿物に対する洗浄を繰返し、最終的に凍結乾燥品
を得た。

【００１９】＜実施例３＞実施例２における核酸と蛋白
質の除去処理凍結乾燥品の炭酸水素アンモニウム溶液を
用い、これに対してトヨパ−ルＨＷ−５５（東ソ−株式
会社製）使用のゲル濾過を繰返し、デキストランＴ−４
０，Ｔ−７０，Ｔ−５００（ファルマシア社製）をマ−
カ−として分子量７０，０００〜１４０，０００ダルト
ン画分を分取した。ここで、該分子量範囲は、実施例２
で得たもの（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によるバンド形成物から得た凍結乾燥品）の概ね分布範
囲に相当する。

【００２０】＜実施例４＞実施例１における培養液の遠
心分離集菌残液の上澄液を０．４５μｍのメンブランフ
ィルタ−にて濾過し、この濾液をエバポレイタ−で１０
０倍に濃縮し、この濃縮液に実施例２における核酸と蛋
白質の除去処理を実施例２と同様にして行い、得た凍結
乾燥品を用いて実施例１と同様にＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動させた以外は、すべて実施例１と同
様にして凍結乾燥品を得た。

【００２１】＜実施例５＞アナベナ属ＡＴＣＣ３３０４
７をＡＴＣＣ指定の培養条件にて培養後、遠心分離して
集菌し、凍結乾燥品を得、これから、以下のとおりの一
般的なリポ多糖抽出法に基づいてリポ多糖（凍結乾燥
品）を得た。（「生化学実験講座４ 糖質の化学（１９
７６年、東京化学同人発行、ｐ２１５）参照）

【００２２】凍結乾燥品（２０ｇ）を水（３５０ｍｌ）
浮遊させ、６５〜６８℃の温浴中で撹拌し、これに予め
同温に温めておいた９０％フェノ−ルを等量加えて１０
〜１５分間ほど撹拌後、容器を氷水に浸し冷却する。つ
いで、遠心を行い、３層に分離したものの最上層（水
層）を取り出し、残部を水（３５０ｍｌ）とともに再び
６５〜６８℃で上のように処理する。取り出しておいた
水層分とを合わせて蒸留水に透析し、薄い乳白色の水溶
液を減圧下、３５〜４０℃で濃縮し１００ｍｌとする。
不溶物があれば遠心除去した後、凍結乾燥品とする。こ
れを３％水溶液にし、８０，０００×ｇで６〜８時間遠
心し、沈殿物を水に溶解し、上澄液の吸収曲線に２６０
ｎｍ極大値が消失するまで１０５，０００×ｇ、３時間
の遠心を繰り返す。

【００２３】＜実施例６＞実施例５において、アナベナ
属ＡＴＣＣ３３０４７を用いる代わりにロドシュ−ドモ
ナス属ＡＴＣＣ１７０２４を用いた以外、すべて実施例
５と同様にしてリポ多糖を得た。

【００２４】＜実施例７＞実施例５において、アナベナ
属ＡＴＣＣ３３０４７を用いる代わりにエシェリシア属
ＡＴＣＣ２３７１６を用いた以外、すべて実施例５と同
様にしてリポ多糖を得た。

【００２５】＜実施例８＞実施例５において、アナベナ
属ＡＴＣＣ３３０４７を用いる代わりにアクアスピリリ
ュウム属ＡＴＣＣ１１３３１を用いた以外、すべて実施
例５と同様にしてリポ多糖を得た。

【００２６】＜実施例９＞バイオ試薬として市販されて
いるベ−ゼル社製のリポ多糖（品番４０−０８１−０９
５；サルモネラ菌由来；フェノ−ル抽出法；コスモバイ
オ株式会社販売）を用いた。

