KR100263950B1

KR100263950B1 - 시호의 배양방법

Info

Publication number: KR100263950B1
Application number: KR1019920012725A
Authority: KR
Inventors: 겐 구사카리; 미네유키 요코야마; 미쓰오 야나기
Original assignee: 겜마 아키라; 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 2000-08-16
Also published as: EP0524110A3; KR930001774A; TW211586B; JP2959878B2; DE69227156D1; US5294550A; DE69227156T2; ES2123544T3; EP0524110A2; EP0524110B1; JPH0523069A

Abstract

본 발명은 시호(Mishima-saiko) 뿌리의 증진된 기관 배양 방법을 제공한다. 시호 뿌리의 배양에 있어서, 부정근이 뻗어나갈 때까지 삭카라이드 농도를 2%미만으로 조절하며 임의로는 추가의 삭카라이드를 가하여 배양을 수행함으로써 사이코-사포닌의 생산성을 향상시킬 수 있다.

Description

시호의 배양방법

본 발명은 부플레우룸(Bupleurum)속에 속하는 식물체인 시호(柴胡 ; Mishima-saiko)의 조직을, 외식체(explant)로서 이의 뿌리를 사용하여 배양시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 배양 기간 동안 배지내의 탄수화물의 농도를 조절하면서 상기 조직을 배양시키는 개선된 방법에 관한 것이다.

본초약물용 사포닌-함유 식물체의 조직 배양은 본초약물 자원의 적합한 공급원을 제공한다는 측면에서 관심을 끌어 왔다. 이들중에서, 인삼은 값이 매우 비싸기 때문에 인삼, 파낙스 진생 니스(Panax Schinseng Nees)의 뿌리 또는 이의 부정근이나 잔뿌리에서 기원한 유합 조직을 배양함으로써 사포닌을 효과적으로 생성시키고자 하는 광범위한 시도가 이루어져 왔다.

사이코(saiko)(시호의 뿌리)는 각종의 중국 약제로 제형화된 본초약물이며 이는 게닌(genin)으로서 트리테르페노이드로 이루어진 사이코-사포닌 (a) 내지 (d)를 이의 성분으로서 함유하는 것으로 알려져 있다. 전술한 바와 같이, 본초약물 자원의 적합한 공급원이라는 관점에서 보아 시호의 조직을 배양시키려는 시도 또한 계속되어 왔다. 조직 배양에 의한 유용한 물질의 생성에 있어서 , 이들 유용한 물질의 함량은 일반적으로 호르몬 조절 등에 의해 증가되나, 시호의 경우에는 유합조직 배양에 의해 사이코-사포닌을 생성하기가 어렵다[참조: Syoyaku Gaku Zasshi (Society of Galenicals) 28 (2) pp 152-160, 1974].

반면, 시호의 배양된 뿌리를 사용하여 사이코-사포닌을 생성시키려는 시도 또한 이루어졌다. 이러한 경우에 있어서, 사포닌의 생성은 질소 공급원으로서 암모늄 이온에 대한 질산 이온의 비율을 변화시킴으로써 증진된다[참조: Nippon Nogeikagaku Zasshi (Agriculture Society of Japan) , 63, 35, page 496, March, 1989].

그러나, 사포닌 생성에 있어서 배지 성분중 가장 필수적인 성분인 탄수화물의 영향에 대한 연구는 없었다.

따라서, 본 발명의 목적은 외식체로서 시호의 뿌리를 사용하여 사이코-사포닌이 효과적으로 생성되도록 하는 조직 배양 방법을 제공하는 것이다.

