JPH03228674A - トマトのプロトプラスト培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、トーこトのプロトプラストを培養する方法に
関する。

〔従来の技術〕

プロトプラスト培養は植物の細胞融合、遺伝子組換え９
体細胞変異を利用した育種なとを行う為■ に必要な技術である。

１マドについては多数のプロトプラスト培養に関する研
究例かあるか、主として野生種（ハ仔ｐｅｒｓｉｃｏｎ
　　ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ　）についててあり、培養か
困難な栽培種（Ｌ、　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　）につい
ては２，３の成功例かみられるにすきない５山口彦之監
修。

植物遺伝子操作技術、　ｐ　１９５　（１９ｇ５））。

したがってトマトの育種手段の１つとしてプロトプラス
トを利用するためには、トマト栽培品種にも容易に適用
されるプロトプラスト培養に関する新技術の開発か望ま
れている。

トマトのプロトプラストを培養する場合従来液体培地が
用いられてきた［Ｅ、　Ａ、　５ｈａｈｉｎ、　Ｃｅ１
ｌＣｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓｖｏｌ、　１
　、　、ｐ、　３７０（１９８４）］　。またＭｏｒｇ
ａｎら［Ａ。

Ｍｏｒｇａｎ、　Ｅ、　Ｃ，Ｃｏｃｋｉｎｇ、　Ｚ、Ｐ
ｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、、　１０６．９７（１
９８２月は寒天培地に包埋する方法を報告している。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながらこれらの方法を一般のトマト栽培品種に応
用しても細胞分裂頻度は低くコロニー升成に至らない場
合か多い。また薬剤耐性カルスづ得るには、プロトプラ
ストを液体培地で培養しｔ場合、細胞塊が崩壊するのて
カルスの選抜が置引である。そこで固形培地を用いれば
細胞塊の崩坊を防くことかてきるか、その場合は加熱が
不可週で細胞に悪影響を及ぼしていた。

また、植物（ダイズ、タバコ、ペチュニア）のフロドプ
ラスト培養にアルギン酸を用いる方法かｒ開昭６２−５
５０７７号公報及びＰｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅＬｅｔ
ｔｅｒｓ、　　２５　　Ｐ６１〜６６　（１９ｇ２）に
開示されているが、いずれもアルギン酸を用いた時の方
か寒天を用いた時よりもコロニー形成率が良くなく、植
物のプロトプラスト培養にアルギン酸を用いることが都
合が良いとはされていなかった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らはトマトのプロトプラスト培養においてアル
ギン酸を培地固形剤として用いると予想外にも細胞分裂
率およびコロニー形成率が飛躍的に向上することを見出
しさらに検討を重ねて本発明を完成した。

即ち、本発明は、 （１）　トマトのプロトプラストをアルギン酸又はその
塩を含む固形培地に包埋し、これに液体培地を加えて培
養することを特徴とするトマトのプロトプラスト培養法
、 （２）固形培地の一部が空気に触れるように液体培地を
加えることを特徴とする（１）記載のプロトプラスト培
養法、 （３）　アルギン酸又はその塩を含む固形培地に包埋さ
れたトマトのプロトプラストに関する。

本発明によるプロトプラスト培養法は、■）トマトのプ
ロトプラストを単離する工程（プロトプラスト単離工程
） ２）フロドプラストをアルギン酸に包埋する工程（プロ
トプラストの包理工程） ３）プロトプラストを培養する工程 （プロトプラストのπ実工程） ４）植物体を再生オろ工程より成る。

（植物体の再生工程） 以下、本発明のプロトプラスト培養法を工程順に説明す
る。

１）プロトプラスト単離工程 プロトプラストを得る材料としてはトマトの各器官およ
び培養細胞を用いることができる。単離の方法は自体公
知の方法で、細胞間物質であるペクチン質を分解する酵
素としてペクチナーゼ、細胞壁を分解する酸素としてセ
ルラーゼおよび浸透圧調整剤としてマンニトール、ソル
ビトール、グルコース等を、また公知の植物組織培養培
地及び植物ホルモンを適宜ｃｐｗ７（１（表−１）ある
いはＭＥＳ緩衝液等に溶解し、ｐＨを約４．０〜８．５
に調節した酵素液を用い、約ＩＯ℃〜３５℃の温度で約
５〜４８時間静置あるいは振盪処理してプロトプラスト
を遊離する。この場合酵素処理後の試料液を５０〜１０
０μｍのメツシュで濾過し、未消化の細胞塊等を除き、
遠心分離処理あるいはシ。

