JPH08502416A

JPH08502416A - キラヤ種の培養細胞

Info

Publication number: JPH08502416A
Application number: JP6510909A
Authority: JP
Inventors: ダルスガー，クリスチャン; アンリ，マクス
Original assignee: シード・キャピタル・インベストメント・（エス・シー・アイ）・ベスローテン・フェンノートシャップ
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 1996-03-19
Also published as: CA2147480A1; AU5576794A; WO1994010291A1; AU677977B2; US5716848A

Abstract

(57)【要約】本発明はサポニンのような活性物質のキラヤ(Quillaja)種からの調製のためのキラヤ種培養細胞に関する。細胞はカルス組織培養または浮遊細胞培養のどちらに由来してもよい。好ましいキラヤ種はキラヤ・サポナリヤ・モリナ(Quillajasaponaria Molina)、キラヤ・スメグマデルモス(Quillaja smegmadermos)、キラヤ・ブラジリエンシス(Quillaja brasiliensis)からなる群より選択される種である。本発明はさらにキラヤ種培養細胞から抽出された活性物質に関し、これら活性物質からなる調製物に関し、あるいはその透析不可能または透析可能な画分に関し、該活性物質の調製法およびキラヤ種培養細胞抽出物の透析可能なおよび／または透析不可能な画分からなり、種々の特質を有する種々の薬剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】キラヤ種の培養細胞本発明はキラヤ(Quillaja)種の培養細胞、キラヤ種から活性物質を製造する方法、該活性物質よりなる種々の産物、該活性物質から免疫刺激性複合体(ISCOM) を製造する方法ならびに該ISCOMからなるワクチンおよびアジュバント、アジュバントISCOM−マトリックス（レブグレン，カー(Lovgren,K.)の論文、ＩＳＢＮ９１−５７６−３２０２−２）、アジュバントQuil A（ダルスガード、ケイ(D alsgarrd,K.)、アルク・ゲス・ビルスフォルシュ(Arch.ges.Virusforsch.)４４、２４３−２５４（１９７４））、アジュバントＱＳ２１（ジアーヤンーウィ( Jia-Yan,Wu)、ジャーナル・オブ・イミュノロジー(J.Immunolgy)１４８、１５１９−１５２５（１９９２）、および他のサポニンアジュバントに関する。免疫剌激複合体（いわゆるISCOM）は、コレステロールおよびキラヤ種のサポニンを混合するに際して、自然に形成される負に荷電した五角形十二面体である。その形成の間、蛋白質および他の脂質を取り込むことができる。ISCOMは免疫応答を強力に増強することが見い出されており、従って、例えば、ワクチンにおいて免疫学的アジュバントおよび担体／送達系として用いられる。Quil A、ＱＳ２１、および他のサポニンアジュバントは、種々のワクチンにおいて免疫学的アジュバント活性を有する天然の樹皮に由来する産物である。 ISCOMの生産については、とりわけ、Quil Aについて要求が増大している。Qui l Aは、主としてチリで生育するキラヤ種樹木の樹皮に由来する活性な物質（サポニン）の混合物である。キラヤ種の天然源は限定されている。事実、老木は今日では稀であり、年間約１０００トンの樹皮がチリから輸出されている。種々の目的の活性な物質（サポニン）についての増大する要望のため、物質の貯蔵が将来予測されている。従って、アジュバントとしてのISCOMの調製、および種々の他の適用のため、Q uil Aおよび他の活性物質を単離する他の方法を見つけることが大いに望まれている。今回、キラヤ種植物体の細胞、組織または器官を、液体中で、または固体培地でin vitroにて培養できることが判明した。かくして、本発明は、キラヤ種からの活性物質を調製するための、キラヤ種の培養細胞を提供する。