【００２７】各例のものについて、ニンジンの不定胚か
ら植物体への再生に対する有効性を調べた結果を表１に
示す。ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が１０
ｃｍ位に生長したものを１ｃｍ位に切断し、これを、ム
ラシゲ＆スク−グ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏ
ｇ）培地（１９６２）（以下、「ＭＳ培地」と略記す
る）を基本培地としてショ糖（３％）と２，４−Ｄ（１
ｍｇ／ｌ）を加えてｐＨ５．５〜５．７に調整した培地
で、２５℃、暗条件で培養し、１ヵ月後、２，４−Ｄの
濃度を０．１１ｍｇ／ｌに減少させた培地に移植して振
盪培養し、その後、１回／週の割合で２，４−Ｄを０．
１１ｍｇ／ｌ含む培地に植え継いで得たニンジンの培養
細胞を、１／４濃度の基本培地に移植して不定胚を形成
させ、４２５〜８００μｍのものをメッシュ選別して得
た、ほとんどが魚雷型の不定胚を、基本培地に各例のも
のを表１記載の添加濃度で加えた各培地で液体振盪培養
（２５℃、明条件；２０００ルックス，１６時間照射）
したものであり、表中の値は、７日後の植物体再生率
（不定胚のグリ−ニング及び発芽発根を認められたもの
の率（単位：％））を示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】また、各例のものについて、ニンジン不定
胚を用いた人工種子の発芽発根に対する有効性を調べた
結果を表２に示す。前述同様に選別した不定胚を基本培
地２５ｍｌ中に懸濁し、３％のアルギン酸ナトリウムを
含む溶液７５ｍｌと混ぜ合わせ、また、各例のものを表
２記載の添加濃度で加え、これを５０ｍＭの塩化カルシ
ウム溶液中に滴下することによって、アルギン酸カルシ
ウムからなる人工膜を有する球状の人工種子を得、無菌
培養（２５℃、明条件；２０００ルックス，１６時間照
射）したものであり、表中の値は、２５日後の発芽率
（単位：％）を示す。

【００３０】

【表２】

【００３１】また、各例のものについて、タバコカルス
からの不定芽（シュ−ト）形成に対する有効性を調べた
結果を表３に示す。材料は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎ
ａｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌ
ｏｗ）の茎の髄組織由来のカルスで、ＭＳ培地にインド
−ル酢酸（１ｍｇ／ｌ）とカイネチン（０．１ｍｇ／
ｌ）を加えた１％寒天培地（以下、「寒天培地」と略記
する）上で継代培養したものである。カルスからの不定
芽形成は、ＭＳ培地にインド−ル酢酸（０．１ｍｇ／
ｌ）とカイネチン（１ｍｇ／ｌ）を加えた寒天培地を基
本培地とし、各例のものを表３記載の添加濃度で加えた
各培地で、カミソリで５ｍｍ角の大きさに切断したカル
ス切片を試験管１本に１個の割合で移植したものを各々
２５本作成し、２５℃、明条件（２０００ルックス，１
６時間照射）で培養したものであり、表中の値は、１４
日後の１カルス当りに発生したシュ−ト数を示す。

【００３２】

【表３】

【００３３】また、各例のものについて、セントポ−リ
ア葉柄からの不定芽（シュ−ト）形成に対する有効性を
調べた結果を表４に示す。ＭＳ培地にナフタレン酢酸
（１ｍｇ／ｌ）とカイネチン（１ｍｇ／ｌ）を加えた寒
天培地を基本培地とし、各例のものを表４記載の添加濃
度で加えた各培地で、５ｍｍ位に切断したセントポ−リ
ア葉柄を各１個置床したものを各々２５本作成し、置床
後１週間は暗所培養し、その後、２５℃、明条件（２０
００ルックス，１６時間照射）で培養したものであり、
表中の値は、明条件下に移植してから１ヵ月後のシュ−
トの大きさ（葉と葉柄とを合わせた平均長（単位：ｃ
ｍ））を示す。

【００３４】

【表４】

【００３５】また、各例のものについて、カトレアのプ
ロトコ−ム状球体（以下、「ＰＬＢ」と略記する）の分
割増殖及びＰＬＢからの植物体発生に対する有効性を調
べた結果を表５と表６に示す。材料は、カトレア類に属
するレリオカトレア（Ｌａｅｌｉｏｃａｔｔｌｅｙａ）
の側芽の生長点付近の分裂組織から誘導されたＰＬＢ
で、基本培地としては、ハイポネックス（Ｈｙｐｏｎｅ
ｘ：６．５−６−１９）にジャガイモジュ−ス（７％）
とショ糖（２％）を含むものを用いた。１個のＰＬＢを
４つに分割し、基本培地に各例のものを表５、表６記載
の添加濃度で加えた各寒天培地上で、２５℃、明条件
（２０００ルックス，１６時間照射）で培養したもので
あり、表中の値は、２ヵ月後の増殖ＰＬＢ数（表５）と
ＰＬＢからのシュ−ト発生率（表６）を示す。