糖、フィコール等により密度勾配処理をして酵素液とプ
ロトプラストを分離し、浸透圧調整剤を含む例えばＣＰ
Ｗ液（以下ＣＰＷ溶液と略す）で洗浄してプロ トプラストを精製してもよ（ ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　２５．９Ｋ
ＮＯ３１０１，ｌ ＣａＣｌ２−・２Ｈ，０１４８４，９ Ｍｇ５　Ｏ，・７Ｈ，０２４６，５ ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１５
９２）プロトプラストの包理工程 酵素処理後、単離、精製して得られたプロトプラストを
塩化カルシウムを含まないｃｐｗ溶１ｆｆｌで洗浄し、
ろ集あるいは遠心分離したプロトプラストをそのまま、
あるいはプロトプラスト懸濁液としてアルギン酸又はそ
の塩（約０．５〜５．０％）を含む植物組織培養培地（
以下培地と略す）と均一に混合した後、コマゴメピペッ
ト等を用い浸透圧調整剤および培地を含む塩化カルシウ
ム水溶液（約２０〜１００ｍＭ）中に滴下する。本発明
で使用されるアルギン酸又はその塩は単独で用いても、
２種以上混合して用いてもよい。本発明で使用されるア
ルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウムアルギン酸
カリウム、アルギン酸リチウムおよびアルギン酸アンモ
ニウムか挙げられるか、好ましくはアルギン酸ナトリウ
ムを用いる。

浸透圧調整剤としては、例えばシヨ糖、マンニトール、
グルコース、ソルビトール等か用いられるか、好ましく
はショ糖単独あるいはそれ以外と混合して約０２〜０．
７Ｍで用いる。３０分〜２４時間放置し固化を完了させ
てからＣＰＷ溶液等で十分に洗浄すると、通常はビーズ
状になったアルギン酸又はその塩を含む固形培地に包埋
されたトマトのプロトプラストが得られる。

培地としては、例えばムランケ・スクーグの培地（以下
ＭＳと略す）、ガンボーグのＢ５培地（以下Ｂ５と略す
）、ザパタの培地、シャヒンの培地、カオの培地および
これらの改変培地等が用いられ、いずれも培地中の塩化
カルシウムは、あらかじめ除いておく。

このような培地には炭素源、窒素源、無機塩類、有機物
等か適宜配合されてもよい。

炭素源としてたとえばショ糖、グルコース、ガラクトー
ス、フルクトース、マルトース等の糖類、可溶性デンプ
ンなどか用いられる。窒素源としては、たとえば硝酸塩
、アンモニウム塩等が用いられるが、好ましくはアンモ
ニウム塩を全く含まないかあるいは少量を添加する。無
機塩類としては、たとえばリン、カリウム、カルシウム
、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛、モリブデン、硼
素、鉄、コバルト、ニッケル等の元素を含有するもの等
が用いられる。有機物としては、たとえばイノ／トール
、ニコチン酸、ピリドキシン塩酸、チアミン塩酸、パン
トテン酸カルンウム、葉Ｍ、ｐアミ７安息香酸、ビオチ
ン、コリンクロライド、リホフラビン、アスコルビン酸
、ビタミンＡ１ビタミンＤ３、ビタミンＢ　ｌｆｆ１等
のビタミン類、たとえばピルビン酸ナトリウム、クエン
酸、リンゴ酸、フマル酸等の有機酸、たとえばココナツ
ツミルク、カゼイン加水分解物、酵母エキスなどの天然
物質なとか用いられる。特にイノシトールの添加はプロ
トプラストのコロニー形成に良好で、好ましくはイノ／
トールを約０．１〜８．０ｇ／（！添加する。