培養細胞は、カルス培養に由来することができ、そこでは、組織または器官は固体培地で増殖させる。「カルス」なる語は、その器官形成能を喪失した細胞の無定形の塊をいい、その塊は植物体片を固体培地上で培養した場合に形成される。かく得られたカルスは、植物体の凝集組織に似た外部形態を示す。また、培養細胞は、浮遊細胞培養に由来するものであってもよい。「浮遊」細胞培養とは、カルス片をさらに接種し、好気性条件下、液体培地で培養した場合に形成される細胞の微細なフロック状分散液をいう。本発明によると、種々の種類のキラヤ植物、例えば、キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)、キラヤ・スメグマデルモス(Quillaja smegm adermos)、キラヤ・ブラジリエンシス(Quillaja brasiliensis)等を、組織または浮遊培養で用いることができる。文献で言及されている組織培養についての通常の培地組成、例えば、ホワイトの培地（ホワイト・ピイ・アール(White P.R.)、グロウス(Growth)７：５３（１９４３））、ヘラーの培地（ヘラー・アール(Heller R.)、テーゼ・セク・ナト・パリス(These Sc.Hat.Paris)（１９５３））、ムラシゲ・アンド・スクーグの培地（ムラシゲ・ティ(Murashige T.)およびスクーグ・エフ(Skoog F.)、フィジオル・プラント(Physiol.Plant.)１５：４７３（１０６２））、リンスマイヤー・アンド・スクーグの培地（リンスマイヤー・イー・エフ(Linsmaier E.M.)およびスクーグ・エフ(Skoog F.)、フィジオル・プラント(Physiol.Plant.)１８、１００（１９６５））、およびガンボルグ、ミラー・アンド・オジマの培地（ガンボルグ・オー・エル(Gamborg O.L.)、ミラー・アール・エイ(Miller R.A.)およびオジマ・ケイ(Ojima K.)、エクスプ・セル・レス(Exp.Cell Res.)５０、１５１（１９６８））と呼ばれる培地を本発明で用いることができる。これらの公知の培地は無機物質と、糖、オーキシン（成長促進物質）、サイトカイニン、ビタミンおよびアミノ酸のごとき、植物用の水培養方法のための培地で従来用いられてきた他の痕跡量の元素よりなる。特に、以下のものがこれらの培地で用いられる：塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第二鉄、ＮＡ₂−ＥＤＴＡ（ＮＡ₂−エチレンジアミン四酢酸）、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、ヨウ化カリウム、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、塩化アルミニウム、塩化コバルト等の無機物質、スクロース、グルコース、フルクトース、マンノース等の糖、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、α−ナフタレン酢酸、インドール−３−酢酸、２−イソペンテニルアデニン等のオーキシン、チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、ニコチン酸、ミオイノシトール、ビオチン糖のビタミン、およびグリシンのごときアミノ酸。表１は組織培養についての通常の培地組成の例を示す。キラヤ種を組織培養するために、本発明によると、キラヤ種植物の植物体、該植物の葉片、茎、根、花、種子または他の器官もしくは組織を洗浄し、表面滅菌し、綿、セルロースまたはプラスチックのキャップを詰めた管またはフラスコ中に含有させ、表１に記載した組成のうちの１つを有する組織培養用滅菌寒天培地上に置き、２５−３０℃でインキュベートした。該切片または器官もしくは組織は膨潤し、白色、黄色がかった白色または緑色がかった黄色のカルスが２−６週間で誘導される。かかるカルスは、同様の固体培地培養を反復することによって、すなわち、種々の固体培地の培養で形成されたカルスの小片を新鮮な固体培地に接種することによって徐々に精製できる。