JPH03232484A

JPH03232484A - ブプレウルム属植物のプロトプラスト調製法およびプロトプラスト培養法ならびに再生法

Info

Publication number: JPH03232484A
Application number: JP2026384A
Authority: JP
Inventors: Wataru Kawasaki; 渉川崎; Jinichiro Kojima; 小島　甚一郎; Osamu Kimura; 修木村
Original assignee: MOMOYA KK
Current assignee: MOMOYA KK
Priority date: 1990-02-06
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1991-10-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕〈産業上の利用分野〉本発明は、医薬品として台用なサポニン類を生産するブ
プレウルム属植物のプロトプラスト培養系技術、具体的
には細胞融合あるいはエレクトロポレーションなどによ
る遺伝的改良の際に必要となるプロトプラストの調製法
および培養法、ならびにプロトプラストからの植物体へ
の再生法に関するものである。

〈従来の技術〉バイオテクノロジーの進歩により、新しい植物を作る技
術に関しても新たな育種法として、（１）染色体数を増
減させて形質に変異を起こさせる方法、（２）化学物質
、放射線などにより突然変異を起こさせるノブ法、（３
）遺伝子組み換え技術により異種遺伝子を導入する方法
、（４）細胞融合やエレクトロポレーションにより異種
の核や細胞質遺伝子を付与して新しい形質を獲得させる
方法、が開発されている。これらの力ｌ去のうち（２）
〜（４）においては、プロトプラストからの植物再生が
重要であり、特に、細胞から細胞壁を除去したプロトプ
ラストを細胞融合やエレクトロポレーションによって形
質転換したものから植物体を再生する（４）については
必須である。しかしながらブプレウルム属植物のプロト
プラストからの再生については、報告されていない。

セリ科ブプレウルム属植物のミシマサイコ、コホクサイ
コ、タイゲキサイコ、ダフリャサイコ、トウサイコ、ハ
クサンサイコ、ホッパミシマサイコ、ホタルサイコ、マ
ンシュウミシマサイコなどについて、プロトプラストお
よび細胞融合物、あるいはエレクトロポレーションした
ものから植物体を両生する方法か、十分に確立されてお
らず、従来の再生法をそのまま転用したのでは、再生せ
ず実用化されていなかった。

〔発明の概要〕

〈発明が解決しようとする課題〉本発明は、上記の背景に基づきなされたものであり、そ
の目的とするところは、セリ科ブプレウルム属植物のプ
ロトプラストおよびその細胞縁き物、あるいはエレクト
ロポレーションしたものから植物体を効率よく再生させ
るための方法が十分に確立することである。

く課題を解決するための手段〉本発明者らは、セリ手１ブブレウルム属植物のプロトプ
ラストから植物体を再生させる方法について種々の研究
をして、簡便な手法で、増殖活性の高いカルスを選別し
、かつ最適のプロトプラスト調製法を検索し、さらに最
適の培養条件の検索をすれば、この発明の目的達成に白
゛効であることを、見い出し、この知見をもとに本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明によるブプレウルム属植物のプロトプ
ラスト２Ｗ　ｌ去は、ブプレウルム属植物から誘導され
るカルスから増殖活性の高い細胞を選別し、二〇カルス
細胞を滅菌水て処理した後、培地用無機成分を含むプロ
トプラスト２Ｊ製用酵素液で処理すること、を特徴とす
るものである。

また、本発明によるブブレウルム植物のプロトプラスト
培養法は、上記の調製法によって得られるプロトプラス
トを、少なくともＩＰ！の植物生長調節物質と、糖類か
ら選ばれる少なくとも１種の浸透圧調節剤と、を含み且
つ無機成分の含量を低ｌａ度としたプロトプラスト培養
用の培地で培養すること、を特徴とするものである。

さらに、本発明によるブプレウルム属植物の再生法は、
上シ己の培養法によって得られる培養物（再生細胞塊な
いしはコロニー）を、植物ホルモンを含む固体培地上で
培養して植物体を得ること、を特徴とするものである。