培地には、さらに例えばオーキシン類、サイトカイニン
類等の植物生長調節物質か適宜添加されてもよい。この
ようなオーキシン類としては、例えば２，４−７クロロ
フエノキン酢酸（以下、２゜、４−Ｄと略す）、２．４
−ジクロロフェニル酢酸、インドール−３＝酢酸（以下
、ＩＡＡと略記）、インドール−３−醋酸（以下、ＩＢ
Ａと略す）、１ナフタレン酢酸（以下、Ｎ　Ａ　Ａと略
す）、２−ナフトキシ酢酸、パラクロロフェノキン酢酸
、２，４゜５−トリクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタ
レンアセトアミド等が用いられる。また、サイトカイニ
ン類としては、例えば６−ヘンシルアデニン（以下、Ｂ
ＡＰと略す）、２−イソペンチルアデニン、２−イソペ
ンテニルアテ゛ニン、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロ
セアチン、ゼアチンリホシド、ジフェニル尿素等が用い
られる。中でもオーキシン類としては、例えば２．４−
Ｄ、ＮＡＡ等が、サイトカイニン類としては、例えばＢ
ＡＰ等が繁用される。

通常オーキシン類は約０．０１〜２０　ｐｐＩｌｌ、サ
イトカイニン類は約０．０１　＝　１５ｐｐｍの割合で
培地中に添加される。

もちろん培地のｐＨを調節する目的で無機または有機の
酸、アルカリ類、緩衝剤等を加え、ｐＨ５，０〜８．０
に調整する。

アルギン酸又はその塩を塩化カルシウム等の液中に滴下
することによりトマトのプロトプラストが包埋されたゲ
ル化した固化体（以下、ビーズと略す）が形成され、培
地液の交換が容易に行われる。

本ビーズ法によればプロトプラストは、機械的衝撃ある
いはアガロース包理法に見られるような加熱による生育
への悪影響がな（、また培養細胞から排出される老廃物
による生育の阻害作用およびプロトプラストが凝集して
分裂や生存が阻害される現象など液体培養法が持つ欠点
を回避することができる利点を有している。

３）プロトプラストの培養工程 プロトプラストの培養は、プロトプラストを包埋したア
ルギン酸ビーズを上記の炭素源および植物ホルモン等を
含む培地液（たたし塩化カルシウムは含む）約１〜３０
０ｄ、、好ましくは約４〜２０ｄを含む直径約３〜３０
ｃｍのプラスチックシャーレ、容積約２０〜１０００ｇ
のマイヤー等に移し、静置あるいは振盪して行うのであ
るか、好ましくはビーズの一部か空気に触れるように液
体培地を加えるのがよい。培地液は植物のプロトプラス
ト培地液として公知のものを使用してよい。

培養の条件は、培地の状態２組成、培養の手段等により
て一定しないのは当然であるか、それらは、初期は暗所
で培養し、プロトプラストの生育に伴って徐々に明るく
するのか望ましい。また、培養期間中の温度としては約
１５〜３５°Ｃで、好ましくは約２５〜３０°Ｃの温度
て行う。

培地液の交換は３〜１４日毎、好ましくは５〜１０日毎
に行い、培養液中の浸透圧調整、例えばシヨ糖、マンニ
トール、グルコース等の濃度は、適宜低下させることか
望ましく、好ましくは５〜１０日毎に０．０１〜Ｑ、１
Ｍつつ低下させる。

このようにして植物体の再生を目的とするトマトのプロ
トプラスト由来のカルスか形成される。

４）植物体の再生工程 プロトプラストを培養して得られたカルスを苗条の再生
する培地、例えばＢ５培地、ＭＳ培地等に炭素源として
、例えばシヨ糖、グルコース等を約０１〜１００％添加
する。植物ホルモンとして、例えばＮＡＡ、２．４−Ｄ
、ＩＡＡ、ＩＢＡ等のオーキシン類を通常約Ｏ〜１０　
ｐｐｍ、およびＢＡＰ、　　カイネチン、セ゛アチン等
のサイトカイニン類を通常約Ｏ〜２０　ｐｐｍそれぞれ
添加する。また培地の固形化剤として、例えば寒天、ア
ガロース、ケルライト等で固めた培地を用いることによ
って苗条を再生させ、さらに発根させることができる。