かく形成され、継代培養によって固体培地で精製されたカルスを、次いで、表１に記載した組成のうちの１つを有する液体培地に接種し、浮遊細胞培養を得るために、２５−３０℃の温度で２−３週間振盪器にて培養する。接種物は、例えば、液体培地１００ｍｌに対してカルス約３ｇ（新鮮重量）であり、該カルスはフロック状懸濁液の状態で、すなわち、「キラヤ細胞」として培養液体中で増殖する。これらのキラヤ細胞を、液体培地中で同様の振盪培養を反復することによって、すなわち、キラヤ細胞を含有する培養した前の懸濁液の一部を新鮮な液体培地に接種することによって、さらに継代培養する。スケールアップ後、振盪培養で得られた浮遊培養を、パイレックスまたはステンレス鋼で作成したバイオリアクター中にセットした液体培地に接種し、温和に撹拌しながら、通気する。接種物の量は全培地の量の１／１０であり、キラヤ細胞の細胞膜が破壊されるので、激しい撹拌は不都合である。通気するための空気の量は０．２−３０リットル／培地リットル／分であって、培養期間は２−３週間、すなわち、前記振盪培養と同じである。これらのキラヤ細胞の乾燥重量の収量は浮遊培養で消費された糖の３０−３５パーセントであり、培地１リットル当たり６．９ｇに達する。ISCOMの形成のためのサポニンをそれから単離する活性物質の調製用原料としてキラヤを含有する懸濁液を得るには、寒天培養では２− ３週間、各液体振盪培養および通気液体浮遊培養では２−３週間かかり、合計して６−１２週間かかる。しかしながら、一旦浮遊培養がバイオリアクターでの通気培養で得られたならば、半継続的プロセスを採用することができ、そこでは、培養の一部を採取し、他の部分をバイオリアクターに残し、新鮮な滅菌培地を残りの部分に補なってキラヤ細胞の培養を行う。キラヤ種の培養細胞から調製した活性物質は主としてサポニンである。サポニンは植物に広範囲に分布するグリコシドのタイプである。サポニンは当該分子のアルグコン部位を構成するサポニゲンと、いつくかの糖からなっている。サポニンはこの場合はトリテルペンであり、糖部位はラムノース、フコース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸、および可能性としての他の少量成分糖よりなり得る。さらに、本発明は、ａ）キラヤからの細胞をin vitroで培養し、次いで、ｂ）活性物質よりなる細胞培養抽出物を調製する工程からなることを特徴とするキラヤから活性物質を調製する方法に関する。活性物質からなるキラヤ種細胞培養の抽出物は２つの画分に分離され、１つは透析不可能画分、他の１つは透析可能な画分であることが判明した。本明細書中で用いる「透析可能」なる語は、キラヤ種細胞培養の粗製抽出物をセーラインに約２４時間透析した後に透析袋を通った化合物をいう。本明細書中で用いる「透析不可能」なる語は、キラヤ種細胞培養の粗製抽出物をセーラインに約２４時間透析した後に透析袋に保持される化合物をいう。透析可能なおよび透析不可能な画分の双方が興味深い特質を示す。透析可能な画分はまず水溶液中で泡を誘導することができる。これは、振盪した場合に透析物が容易に泡立つという事実によって示される。さらに、透析可能な画分の活性物質は、「Tween」シリーズの化合物と同様の特性を示す水中油型エマルジョンを生成するための乳化剤として作用できる。例えば、実験は、９ｍｌの透析物および１ｍｌのミネラルまたは生分解性油、例えば、スクアランは、超音波処理によって激しく振盪または処理した場合に、安定なエマルジョンを形成することを示した。透析可能な画分はアンモニアを結合することもできる。従って、キラヤ種の培養細胞から得られた活性物質からの透析可能な画分は、天然の樹皮の抽出物と同様の技術目的で利用できる特性を有する。該技術目的の例は、食品および飲物における、および写真フィルムエマルジョンにおける乳化剤としてのその使用である。また、それらは廃水およびスラリーの処理における添加剤として有用である。何故ならば、透析可能な活性画分は表面の外皮を破壊し、廃水プラント、豚生産用小屋における液体肥料のためのスラリータンク、スラリー容器等においてアンモニアおよび匂いの形成を減少させるからであり、かくして、微生物および／または酵素分解を容易とし、また、産業、家庭、農場および動物の廃棄物の匂いを減少させる。