〈効　果）本発明によれば、細胞増殖活性の高いプロトプラストを
得ることかでき、また、プロトプラストを効率よく増殖
させて再生細胞塊を形成することかできる。

従ってブプレウルム属植物のプロトプラストを用いるこ
とによって安定した高頻度の確率で植物体を再生させる
ことができる。

〔発明の詳細な説明〕

以下は、本発明をより詳細に説明するものである。

くブプレウルム属〉本発明が対象とする植物は、セリ科ブブレウルム属（Ｂ
ｕｐｌｅｕｒｕｍ）であり、この代表的な具体例として
Ｎミシマサイコ（１３ｕｐｌｅｕｒｕｎ＋　ｆ’ａｌｃ
ａｔｕｍ）　、ホタルサイコ（Ｂ、　Ｉｏｎｇｉｒａｄ
ｆａｔｕｌＩ＋）、／＼クサンサイコＣＢ、ｎｉｐｐｏ
ｎｊｃｕｍ）　、ホッパミシマサイコ（Ｂ、ｓｃｏ−ｒ
ｚｏｎｃｒａｅｆｏｌｉｕｍ）　、ダフリャサイコ（Ｂ
、ｄａｌ〕ｕｒｉｃ−ｕｎ）　、７ンシユウミシマサイ
コ（Ｂ、ｃｈｉｎｃｎｓｃ）　Ｓタイケキサイコ（Ｂ、
ｃｕｐｈｏｒｂｉｏｉｄｃｓ）、トウサイコ（Ｂ、ｊｃ
ｈｏｌｃｎｓｃ）、コホクサイコ（Ｂ、ｍｉｃｒｏｃｃ
ｐｈａｌ−ｕｍ）なとかある。

植物の用いる部位としては、葉肉組織をはじめとする植
物体の一部、茎、根などから誘導された培養細胞、特に
、組織台などからカルス化された細胞塊（カルス）かあ
る。

くプロトプラストＡ′！Ａ法〉プロトプラストの由来となるカルスは、好ましくは、無
菌的に調製したブプレウルム属植物の組織片を２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸、インドール酢酸、インドール
醋酸、α−ナフタレン酢酸から選ばれる少なくとも１つ
の植物成長調節物質、または２．４−ジクロロフェノキ
ン酢酸、インドール酢酸、インドール醋酸、α−ナフタ
レン酢酸から選ばれる少なくとも１つの植物成長調節物
質、およびカイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン、
ヘンシルアデニン、イソペンテニルアデニンから選ばれ
る少なくとも１つの植物調節物質、を含む８種既知培地
、たとえばリンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓｍａ＋
ｅｒ−８ｋｏｏｇ）培地、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒ
ａｓｈｉｇｃ−３ｋｏｏｇ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔ
ｅ）培地など、て培養することにより得られるものであ
る。

このようなカルス細胞のうち、増殖活性の高いもの、具
体的には、好ましくは黄色がより濃く培養２週間で２倍
量程度になるようなもの、を選別してたとえば培養温度
１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５°Ｃて継代増殖さ
せ、継代後適当な期間、好ましくは５〜１４０程度後の
カルス細胞を滅菌水中に懸濁して放置する。放置時間は
たとえば温度１５〜３０℃程度で０．５〜２時間程度、
好ましくは温度２０〜２５℃程度で３０〜６０分程度で
程度。

滅菌水で処理後、上記カルス細胞を培地用無機成分を含
むプロトプラスト調製用酵素液を用いてたとえば温度１
５〜３０℃程度で１６〜４８時間、好ましくは２０〜２
５℃で１６〜２４時間程度処理する。培地用無機成分は
各種既知培地、たとえばリンスマイヤー・スクーグ培地
、ムラシゲ・スクーグ培地、シエンク・ヒルデブランド
培地などに用いられているもので、具体的にはＫＮＯ３
、ＫＨＰＯＣａＣｌ２”２Ｈ２０，２４ゝＭｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ，などである。無機成分の濃度は
、上記培地中に含まれている濃度と同程度かそれ以下、
好ましくは基本培地の１／２程度のものを用いる。

