JPH02273131A - ミシマサイコ属植物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高サポニン含量のミシマサイコ属植物を製造す
る方法に関する。

本発明方法により得られるミシマサイコ属植物の根は生
薬柴胡として大柴胡湯、小柴胡湯などの漢方薬に配合し
て用いられ、またその根の成分、例えば、サイコサポニ
ンａ、Ｃ及びｄなどのようなサポニンは肝障害改善作用
、抗アレルギー作用を有し、医薬品として有用である。

〔従来の技術〕

ミシマサイコ（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ　ｆａｎ−ｃａｔｕ
ｍ　Ｌ、　）属植物の根は生薬柴胡として小柴胡湯、大
柴胡湯などの処方に配合され、漢方薬として頻用されて
いる。その有効成分であるサポニン〔例、サイコサポニ
ン（５ａｉｋＯ８ａｐＱｎｉｎ　）　ａ　、　Ｃ及びｄ
〕は肝障害改善作用などの薬理作用を有し、近時医薬と
して注目されている。

ミシマサイコ属植物の生産は、天然品種の栽培では天候
に左右されるので、ミシマサイコの組織培養による製造
が試みられている（特公昭５６−５２５５７号、特開昭
６３−２３７７８４号等）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これら従来の方法はミシマサイコ属植物
の根の培養を硝酸イオンモル濃度がアンモニウムイオン
濃度よりも大きい培地で行うものであり、しかも得られ
る培養根中の有効成分のサポニン含量はきわめて低く、
通常２％以下にすぎない。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記の従来法の欠点を克服しようと種々研
究を重ねた結果、ミシマサイコ属植物の根を組織培養し
てミシマサイコ属植物を製造するに際し、硝酸イオンと
アンモニウムイオンのモル濃度比を制御することにより
高サポニン含有ミシマサイコ属植物を製造しうろことを
見出し、本発明を確立するに至った。

本発明は、ミシマサイコ属植物の根を硝酸イオンモル濃
度がアンモニウムイオンモル濃度の約１．５ないし２０
倍である培地で培養した（第１段階の培養）のち、硝酸
イオン濃度がアンモニウムイオン濃度以下である培地で
培養する（第２段階の培養）ことを特徴とする高サポニ
ン含有ミシマサイコ属植物の製造方法である。

本発明におけるミシマサイコ属植物としては同属のいず
れの植物をも用いることができるが、好ましくはキュウ
シュウサイ：Ｉ　（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ、ｆａｌ　−ｃ
ａｔｕｍ　Ｌ、ｆｏｒｍａ　ｋｉｕｓｈｉａｎｕｍ　Ｍ
、Ｈｉｒｏｅ）、ミシマサイコ（Ｂ、ｆａｌｃａｔｕｍ
　Ｌ、）である。特に好ましいのはキュウシュウサイコ
である。このキュウシュウサイコの根は増殖が速く、サ
ポニン含量の高いミシマサイコ属植物が得られる。

これらの植物から本発明で培養する原料の植物の根は、
例えば、ミシマサイコ属植物の実生、不定胚由来の幼植
物体、あるいは自生または栽培の植物体の根を切り取る
ことにより得られ、これを殺菌後培養すればよい。

なお、原料の植物体が無菌である場合は殺菌操作を省略
でき好都合である。無菌の原料植物は公知の方法、例え
ば、生薬学雑誌、３７．８２（１９８３）に記載の方法
により、植物体組織から不定胚由来の植物体を再生させ
、無菌条件下に発芽させた実生などとして得ることがで
きる。

第１段階の培養工程 本工程は植物体から切り取った根を培地に培養し増殖さ
せる工程である。本工程は公知方法、例えば、エクスペ
リメント　イン　プラント　ティシユ　カルチュア（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎ　ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅ　
０ｕｉｔｕｒｅ）第５１−５３頁、ケンブリッヂ　ユニ
バーシティ　プレス、ロンドンＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｌｏｎｄｏ
ｎ）（１９８２）１の記載に準じて行なうことができる
。

本工程の培養は硝酸イオンモル濃度がアンモニウムとし
ては通常の固型培地、植物の組織培養に用いられる液体
培地、例えばムラシゲ・スクーグ（以下ＭＳと略す）の
培地、ナガタ・タケベ（以下ＮＴと略す）の培地、ガン
ボーグのＢ５（以下Ｂ５と略す）培地、リンスマイヤー
・スクーグの培地、ホワイトの培地及びこれらの改変培
地、例えば希釈培地などが用いられる。好ましくはＭＳ
培地、ＮＴ培地またはこれらを約２〜１０倍に希釈した
培地などで培養すると培養根は速やかに増殖し生産性が
高い。

このような培地には炭素源、窒素源、無機塩類、有機物
等が適宜配合されてもよい。

炭素源として例えばショ糖、グルコース、ガラクトース
、フルクトース、マルトースなどの糖類、可溶性デンプ
ンなどが用いられる。窒素源としては、例えば硝酸塩、
アンモニウム塩などが用いられる。無機塩類としては、
例えばリン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マ
ンガン、銅、亜鉛、モリブデン、硼素、鉄、コバルト、
ニッケルなどの元素を含有するものなどが用いられる。