また、それらは、動物飼料に添加して、その糞尿の匂いを減少させ、飼料の利用性を高めることができる。その起泡能力は、ソフトドリンクのごとき飲料における添加剤として、または消化器における泡生成剤としてそれらを有用なものとする。また、それらは、シャンプー等における洗剤として用いることもできる。透析不可能画分および恐らくは透析可能画分のいくつかは、ISCOM形成剤およびアジュバント剤として有用な活性物質を含有する。強力で固有のミセル形成特徴を有するので該物質は透析不可能である。これらのミセルはコレステロールおよび他の脂質とで複合体を形成する能力を有し、ISCOMの形成に導かれる。しかしながら、これらの特性は、保持された物質はＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球細胞）のごとき赤血球細胞に対して溶血性であることも意味する。この溶血特性は細胞抽出物におけるそのアッセイで使用できる。本発明の免疫刺激複合体のマトリックスは、好ましくは、ａ）キラヤ種の培養細胞の抽出物から透析不可能画分を調製し；ｂ）少なくとも１つの脂質および少なくとも１つの洗剤を該透析不可能画分に添加し；ｃ）ISCOMまたはISCOMマトリックスを形成させ、次いで、ｄ）該洗剤を除去する；ことによって調製される。かく調製されたISCOMは免疫アジュバントとして種々のワクチンで使用するのに非常に適している。本発明の培養細胞は、キラヤ種の活性物質を調製するのに、多くの点で有利である。例えば、免疫学的およびISCOM形成物質についての天然源は高度に変化する物質であり、この個々の成分は分離するのが困難である。本発明の培養細胞は活性物質を生産する信頼できる方法である。もう１つの利点は、培養細胞抽出物は、良好な製造原理の下で、有効とできることである。培養細胞生成物は、植物からの天然抽出物中の多くの物、例えば、着色物質は含まない。得られた生成物はかなり均質である。細胞培養、特に浮遊培養は、継代クローンして、天然植物の場合の一群の関連物質よりもむしろ個々の物質を生じる細胞系を確立することができる。その例において、得られた浮遊培養細胞のうちの１つは、それが得られるカルス培養よりもＨＰＬＣでより限定されたサポニンのパターンを生じ、それ自体は天然抽出物よりも既により限定されていることが示されるであろう。活性物質を調製するための培養細胞はスケールアップすると安価となる。何故ならば、植物浮遊細胞培養の発酵は直接的であって、培地は大量では安価だからである。さらに、活性成分は天然植物からの物質よりも精製および有効とするのが容易である。何故ならば、生産および精製を支配するすべてのパラメーターは信頼できる方法でモニターできるからである。以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は断じてそれらに限定されるものではない。実施例１培養細胞の調製表面を最初に水性エタノール７０°Ｂで（１分）、次いで１リットル当たり１滴のティーポル(Teepol)を添加したＮａＯＣｌ２０°Ｃｈで２０分間（正確には１０分間で二回）滅菌したキラヤ・サポナリア・モリナ(Quilaja saponaria M olina)の茎の節間の外植片を、滅菌蒸留水で３回すすぎ、植物細胞培養に通常用いられる固体の修正したムラシゲ(Murashige)とスクーグ(Skoog)の基礎培地（エム・アンド・エス・フィジオロ・プラント(Physiol.Plant.)１９６２、１５、４７３）に植えた。修飾は炭水化物（サッカロースがグルコースにより置換されたもの（同濃度））、Ｋｌ（０．８３のかわりに０．７５ｍｇ／ｍｌ）、ビタミン類（チアミン塩酸塩１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸０．１ｍｇ／ｍｌ、ピリドキシン塩酸塩０．１）（グリシン無し）、ｐＨ５．７に関する。この培地は以前にサポナリア・オフィシナリス(Saponaria officinalis)とギプソフィラ・パニキュラタ( Gypsophilla paniculata)の組織培養で用いられ、成功をおさめたものである。