외식체로서 시호의 뿌리를 사용하는 배양 방법에 있어서의 배양 조건(예: 각종 호르몬의 영향)을 연구 조사하는 과정에서, 본 발명자들은 예기치 않게도 배지에 첨가될 탄수화물의 농도를 배양 기간에 따라 조절하는 경우 사이코-사포번의 생산성에 상당한 영향을 미친다는 사실을 밝혀내고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따르면, 상기 목적은 배지속에서 측근들이 완전히 뻗어나가는 특정 배양 기간에 걸쳐, 배지내의 탄수화물 성분의 농도를 총 배지당 2중량% 미만이 되도록 조절함을 포함하는, 외식체로서 부플레우룸속에 속하는 식물체인 시호의 뿌리를 사용하여, 이 시호의 조직을 배양시키는 방법에 의해 성취된다.

본 발명에 따르면, 시호 뿌리의 배양에 의한 사이코-사포닌의 생성에 있어서의 증진된 방법은 탄수화물의 농도를 초기 배양의 특정 배양 기간 동안 특정 농도 미만의 농도로 조절함으로써 제공된다. 특히, 측근이 완전히 뻗어 나갈때까지 탄수화물의 농도를 총 배지당 2중량% 미만으로 조절하고 적절한 양의 탄수화물을 배지에 가하면 사이코-사포닌 생산성이 향상될 수 있다.

본 발명에 사용되는 “시호”는 부플레우룸속에 속하는 식물체이며, 부플레우룸 팔카튬(B. falcatum) L, 부플레우룸 차이니즈(B. Chinese) DC, 부플레우룸 코마로비아눔 린쯔(B. komarovianum Lincz) 및 부플레우룸 스코르조네라에폴리움(B. scorzoneraefolium) 야생종이 바람직한 것으로서 언급될 수 있다. 특히, 부플레우룸 팔카튬 L이 바람직하다. 배양시, 뿌리는 외식체로서 사용한다. 이러한 뿌리로서 사용할 수 있는 뿌리는 유합조직으로부터 재생된 뿌리, 식물체로부터 회수된 뿌리 및 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rthizogenes)의 감염에 의해 유도된 잔뿌리와 같은 뿌리일 수 있다. 이들중에서, 유합조직에서 기원하여 생성된 뿌리가 바람직하게 사용된다. 이렇게 하여 생성된 뿌리는 필요한 경우 통상의 방법으로 살균한 후 본 발명에 따른 배양에 사용한다.

사용될 수 있는 배지는 조직의 배양에 의해 유용한 물질을 생성시키기에 적합하며 대량의 필수 성분과 극소량의 필수 성분뿐만 아니라 물, 무기염, 탄수화물, 및, 필요한 경우, 오옥신[예: 인돌-3-아세트산(IAA), 인돌-3-부티르산(IBA) 등] 및 사이토키닌과 같은 성장 조절제로 이루어진 배지이다.

더욱 상세하게는, 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog) 배지, 린즈메이어-스쿡(Linsmeier-Skoog) 배지, 화이트(White) 배지, 갬보르그(Gamborg) 배지(B5 배지), 닛치(Nitsch) 배지, 헬러(Heller) 배지 및 이러한 변형 배지에 따른 기본 조성과 탄수화물의 함량이 규정된 양으로 제한된 변형 배지를 언급할 수 있다. 이러한 배지에 있어서, 탄수화물 공급원으로서는 일반적으로 슈크로즈가 사용되며 또 다른 탄수화물 공급원으로서는 글루코즈 또는 프럭토즈가 사용될 수 있으며, 이의 농도는 총 배지당 2 내지 3중량%이다. 본 발명의 경우, 배지 성분으로서의 탄수화물의 농도는 측근이 완전히 뻗어나갈 때까지의 배양 기간 동안 총 배지당 2중량% 미만으로 조절된다. 조절 방법으로서 총 배지당 탄수화물의 농도가 2중량% 미만이 되도록 배양 초기에 탄수화물을 한꺼번에 가하는 것이 간단하고 편리하나, 총 배지당 탄수화물의 농도가 2% 미만이 되도록 조절하면서 탄수화물을 수회에 걸쳐 가할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 문구 “시호의 뿌리가 완전히 뻗어나감”은 추가의 배양에 의해 측근의 수가 실제적으로 더 이상 증가 되지 않는 상태를 의미한다. 결과적으로, 본 발명에 따른 사이코-사포닌의 생성시, 전술한 측근이 완전히 뻗어나간 후 (즉 측근이 성장하는 단계 및 그 이후의 단계)에는 배지내의 탄수화물의 농도를 총 배지당 2중량% 미만으로 조절하지 않을 수 있다. 본 발명자들은 고 수율의 사이코-사포닌이 상기 기간 후의 탄수화물의 농도가 총 배지당 2중량%를 초과하도록 탄수화물, 특히 슈크로즈를 정기적으로 또는 연속적으로 가함으로써 수득될 수 있다는 사실을 확인했다. 슈크로즈 대신에 글루코즈 또는 프럭토즈를 사용하는 경우에도 유사한 결과가 수득된다. 슈크로즈를 첨가하는 것외에도, 배지 전체를 새로운 배지로 교환시킴으로써 탄수화물의 농도를 조절할 수 있다.