酵素液は、プロトプラスト調製用酵素、たとえばセルラ
ー七（たとえばセルラーゼオノズカＲ３゜セルラーセオ
ノズカＲ−１０）、ペクトリアーゼ（たとえばペクトリ
アーゼＹ−２０）　、ドリセラセ、あるいはマセロザイ
ムＲ−１０など、通常これらの２種以上を適当に組合せ
たもの、を含み、通常は史にｄ適圧剤、たとえばマンニ
トール、ソルビトール、グルコース等の少なくとも１種
を含んだものを用いる。

細胞を、酵素処理後、塩化カルシウムを１ｍＭ〜２０　
ｍ　Ｍ−、好ましくは２．５ｍＭ　〜１０ｍＭの濃度で
含み、浸透圧調節剤としてマンニトール、ソルビトール
、グルコースなどの１種以上を含む洗浄液で好ましくは
３同以上洗浄する。

くプロトプラストの培養法〉上み己のような方ｌ去により得られるプロトプラストを
、培養培地に細胞密度がたとえばＩ　Ｘ　１０４〜１×
１０　程度、好ましくは５×１０５程度となるように包
埋し、好ましくは暗所で、培養温度が２０〜３０℃程度
、好ましくは２４〜２６℃程度で、好ましくは２〜３ケ
月程度培養する。

培養培地は、δ種既知合成培地を基本として、− ＮＨ＋、ＰＯ４ａ度などの無機成分の濃度を適宜減少さ
せ、これに炭素源および浸透圧調節剤として糖類、植物
成長調節物質を加える。通常さらにビタミン類（たとえ
ば、ビタミンＢ１、Ｂ６、ニコチン酸なと）および天然
物（たとえばカゼイン加水分解物なと）を添加し、ゲル
化剤としてアガロース、ジェランガム等を加えた固体培
地を用いる。

無機成分は、窒素成分（ＮＨ４＋など）および一リン成分（ＰＯ４など）については好ましくは０．１３
ｍＭ　〜１．３０ｍＭ程度、より好ましくはリン成分は
０．１３ｍＭ　〜０．６ｍＭ程度、窒素成分は０．１３
ｍＭ〜１．３０ｍＭ程度であり、それ以外については基
本培地の１〜１／４程度、より好ましくは１／２程度で
ある。

代表的な合成培地としては、ムラシゲ・スクーグ培地、
リンスマイヤー・スクーグ培地、ホワイト培地、ニッチ
（’ｌ　ｉ　ｔ−５ｃｈ）培地、エッチ・エッチ（Ｎｉ
ｔｓｃｈ−Ｎｉｔｓｃｈ）培地、ヘラ−（Ｈｃｌｌｃｒ
）　Ｍ地、シェレクφヒルデブランド（Ｓｃｈｃｎｋ−
１１ｉ　１ｄｅｂｒａｎｄｔ）培地等か挙げられ、これ
らの成分を上記のように変更したものを培養に用いる。

糖類の具体例としては、グルコース、ソルビトール、マ
ンニトール、シュークロースなとか挙げられるが、より
好ましくは、グルコースを用いる。

植物成長２１節物質としては、２，４−ジクロロフエノ
キシ酢酸、インドール酢酸、インドール醋酸、α−ナフ
タレン酢酸等のオーキシン類から選ばれたものが特にｌ
’ｆましいか、必要に応してカイネチ〉、ゼアチン、ジ
ヒドロセアチン、ヘンシルアデニン、イソペンテニルア
デニン等のサイトカイニン類を組合せて用いることも可
能である。オーキシン類とサイトカイニン類を組合せて
用いる場合は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸とヘン
シルアデニンとの組み合せか好ましい。オーキシン類を
用いる場ｌ）は総はとして好ましくは０．５〜５μＮ１
、より好ましくは０．５〜２μＭの濃度で用いられる。

必要に応して組合せで用いられるサイトカイニン類は、
総；とじてたとえば０〜５μＭ１より９丁ましくは０〜
１μＭ１の７農度で用いられる。

く植物体の再生〉上記の培養法により得られたプロトプラストからの再生
細胞塊は、植物体の再生に用いる通常のｔ８地、たとえ
ばリンスマイヤー・スクーグ培地あるいはシエンク・ヒ
ルデブランド培地等で通常の培養条件、たとえば１ｇ度
１５〜３０℃程度で４ケ月程度培養することにより、通
常不定胚を経由して幼植物体にすることができる。この
幼植物体は史に公知の方法によって馴化させｆ！Ｉｉ苗
として使用できる植物体にまで生育させることかできる
。