この基礎培地に２種の植物ホルモンを添加した：３種の濃度：１０^-5Ｍ、１０^-6 Ｍまたは１０^-7Ｍにおける２，４Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）またはＩＢＡ（インドール酪酸）より選択される１つのオーキシン；およびカイネチン（Ｋ）またはベンゾルアミノプリン（ＢＡＰまたはＢＡ）から選択される１つのサイトカイニン。次いで５４の培地を調製し、５つの外植片を２５ｃｍの長さで２．５ｃｍの幅（直径）の試験管中の各タイプの培地に植えた。これらの試験管は、２５℃の培養室で、古典的な白色ネオン光の１２時間光周期の下に置いた。３ないし６週間後一次カルスが現れ、同一の新鮮な培地に継代培養した。各培地で得られたカルス培養は１つのオリジナルの細胞系統と考えられる。各細胞系統の継代培養の頻度は細胞の成育速度に応じて、１か月ないし３か月の間で変化させた。３か月後に継代培養しなかった細胞系統（成育速度が遅すぎる）は捨てた。カルス系統の獲得後６か月間（細胞系統をできる限り安定とするのに必要な最短期間）、主な細胞系統のカルスのバイオマスを、サポニンの含有率を見積もるために試験し、成育速度、次いでバイオマス生産を増加させるために、最初の細胞浮遊物を各カルス細胞系統から確立した。ＮＡＡ１０^-5Ｍ／Ｋ１０^-6Ｍと名づけられた浮遊細胞系統の１つは、ＩＳＣＯＭサポニンを生産する細胞系統であることが判明した。これらの細胞系統の獲得のこれらの状態の選択の幾つかは発明者自身の経験の成果である。例えば、日本の科学者たちによって、パナックス・ギンセング(Pan ax ginseng)（クボ(Kubo)ら、ジャーナル・オブ・ナチュラル・プロダクツ(J.Na t.Prod.)１９８０、４３、２７８）を用いる際、およびブプレウルム・ファルカタム(Bupleurum falcatum)（タニ(Tani)ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(J.Chromatogr.)１９８６、３６０、４０７）を用いる際に、ならびにギプソフィラ・パニキュラタ(Gypsophila paniculata)（へンリー(Henry)ら、フィトケミストリー(Phytochemistry)１９９１、３０、１８１９）を用いる際に、サポニンの生合成が研究された植物中の茎の師部に起こることが発明者らによって発見されたので、茎の他の部分（節および葉）の代わりに節間を直接用いる。それゆえ培養中の植物の生合成部分に該化合物のイン・ビトロでの生産を獲得させることが最善だと考えられる。これは明らかなように思われるが、植物細胞はイン・ビトロで全能性があり得ると思われているために多くの当業者がこれに同調しているわけではない。理論上二次化合物を生産する植物の各部位の各細胞が、その生合成特質を保ちながら増殖することができるであろうが、今日まで多くの植物種において可能でなかった、なぜなら植物において細胞の増殖を引き起こす非常に正確な分子生物学的機構がまだ余り理解されていないからである。植物中で細胞培養を与えるために増殖可能な植物中の明確な組織の一つは形成層である可能性がある。他方、形成層は全植物中でおよびイン・ビトロ培養中で師部組織を与える組織であろう。実施例２抽出方法物質のあらゆる可能な破壊を防ぐために、収集後、カルスおよび浮遊細胞培養固体を共に凍結乾燥した。凍結乾燥した固体は使用まで冷凍庫中で−２０℃に保った。抽出物を調製するために、これらの固体の重量を秤量し、１０倍容の水を添加した。この懸濁物を最初に「ウルトラツラックス(Ultraturrax)」でホモゲナイズし、続いて超音波破壊（ＭＳＥ）で、最大力で３×３０分ホモゲナイズした。室温で３０分撹拌後、混合物を５０００ｇで３０分間遠心した。上清を単離し、さらなる分析まで−２０℃で保存した。実施例３ＨＰＴＬＣ細胞系統のカルス抽出物０．４μｌを、デアガ・アプリケーター(Deaga appli cator)を用いてＨＰＴＬＣプレート、メルク(Merck)、キーゼルジェル(Kieselge l) ６０、１０×１０ｃｍにバンドとして付した。