전술한 배양은 광선의 조사하에, 암실에서 또는 명암이 교대로 교체되는 조건하에서 20 내지 30℃의 온도로 액체 배지 또는 한천 고체 배지를 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 배양 방법에 따라서, 시호의 측근이 완전히 뻗어나갈때 까지의 기간 동안 탄수화물의 농도를 일정한 농도로 조절함으로써, 생성될 사이코-사포닌의 절대량을 증가시킬 수 있다. 용어 “절대량을 증가시킬 수 있다”는 배양후 사이코-사포닌의 함량에 의해 배양된 뿌리의 건조 중량의 수득량을 증가시킬 수 있다”를 의미한다.

본 발명에 따른 효과는 저급 알콜(예: 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 n-부탄올), 이의 수-함유 알콜 또는 알칼리가 가해진 추출 용매를 사용하여 배양된 뿌리로부터 추출한 사이코-사포닌을 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정량적으로 측정함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에 따르면, 시호의 측근은, 예를 들어 농도를 총 배지당 1중량%로 제한하는 경우(통상의 방법은 B5 배지를 사용하며 초기 슈크로즈 농도를 총 배지당 2 내지 4중량%로 조절한다) 약 2주내에 완전히 뻗어나간다. 뿌리 자체의 건조 중량은 상기 두가지 경우에 있어서 차이가 없는 것으로 나타나나, 건조 중량당 사이코-사포닌의 함량은 상당히 증가한다. 저 농도의 탄수화물의 장점에 관해서, 본 발명은 또한 배양을 추가로 계속 하는 경우 최종 생성량 측면에서 보아 배양에 의한 고유 사이코-사포닌 생성에 대해 양호한 결과를 제공한다. 배양을 계속하는 경우, 초기 배양과는 반대로, 배양을 계속하면서 동시에 배지에 추가의 탄수화물을 가하는 것이 유리할 수 있으며 이에 의해 더 높은 탄수화물 농도(예: 약 3 내지 6%)가 수득된다는 사실이 밝혀졌다. 예를 들면, 탄수화물 총 농도가 4%인 배지를 사용하는 시호 뿌리의 배양에 있어 탄수화물 총량을 초기 단계에서 가하고 총 6주 동안 배양을 수행하는 경우의 배양과, 탄수화물 농도를 측근이 완전히 뻗어나갈때 까지의 배양 기간 동안에는 배지당 약 1중량%로 조절하며 나머지 탄수화물을 측근이 이미 뻗어나간 단계(배양 개시 2주후)에서 가하고 배양을 동일한 기간 동안 계속하는 경우를 비교한다. 상기 배양 방법의 비교에 따르면, 비록 배양된 뿌리의 건조 중량에 대해서는 두 경우에 있어서 실제적인 차이가 없는 것으로 관측될 수 있으나, 후자의 경우에 있어서의 사이코-사포닌의 함량은 전자의 경우의 사이코-사포닌 함량의 2배에 달한다. 후자의 방법을 수행하는 경우, 나머지 탄수화물을 소량으로 수회에 걸쳐 가한다면 양호한 결과가 수득될 수 있다.