〈実施例〉以ドは、本発明の実施例を示すものであり、これによっ
て本発明は１（Ｒ１定されるものではない。

実施例ミシマサイコの種子を流水で洗浄後、種皮を除き、自効
塩素２Ｇｏの次亜塩素酸ナトリウム水溶酸中て、１０分
間表面殺閑した後、滅菌水で３回洗浄した。これを無菌
的に発芽させて、得られた植物体を根と葉に分け、リン
スマイヤー・スクーグ培地（２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸１〜５μＮ１、ヘンシルアデニン０〜５μＭ１ジ
ェランガム０．２０ｏ）に置床し、約２ケ月培養して得
られるカルス細胞のうち増殖活性の高いものを選別し、
リンスマイヤー・スクーグ培地（２，４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸１μ〜１、シュークロース′３００　％ジェ
ランガム０．２００）で継代し増殖させ、継代後５〜１
４日のカルス細胞を材料として用いた。

材料となるカルス細胞５ｇを滅菌水４０ｍ１中に＠！に
濁させ、３０〜６０分枚置し、装心分離（１（〕０（”
ｌｒ、ｐ、ｍ１分）：こよって集め、ンエンク・ヒルデ
ブランド培地の無機成分の１７２の濃度を含む酵素液（
グルコース０．６Ｍ、塩化カルシウム１０ｍＭ、セルラ
ーゼオノヅカＲ８］Ｏｏ１ペクトリアーセＹ　　２３　
０．　１０６）　４０ｍ１中に懸濁させ、２５℃暗所で
５０ｒ、ｐ、ｍの振とうにかけ１６〜２４時間処理する
。酵素処狸後、６０μｍのナイロンメツシュで濾過し、
遠心分＃（７００ｒ、ｐ、ｍ３分）洗浄後（グルコース
０．６Ｍ、塩化カルシウム１０ｍＭ）で３回洗浄する。

上記の方法によりカルス細胞５ｇより約８×１０６個の
プロトプラストを得ることかできる。

得られたプロトプラストを細胞密度か５×１０５個／ｍ
１前後となるように培養培地に包埋し２５℃暗所で２〜
３ケ月培養することにより、コロニーを得ることかでき
る。コロニーをピックアップし、さらに＃Ｊ４ケ月培養
することにより不定胚を経由して幼植物体を得ることが
できた。プロトプラスト培養に用いる培地は、シエンク
・ヒルデブランド培地を基本とするものを用いた。無機
成分については、Ｎ、、Ｈ４＋を０．６５ｍＭ、３− ＰＯ４を０．５２ｍＭとし、その他の無機成分について
は、１／２とした培地を用いた。ビタミン類は、基本培
地のものをそのまま用いた。炭素源及び浸透圧、２５１
節剤としての糖類は、グルコース０．５Ｍを用いた。

上記の方法により、コロニー形成率は、最、５でｏ、２
’、ｏに達した。また根由宋のカルス、葉由来のカルス
より単離したプロトプラストにおいてもコロニー形成率
の差は、はとんど認められなかった。

Claims

【特許請求の範囲】１、ブプレウルム属植物から誘導されるカルスから増殖
活性の高い細胞を選別し、このカルス細胞を滅菌水で処
理した後、培地用無機成分を含むプロトプラスト調製用
酵素液で処理、することを特徴とする、プロトプラスト
調製法。２、請求項１の方法によって得られるブプレウルム属植
物のプロトプラストを、少なくとも１種の植物生長調節
物質と、糖類から選ばれる少なくとも１種の浸透圧調節
剤と、を含み且つ無機成分の含量を低濃度としたプロト
プラスト培養用の培地で培養することを特徴とする、プ
ロトプラスト培養法。３、植物生長調節物質がオーキシン類から選ばれるもの
であり、糖類がグルコース、マンニトールおよびソルビ
トールである、請求項２記載の培養法。４、請求項２記載の方法で得られるプロトプラスト培養
物を、植物ホルモンを含む固体培地上で培養して植物体
を得ることを特徴とする、ブプレウルム属植物の再生法
。