プレートはカマグ(Camag)の水平展開チャンバーで、１０ｍｌＨ₂Ｏ＋４０ｍｌメタノール＋４０ｍｌクロロホルムに溶解した２００ｍｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏの溶媒により展開された。中央のチャンバー中の１０ｍｌの溶媒からの蒸気でプレートを３分間にわたって飽和させ、その後プレートをリザーバー中の２ｍｌの溶媒により２５分展開した。プレートを換気フード中で５分間乾燥し、メタノール中濃縮硫酸（１：１）の混合物を噴霧し、オーブン中で１２０℃で１０分間加熱した。分離したバンドは２５６グレイ・スケール・スキャナー(grey scale scanner)とアップル・マッキントッシュ(Apple Macintosh)のソフトウェア、スキャンアナリシス(ScanAna1 ysis)を用いて記録した。ほとんど全てのカルスおよび浮遊培養の抽出物が２つの主たるバンドの存在を示した。これらのバンドは、その移動速度が、南アメリカから輸入したキラヤ種の天然の樹皮の抽出物中に存在する類似のバンドと一致する。天然の化合物に類似して、これらの２つのバンドは透析膜および／または限外濾過膜を、１００００より高いカットオフレベルで通過し、これは、これらがミセルを形成しないことを示唆する。図１はカルス細胞培養の１つの結果を示す（“Ｌｃ”）。“Ａ” は適用の時点を示し、“１”および“２”はＨＰＴＬＣにおける２つの主たるバンドを表し、“Ｆ”は溶媒の先端を表す。セーライン１リットルに対する２４時間の透析の後、透析袋に保持した透析不可能な分画をＨＰＴＬＣに付す。結果を図２に示す。“３”および“４”はＨＰＴＬＣにおける２つの主たるバンドを表す。実施例４溶血アッセイ植物細胞培養抽出物の連続二倍希釈液を０．８５％ＮａＣｌ中で作成する。これらの希釈液の１．５ｍｌに０．５ｍｌの（洗浄し、５１０ｎｍでＯ．Ｄ．値を２８に標準化した）ヒツジ赤血球懸濁液を添加する。１０分のくるくるする混合の後に、試料を２０００×Ｇで５分間遠心する。上清を５１０ｎｍにおいて分光光度的に測定し、この値を溶血の測定として用いる（ヘモグロビン放出）。結果を図４に示す。“ＬＳ”とも呼ばれる陽性の浮遊培養抽出物“Ｌ”は低い生産者である浮遊細胞培養“Ｋ”より、また本明細書中で“Ｍｓ”とも呼ばれる、生産者でない浮遊細胞培養“Ｍ”よりも、実質的に高いヘモグロビン放出を示す。異なる条件で成育させたカルス培養の２１の抽出物（Ａ’からＰ、表２）を同じアッセイで試験し、溶血性物質の異なる含量を示し：各文字においてダッシュ線のより長いものがより高い。表２のカルス培養Ｌが、本明細書中で“ＬＳ”とも呼ばれる浮遊培養Ｌのベースである。表２実施例５ＩＳＣＯＭ形成能力抽出物“ＬＳ”（浮遊細胞培養Ｌ）の１ｍｌをセーライン１リットルに対し２４時間透析する。抽出物の透析不可能な分画に１０μｌの脂肪混合物を添加する（界面活性剤ＭＥＧＡ１０の２０％水性溶液中の各２０ｍｇ／ｍｌの濃度のコレステロールおよびホスファチジルコリン）。混合物を、反応が起こるように最低１時間くるくると回転させる。次いでセーライン１リットルに対し再び透析し、界面活性剤を除く。透析袋の内容物は電子顕微鏡((electron microscope)EM)で、カーボン被覆グリッド上、２％酢酸ウラニルでネガティブ染色してＩＳＣＯＭマトリックス構造を詳しく調べる。図３はＩＳＣＯＭが形成したＥＭ写真を示す。実施例６モルモットにおけるアジュバント・アッセイ抽出物の透析不可能な分画のＨＰＴＬＣプレートのデンシトメトリー分析から、凍結乾燥したカルス培養“Ｌｃ”は溶血／ＩＳＣＯＭマトリックス形成物質を約１％含有すると見積もられた。凍結乾燥した浮遊細胞培養“Ｌｓ”は約０．５％含有した。“Ｌｃ”浮遊細胞培養は“Ｌｃ”カルス培養から生産され、共に溶血性サポニンおよびＩＳＣＯＭ形成性サポニンの実質的量（天然の樹皮とだいたい同程度）を含有したので、これら２つの形の培養の抽出物を免疫学的アジュバント活性につき試験した。これらの物質を生産しない浮遊細胞培養抽出物“Ｍｓ ”は陰性対照として含ませた。天然の樹皮から抽出されたＱｕｉｌＡは、陽性対照として供した。