[실시예]

하기 실시예는 본 발명을 예증하기 위함이지, 이를 제한하려 함은 아니다.

[실시예 1]

부플레우룸 팔카튬 L.의 종자를 70% 알콜중에 30초간 침지시킨 후 차아염화나트륨 중에 30분간 침지시킴으로써 살균한다. 종자를 멸균수로 세척한 후, 1% 한천으로 고정시킨 린즈메이어-스쿡 배지(LS 배지)속에서 발아시킨다. 이렇게 살균 생장시킨 식물체의 뿌리를 절단하여 0.1mg/ℓ의 IBA를 함유하는 LS 고체 배지상에서 배양시킨다. 그 결과, 유합조직의 증식이 관측되며 부정근의 분화가 생성된 유합조직으로부터 관찰된다. 부정근을 절단하고 3mg/ℓ의 IBA를 함유하는 B5 액체 배지중에 넣고 암실내에서 매달 110rpm으로 아배양한다. 아배양 후 약 3주된 뿌리 1g(건조시키지 않은 중량)을 예를 들어 하기와 같이 멸균시킨 B5 변형 배지 200ml로 충전된 500ml 들이 원추형 플라스크내에 이식한다.

[B5 변형 배지 mg/ℓ]

KNO₃2500

(NH₄)₂SO₄134

NaH₂PO₄·H₂O 150

CaCl₂·2H₂O 150

MgSO₄·7H₂O 250

FeSO₄·7H₂O 27.8

Na₂EDTA 37.3

MnSO₄·H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 2.0

H₃BO₃3.0

CuSO₄·5H₂O 0.025

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25

KI 0.75

CoCl₂·6H₂O 0.025

마이오-이노시톨 100

티아민·HCl 10

피리독신·HCl 1

니코틴산 1

IBA 8

슈크로즈 하기와 같은 함량

각 배지의 슈크로즈 농도를 1, 2 또는 4%로 조절하며, 100rpm에서 진탕시키면서 암실에서 2 내지 6주동안 23℃에서 배양한다. 각각의 배양 기간에서 회수한 샘플을 동결 건조시킨 후, 5% KOH를 함유하는 75% 메탄올 3ml를 사용하여 건조 중량 100mg으로부터 2회 추출한다. 추출물을 회전 증발기를 사용하여 건조해지도록 농축시킨 후 특정량의 75%의 알콜중에 용해시키고, 사이코-사포닌 (a) 내지 (d)를 정량적으로 측정한다[캡셀 파크(CAPCELL PAK) C₁₈; 아세토니트릴/물=40/60 UV 210nm, 1ml/분].

각각의 건조 뿌리에 대한 사이코-사포닌 [(a) + (d)]의 함량(%), 배지 1ℓ 당 건조 중량(g) 및 사이코-사포닌[(a) + (d), mg/ℓ ]의 생산성은 하기 표 1과 같다.

[표 1]

상기 결과에 의하면, 배양 2 내지 3주의 사포닌 생성량은 슈크로즈 농도가 1%일때 최대이다(또한, 3주후의 배양의 경우 사포닌 생성량은 탄수화물 공급원의 결핍으로 인해 다른 경우에 비해 훨씬 작다).

[실시예 2]

초기 슈크로즈 농도를 0.5, 1, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0%로 제한하고 가해지는 탄수화물의 총량이 4%가 되도록 나머지 탄수화물을 가하여(50% 슈크로즈 수용액, 살균된 필터), 시호를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 배양한다. 배지 1ℓ당 사이코-사포닌[(a) + (d)]의 생산성, 즉 [=배지 1ℓ당 건조 뿌리 X 건조 중량(g)]에 대한 사이코-사포닌[(a) + (d)]의 함량(%)은 하기 표 2와 같다.