【００３６】

【表５】

【００３７】

【表６】

【００３８】また、各例のものについて、コチョウラン
（Ｐｈｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）の花茎腋芽からの植物
体再生に対する有効性を調べた結果を表７に示す。材料
の花茎の腋芽の部分が中央に位置するように５〜７ｃｍ
に切り、表面を殺菌し、ベイシン＆ウェント（Ｖａｃｉ
ｎ＆Ｗｅｎｔ）培地（１９４９）に２％ショ糖とココナ
ットミルク（１５０ｇ／ｌ）を加えたものを基本培地と
し、この基本培地に各例のものを表７記載の添加濃度で
加えた各寒天培地を各々２０個作成し、各培地に切断し
た花茎腋芽の下端を差し込み、２６℃、明条件（２００
０ルックス，１６時間照射）で培養したものであり、表
中の値は、２ヵ月後の植物体形成率（植物体数／植え付
けた花茎腋芽数、但し、培養途中で微生物汚染により中
止したものは除外）を示す。

【００３９】

【表７】

【００４０】また、各例のものについて、カロチノイド
産生ニンジン培養細胞からのカロチノイド産生に対する
有効性を調べた結果を表８に示す。ＭＳ培地にショ糖
（３％）と２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｌ）を加え、ｐＨ５．
７に調整した寒天培地を基本培地とし、この基本培地に
各例のものを表８記載の添加濃度で加えた各培地で、キ
ントキニンジンの根より誘導したカロチノイド産生能を
有する細胞を２５℃、明条件（２０００ルックス，１６
時間照射）で培養したものであり、表中の値は、５０日
後の細胞内蓄積カロチノイド量（培養細胞の生重量を測
定後、細胞を破砕し、少量のアセトンを加えてカロチノ
イドを抽出し、更に３ｍｌの石油エ−テルを加えてカロ
チノイドを移行させ、分光光度計により石油エ−テル層
の４５３ｎｍにおける光吸度を測定し、算出（単位：μ
ｇ／ｇ生産量））を示す。

【００４１】

【表８】

【００４２】また、各例のものについて、ベタシアニン
産生ヨウシュヤマゴボウ培養細胞からのベタシアニン産
生に対する有効性を調べた結果を表９に示す。ＭＳ培地
にショ糖（３％）と２，４−Ｄ（０．１ｍｇ／ｌ）を加
え、ｐＨ５．７に調整した寒天培地を基本培地とし、こ
の基本培地に各例のものを表９記載の添加濃度で加えた
各培地で、ヨウシュヤマゴボウの茎より誘導したベタシ
アニン産生能を有する細胞を２５℃、明条件（２０００
ルックス，１６時間照射）で培養したものであり、表中
の値は、１４日後の細胞内蓄積ベタシアニン量（培養細
胞の生重量を測定後、細胞を破砕し、少量の水を加えて
ベタシアニンを抽出し、遠心分離後、分光光度計により
上澄の５３５ｎｍにおける光吸度を測定し、算出（単
位：μｇ／ｇ生産量））を示す。

【００４３】

【表９】

【００４４】また、各例のものについて、コウライシバ
の生育に対する有効性を調べた結果を表１０に示す。４
月上旬、マグアンプＫ（ジップインダストリ−社製の肥
料）５０ｇを施肥した試験用プランタ−（４５×６０ｃ
ｍ、高さ２５ｃｍ）５７ポットにコウライシバを植え付
け、各例のものを表１０記載の添加濃度で水溶液とした
もの及び比較対象としての水道水だけのものを１回／週
の割合で各ポットに５００ｍｌづつ散布して栽培したも
のであり、表中の値は、６週間後に芝を剥ぎ取り、水洗
し、葉茎部と根部の乾燥重量を測定したもので、比較対
象についての測定値を１００としたときの相対値を示
す。尚、各ポットには、乾燥を補う上で随時水道水も散
布した（後述するものにおいても同様）。

【００４５】

【表１０】

【００４６】また、各例のものについて、ベントグラス
の生育及び光合成活性に対する有効性を調べた結果を表
１１と表１２に示す。コロニアルベントグラスの圃場に
試験区（２平方ｍ）を５７区設け、５月上旬、芝生の葉
茎部を刈り取った後、各例のものを表１１、表１２記載
の添加濃度で水溶液としたもの及び比較対象としての水
道水だけのものを１回／週の割合で各試験区に２ｌづつ
散布して栽培したものであり、表中の値は、５週間後に
地表５ｍｍのところから葉茎部を刈り取り、乾燥重量を
測定したもの（表１１）と、同葉茎部のクロロフィル含
量（８０％アセトン溶液で抽出し、６４５ｎｍ及び６６
３ｎｍの吸光度（Ａ₆₄₅，Ａ₆₆₃）を測定し、総クロロフ
ィル量＝２０．２９Ａ₆₄₅＋８．０５Ａ₆₆₃で算出（単
位：μｇ／ｇ生重量））（表１２）であり、ともに、比
較対象についての測定値を１００としたときの相対値を
示す。