カルスを苗条に導く培地は上記したちの以外に植物カル
スを苗条に導く培地として知られているものか適宜に使
用される。

培養の条件は、約１０００〜２００００Ｌｕｘの照明で
、好ましくは約３０００＝ｌＯ０００１，ｕｘで行う。

培養期間中の温度は約１５〜３５°Ｃで、好ましくは約
２５〜３０’Ｃて行う。培養の継代は２〜４週間毎が望
ましい。

このようにして１０日から１年で完全な植物体がプロト
プラストから再生される。

なお、本発明のプロトプラスト培養前に、トマトのプロ
トプラストに例えばキュウリモサイクウイルス（ＣＭ　
Ｖ　）、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）等の植物ウ
ィルスのコート蛋白遺伝子、除草剤耐性遺伝子、耐虫遺
伝子等を導入したトマトのプロトプラストを本発明の方
法に従って培養し、さらに植物体の再生工程に付するこ
とによって植物ウィルス、除草剤、害虫等に耐性なトマ
トを育種することができる。

以下、実施例によって本発明を更に詳しく説明する。

〔実施例〕

１）プロトプラストの単離工程 供試植物のトマト〔品種、パレス（タキイ種苗に、Ｋ）
およびヘビートマト（大和農園）〕の種子を、７０％エ
タノールに１分間、次いて１％次亜塩素酸ナトリウム溶
液に１０分間浸漬して殺菌後、滅菌水で３回洗浄し、表
−２に示すＭＳ寒天培地（３％シヨ糖、０８％寒天）に
播種し、照明下（植物培養用蛍光灯、３０００Ｌｕｘ、
１６時間日長）２５°Ｃて発芽させた。

実生（播種後１週間）の子葉１ｇに対して、２０滅の酵
素１ｆｆｌ（０，１％マセロザイムＲ−１０１０％セル
ラーセ・オ／ズカＲ−１０，０，４Ｍマンニ［−ル、ｃ
ｐｗ液、ｐ）（５，８）を加え細断し、２５〜３０’Ｃ
の温度で暗所下静置で１６時間の酵素処理を行ってプロ
トプラストを単離した。

処理後、プロトプラスト懸濁液を１００および５０μｍ
ナイロンメノンユでγ濾過して未消化の細胞塊等を除き
、さらに遠心分離（７０Ｘｇ、５分間）および２０％シ
ョ糖溶液による密度勾配を行いプロトプラストを精製し
、０．４Ｍマンニトールを含むＣＰＷ液（以下洗浄液と
略す）で２回洗浄してプロトプラストを調整した。

２）プロトプラストの包理工程 精製して得たプロトプラストを、さらに塩化カル／ラム
を含まない洗浄液で１回ｌ先浄した後、表３に示した０
、７５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社
製）を含むプロトプラスト培養培地（ＯＦＫ−１培地）
と均一に混合し、４〜９Ｘ　Ｉ　Ｏ’／ｄの密度に調整
した後、滅菌済ピペ。

トを用いて直径９ｃｍの滅菌済プラスチック／ヤーレ内
の５０ｍＭ塩化カルンウム溶液（ＯＦＫ−１培地を含む
）１０轍中に滴下した。その後２５°Ｃ１６時間放置し
、直径約５ｍｍの球状の同化体（以下ビーズと略す）を
形成させた。

３）プロトプラストの培養工程 このビーズを洗浄液で２回洗浄した後、表−３に示した
０ＦＫ−２培地（４Ｍｌ）を添加し、２７５°Ｃ７暗所
下静置て培養した。

培養７日後にンヨ糖濃度のみを０．２Ｍに調整した０Ｆ
Ｋ−２培地（４旋）と交換し、２５°Ｃ暗所下振盪培養
（４０ｒｐｍ）した。コロニー（８細胞以上）形成率を
表−４に示した。

４）ｌｔｉ物体の再生工程 培養１４日後には、表−２に示すＭＳ培地にＩＡＡを０
　、２　ｍｇ／　（１，セアチンを２．０ｍｇ／（！、
　　／ａ糖を５％加えたものにケルライ）　（Ｇｅｌｌ
ａｎ　　ＧａｍＫｅｌｃｏ社製）を０．３％加えて固め
た苗条再生培地にビーズを置床し、照明下（植物培養用
蛍光灯。

約５０００Ｌｕｘ、１６時間日長）２５°Ｃで培養した
。

培養３０日後には、ンヨ糖濃度のみを２％にした苗条再
生培地にビーズ内で生長したカルスを継代し、上記と同
様の条件で培養を継続したところ培養４５日口取はカル
ス１部に苗条が再生した。