[표 2]

이들 결과로부터 높은 사포닌 생산성은 초기 슈크로즈 농도가 총 배지당 2중량% 미만이 되도록 조절하는 경우 수득될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3]

시호의 뿌리를 실시예 1에서와 같이 배양하되, 단 슈크로즈 농도를 배양 초기에 총 배지당 4, 5, 6, 7, 8 또는 9중량%로 조절하거나 또는 총 배지당 1중량%의 초기 슈크로즈 농도에서 2주동안 배양시킨 직후에 총 배지당 3, 4, 5 또는 6중량%에 상응하는 양의 슈크로즈를 가한다. 사이코-사포닌 (a) 및 (d)의 합의 생산성은 하기 표 3과 같다.

[표 3]

전술한 바와 같이, 측근이 유도된 후 슈크로즈 농도가 상당히 높은 농도로 조절되는 경우에서도 사포닌 생산성은 역영향 없이 향상될 수 있다.

주의: 실시예 3의 방법을 반복하되, 단 슈크로즈 대신에 글루코즈 및 슈크로즈와 글루코즈의 혼합물을 사용하여 실시예 3과 동일한 결과를 수득한다.

[실시예 4]

실시예 1의 배양 방법을 6주 동안 반복하되, 단 총 배지당 1중량%로 조절되는 초기 슈크로즈 농도로 2주동안 배양시킨 후 5일 간격으로 3회에 걸쳐 총 배지당 1중량%에 상응하는 양의 슈크로즈를 가한다. 비교 목적을 위해, 총 배지당 4중량%로 조절되는 초기 슈크로즈 농도에서 6주동안 유사하게 배양시킨다.

전자(실시예) 305mg/ℓ

후자(비교 실시예) 162mg/ℓ

이들 결과로부터, 시호 뿌리의 배양에 의한 사이코-사포닌 생성에 있어서, 측근이 뻗어나갈때까지 배지내의 사카라이드 농도를 특정 농도 미만으로 조절한 후, 추가의 사카라이드를 여러번 소량으로 가할 수도 있다는 사실이 입증된다.

Claims

외식체(explant)로서 부플레우룸 팔카튬(Bupleurum falcatum) L.에 속하는 식물체인 시호(Mishima-saiko)의 뿌리를 사용하여 배지속에서 측근이 완전히 뻗어나가는 배양 기간에 걸쳐 배지내의 탄수화물 성분의 농도가 총 배지당 2 중량% 미만이 되도록 조절함을 특징으로 하여, 시호의 조직을 배양함으로써 사포닌을 생성시키는 방법.
제1항에 있어서, 탄수화물이 슈크로즈, 글루코즈 또는 이들의 혼합물인 방법.
제1항에 있어서, 제1항에 따른 배양후, 추가의 배양이 탄수화물 성분의 농도가 총 배지당 2 내지 9중량%로 조절되는 배지내에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 제1항에 따른 배양이 약 2주동안 수행되고, 추가의 배양이 슈크로즈, 글루코즈 또는 이들의 혼합물의 농도가 총 배지당 3 내지 6 중량%인 배지내에서 수행되는 방법.
제2항에 있어서, 제1항에 따른 배양후, 추가의 배양이 탄수화물 성분의 농도가 총 배지당 2 내지 9중량%로 조절되는 배지내에서 수행되는 방법.
제2항에 있어서, 제1항에 따른 배양이 약 2주 동안 수행되고, 추가의 배양이 슈크로즈, 글루코즈 또는 이들의 혼합물의 농도가 총 배지당 3내지 6 중량%인 배지내에서 수행되는 방법.
제3항에 있어서, 제1항에 따른 배양이 약 2주 동안 수행되고, 추가의 배양이 슈크로즈, 글루코즈 또는 이들의 혼합물의 농도가 총 배지당 3 내지 6중량%인 배지내에서 수행되는 방법.
제5항에 있어서, 제1항에 따른 배양이 약 2주 동안 수행되고, 추가의 배양이 슈크로즈, 글루코즈 또는 이들의 혼합물의 농도가 총 배지당 3 내지 6중량%인 배지내에서 수행되는 방법.