【００４７】

【表１１】

【００４８】

【表１２】

【００４９】また、各例のものについて、コチョウラン
実生苗の生育に対する有効性を調べた結果を表１３に示
す。２号のポリ鉢で栽培したコチョウラン実生苗を３．
５号の素焼鉢に移植し、１ヵ月後から、ハイポネックス
（前述）の２０００倍液に各例のものを表１３記載の添
加濃度で加えたもの及び比較対象としてのハイポネック
スの２０００倍液だけのものを１回／週の割合で各鉢に
２００ｍｌづつ葉面散布及び潅水して生育させたもので
あり、表中の値は、２ヵ月後の苗の重量を測定したもの
で、比較対象についての測定値を１００としたときの相
対値を示す。

【００５０】

【表１３】

【００５１】また、各例のものについて、小麦の発芽後
の生長に対する有効性を調べた結果を表１４に示す。Ｍ
Ｓ培地（但し、糖類除外）に各例のものを表１４記載の
添加濃度で加えたもの及び比較対象としてのＭＳ培地
（但し、糖類除外）だけのものを浸した各シャ−レ内の
バ−ミキュライト上に、一晩吸水させた小麦種子（農林
６１号）を置床し、２０℃、暗条件で発芽させ、発芽後
３日目に蓋を外し明条件（２０００ルックス，１６時間
照射）で生育させたものであり、表中の値は、１２後の
小麦の乾燥重量を測定したもので、比較対象についての
測定値を１００としたときの相対値を示す。

【００５２】

【表１４】

【００５３】また、各例のものについて、キュウリの生
育に対する有効性を調べた結果を表１５に示す。マグア
ンプＫ（前述）３０ｇを元肥とした砂質土壌を詰めた試
験用ポット（直径２５ｃｍ、高さ３０ｃｍ）にキュウリ
苗（東北１号）を１個づつ植え、ハイポネックス（前
述）の１０００倍液に各例のものを表１５記載の添加濃
度で加えたもの及び比較対象としてのハイポネックスの
２０００倍液だけのものを１回／週の割合で各ポットに
３００ｍｌづつ葉面散布及び潅水して生育させたもので
あり、表中の値は、播種５０日後の苗の乾燥重量を測定
したもので、比較対象についての測定値を１００とした
ときの相対値を示す。

【００５４】

【表１５】

【００５５】また、実施例９のものについて、トウキ茎
頂培養から得られた無菌植物体のシュ−ト形成に対する
有効性を調べた結果を表１６に示す。材料は、トウキ
（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｃｕｔｉｌｏｂａ）の茎頂培養
由来の無菌植物体で、１％寒天を添加したＭＳ培地を基
本培地として、継代維持したものである。茎葉部からの
シュ−ト形成は、基本培地にナフタレン酢酸（０．１ｍ
ｇ／ｌ）とカイネチン（３ｍｇ／ｌ）を加えた寒天培地
に各例のものを表１６記載の添加濃度で加え、無菌植物
体茎葉部カミソリで切断した切片を試験管に１個／本移
植したものを各々２５本作成し、２５℃、明条件（２０
００ルックス，１６時間照射）で培養したものであり、
表中の値は、１４日後の発生シュ−ト数を示す。

【００５６】

【表１６】

【００５７】

【発明の効果】上記各表より明らかな通り、リポ多糖を
植物成長調節剤とする本発明の植物成長調節剤によれ
ば、少量の使用でも十分に植物成長調節の効力を発揮す
るものであり、また、リポ多糖の活用範囲を広げ得たも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斎藤 雅子 埼玉県草加市吉町４−１−８ ぺんてる 株式会社 草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２−41−13府中第三住 宅２−304 (72)発明者 梅津 博紀 青森県青森市大字戸山字赤坂447−３ 審査官 星野 紹英 (56)参考文献 特開 平５−49470（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−128731（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−217608（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−295908（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−240008（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−247077（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−13006（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−213708（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−48910（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−91870（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−506780（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01N 63/00

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リポ多糖を植物成長調節物質とする植物
   成長調節剤。