合計３０匹のモルモットを試験した各物質につき使用した。３つの独立した実験をオブアルブミンを抗原として行い、３つの独立した実験を不活性化されたブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）を抗原として行った。５匹のモルモットを各群に含めた。５匹はオブアルブミンまたはＰＰＶについての抗原について全て試験した。群１：セーライン対照群２：＋ＱｕｉｌＡ、５０μｇ、陽性対照群３：＋カルス抽出物“Ｌｃ”、５０μｇ群４：＋懸濁抽出物“Ｌｓ”、５０μｇ群５：＋懸濁抽出物“Ｍｓ”、５０μｇ、陰性対照結果を図５に示す。“Ｌｃ”および“Ｌｓ”の双方の抽出物はカルスまたは浮遊植物細胞培養のどちらの由来であるかにかかわらず、透析後モルモットにおいて天然植物からのＱｕｉｌＡと同じアジュバント活性を有した。溶血サポニンに対し陰性の抽出物“Ｍｃ”はアジュバント活性に対しても陰性であった。本発明はキラヤ種の培養細胞と、それから活性物質を調製する方法を提供し、活性物質はＩＳＣＯＭ形成、乳化剤、界面活性剤、起泡剤のごとき種々の目的に用いることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．キラヤ種からの活性物質の調製のためのキラヤ種の培養細胞。２．該活性物質がサポニンであることを特徴とする、請求項１記載の培養細胞。３．該細胞がカルス組織由来であることを特徴とする、請求項１または２記載の培養細胞。４．細胞が浮遊細胞培養由来であることを特徴とする、請求項１または２記載の培養細胞。５．キラヤ種が、キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina) 、キラヤ・スメグマデルモス(Quillaja smegmadermos)、キラヤ・ブラジリエンシス(Quillaja brａsiliensis)からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の培養細胞。６．キラヤ種の培養細胞から抽出された活性物質。７．キラヤ種の培養細胞から抽出された活性物質からなる調製物。８．該調製物がキラヤ種の活性物質の透析不可能な画分からなる調製物であることを特徴とする請求項７記載の調製物。９．該調製物がキラヤ種の活性物質の透析可能な画分からなる調製物であることを特徴とする請求項７記載の調製物。１０．ａ）イン・ビトロでのキラヤ種由来の細胞を培養し；次いで、ｂ）活性物質からなる培養細胞抽出物を調製する工程からなることを特徴とするキラヤ種由来の活性物質の調製方法。１１．該細胞抽出物を、透析可能なおよび透析不可能な画分を獲得するために透析することを特徴とする請求項１０記載の方法。１２．キラヤ種培養細胞抽出物の透析可能なおよび／または透析不可能な画分からなる起泡剤。１３．キラヤ種培養細胞抽出物の透析可能なおよび／または透析不可能に画分からなる乳化剤。１４．キラヤ種培養細胞抽出物の透析可能なおよび／または透析不可能に画分からなるアンモニア結合剤。１５．ａ）キラヤ種培養細胞抽出物の透析不可能なおよび／または透析可能な画分を調製し；ｂ）該透析不可能な画分に少なくとも１種の脂肪および少なくとも１種の界面活性剤を添加し；ｃ）ＩＳＣＯＭのまたは免疫刺激複合体マトリックス(Immune-Stimulat ing C0Mp1exes-matrix)を形成させ；ｄ）界面活性剤を除去する工程からなることを特徴とする、免疫刺激複合体(Immune-Stimulating COMp1exes(ISCOM'S))または免疫剌激複合体マトリックス(Immune-Stimulating C0Mp1exes-matrix)の調製方法。１６．請求項１５に記載される方法により調製される免疫剌激複合体。１７．請求項１５に記載される方法により調製される免疫刺激複合体マトリックス。１８．請求項１５に記載される方法により調製される免疫刺激複合体からなる免疫アジュバント。１９．請求項１５記載の方法により調製される免疫刺激複合体マトリックスからなる免疫アジュバント。２０．キラヤ種培養細胞抽出物の透析可能なおよび／または透析不可能な画分からなる免疫アジュバント。