この苗条をさらに生育させた後、発根培地（１／３希釈
ＭＳ培地、　　０．０１ｍｇ／１２１　ＢＡ、　　１％
ンヨ糖、０４％ケルライト、ｐＨ５，８）に移植して同
様の条件で培養したところ、発根して完全な植物体が再
生された。再分化率を表−５に示した。

また、アルギン酸の代わりに寒天を用いてプロトプラス
トの培養を行ったもの（アガロース法）および精製した
プロトプラストを０ＦＫ−２培地で培養したもの（液体
法）を対照として実験を行った。

表−２ムラフケ・スクーグ（Ｍ　Ｓ　）培地Ｎ０３ Ｎ＋−＋４ＮＯ３ ＫＨ２ＰＯ。

ＣａＣＬ・２）（、○ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＦｅＳ０４・７Ｈ２Ｏ Ｎａ２−ＥＤＴ、Ａ 〜１ｎＳＯ４・４　Ｈ２Ｏ Ｚ　ｎＳ　Ｏ４・７　Ｈ２０ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０ ＣＯＣＱ２・６Ｈ２０ に＋ 　３ＢＯ３ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２゜ ミオイノントール ニコチン酸 塩酸ピリドキノン 塩酸チアミン グリノン ｐＨ １，９００ １，６５０ ７０ ４０ ７０ ２７，８ ７３ ２３ ６ ０，０２５ ０、０２５ ８３ ２ ０，２５ ００ ０，５ ０，５ ０，１〜１．０ ５．７〜５．８ 表−３プロトプラスト培養培地 ＫＮＯ２１９００ ｃａＣＬ−２Ｈ２０ ＭｇＳＯ，・７［（，０３７０ ＫＨ７Ｐ○４１７０ ＦｅＳＯ，・７Ｈ２０２７，８ Ｎａ２−ＥＤＴＡ　　　　　　　　　３７．３Ｍｎ５（
）４”４Ｈ２０２２３ ＺｎＳＯ，・７Ｈ２０８，６ ＣｕＳＯ，・５Ｈ２００，０２５ ＣｏＣＱ２・６Ｈ２００，０２５ ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１１１３
Ｈ３ＢＯ３６，２ Ｎａ２ＭｏＯ４”　２８２０　　　　　　０．２５ニコ
チン酸　　　　　　　　２．５ 塩酸チアミン　　　　　　　１０ 塩酸ピリトキンン　　　　　　Ｉ 葉酸　　　　　　　　　　　　０．５ ビオチン　　　　　　　　　　　０，０５Ｄ−パントテ
ン酸カルシウム　０．５ 塩化コリン　　　　　　　　　０．１ グリンン　　　　　　　　　　０，５ カゼイン氷解物　　　　　　１５０ Ｌ−システィン　　　　　　　Ｉ ９００ ４０ ７０ ７０ ２７．８ ３７．３ ２２．３ ８．６ ０２５ ０、０２５ ０．８３ ２ ０．２５ ２．５ ０ ■ Ｏ１５ ０５ ０，５ １ Ｏ２５ ５０ ■ リンゴ酸 アスコルビン酸 硫酸アデニン Ｌ−グルタミン ミオイノシトール リホフラピン ショ糖 ＡＡ ２．４−Ｄ ＡＰ ０ ０．５ ０ ００ ６００ ０．２５ １０２７００（０，３Ｍ） ５ ０ ０．５ ０ ０゜５ ０ ００ ６００ ０．２５ ８５６００（０，２５Ｍ） ５ １．０ ５ 注）次の工程（植物体の再生工程）に移行していたので
コロニー形成率は測定していない。

表 再分化率（％）” 期間 液 体 法 アルギン酸 ビーズ法 ８０日 １３．２％ 表−４，５から、本発明のトマトのプロトプラスト培養
法は、従来法よりもコロニー形成率および再分化率がか
なり良いことが判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トマトのプロトプラストをアルギン酸又はその塩を
   含む固形培地に包埋し、これに液体培地を加えて培養す
   ることを特徴とするトマトのプロトプラスト培養法。 ２、固形培地の一部が空気に触れるように液体培地を加
   えることを特徴とする請求項１記載のプロトプラスト培
   養法。 ３、アルギン酸又はその塩を含む固形培地に包埋された
   トマトのプロトプラスト。