有機物としては、例えばイノシトール、ニコチン、ピリ
ドキシン塩酸、チアミン塩酸、パントテン酸カルシウム
、葉酸、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、コリンクロラ
イド、リボフラビン、アスコルビン酸、ビタミンＡ１ビ
タ疋ンＤ８、ビタミンＢ、２などのビタミン類、例えば
ピルビン酸ナトリウム、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸
などの有機酸、例えばココナツツミルク、カゼイン加水
分解物、酵母エキスなどの天然物質などが用いられる。

培地には、さらに例えばオーキシン類、サイトカイニン
類などの植物生長調節物質などが適宜添加されてもよい
。このようなオーキシン類としては、例えばλ４−ジク
ロロフェノキシ酢酸（以下、２．４−Ｄと略称）、２．
３−ジクロロフェニル酢酸、インドール−３−酢酸、イ
ンドール−５−４Ｍｍ（以下、ＮＢＡと略称）、１−ナ
フタレン酢酸（以下、ＮＡＡと略称）、２−ナフトキシ
酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２，４．５−トリク
ロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレンアセトアミドなど
が用いられる。また、サイトカイニン類としては、例え
ば６−ベンジルアデニン、２−イソペンチルアデニン、
２−イソペンテニルアデニン、カイネチン、ゼアチン、
ジヒドロゼアチン、ゼアチンリボシド、ジフェニル原素
などが用いられる。

なかでもオーキシン類としては例えばＮＢＡ。

ＮＡＡなどが、サイトカイニン類としては例えばカイネ
チンなどが繁用される。

通常オーキシン類は約０．００１〜２０ｐｐｍ。

サイトカイニン類は約０〜１５　ｐｐｍの割合で培地中
に添加される。

もちろん培地のｐＨを調節する目的で無機または有機の
酸、アルカリ類、緩衝剤等を加え、あるいは消泡の目的
で油脂類１表面活件剤等の適量を添加してもよい。

培養の手段は静置培養でも、振盪培養あるいは通気撹拌
培養法等の手段を用いてもよい。大量の処理には、いわ
ゆる振とう培養によるのが望ましい。培養の条件は培地
の状態９組成、培養の手段等によって一定しないのは当
然であるが、それらは通常的１５℃〜３５℃の温度で初
発ｐＨを中性附近に選択するのがよい。とりわけ、培養
中期の温度は約２０℃〜３０℃、また初発ｐＨは約５．
０〜８．０の条件が望ましい。培養期間は１日〜３ケ月
程度で良い。本工程は好ましくは暗黒下で行われる。１
０〜４０日後には次の第２段階の培養工程で用いられる
安定に増殖する培養根が得られる。

この培養根は１〜５ａｎの長さに切断し、新鮮培地で１
０〜４０日間隔で継代培養すれば、長期間にわたり根の
状態で維持でき、必要に応じ第２段階の培養工程用の初
発培養根として利用されうる。

第２段階の培養工程 本工程では、前工程で得た培養根を硝酸イオンモル濃度
がアンモニウムイオンモル濃度以下である培地で培養す
る。

培地としては、前記の液体培地、例えば、ＭＳ培地、Ｂ
Ｓ培地、リンスマイヤー・スクーグの培地およびこれら
の改変培地などが用いられる。

培地のｐＨや培養温度としては第１工程と同様の条件が
用いられる。

培養期間は約５日〜４０日程度である。

本工程の培養は好ましくは暗黒下で行われる。

培養の手段は静置培養でも、振盪培養あるいは通気撹拌
培養法等の手段を用いてもよい。大量の処理には、いわ
ゆる振とう培養によるのが望ましい。

このようにして得られるミシマサイコ属植物の根は生薬
柴胡として、また大柴胡湯、小柴胡湯などの漢方薬の配
合原料として用いられる。

根の成分であるサポニン、例えばサイコサポニンａ、ｃ
及びｄなどは自体公知の単離精製手段、例えば抽出など
で単離後、肝障害改善剤、抗アレルギー剤などの医薬品
、また柵々の医薬品の原料として用いられる。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例の形でさらに説明する。

各実施例において、％は特記しない限り重量％を示す。

実施例１ （原料板製造工程） キュウシュウサイコの茎を流水下で洗浄後、７０％エタ
ノールで１分間、さらに１％次亜塩素酸ナトリウムで５
分間殺菌した。ついで１ａｎの長すニ切断、１０　　Ｍ
２．４−Ｄ、お、ｌ−び１ｏ　Ｍカイネチンを含むＭＳ
固型培地〔０，８％バクトアガー（シフ：ｌ　（Ｄｉｆ
ｃｏ）　　社製、ｐＨ５，８）：）に置床し、暗黒下２
４℃で培養した。４週間後にはカルスが形成された。カ
ルスは１ケ月間隔で継代し、４ケ月後１ｍ９／ｌゼアチ
ン添加のＭＳ培地２０ｍｌを含む１００ｍ＃三角フラス
コに移し、１ケ月毎に継代しながら暗黒下３ケ月振盪培
養したところ不定胚を形成した。

不定胚は０．０２ｍｆ／１１　　ＩｆｌＡ、５％ショ糖
を添加したＭＳ液体培地で振盪培養すると芽および根を
分化した。４週間後長さ２ａｎ程度に生長した根を切取
り次の第１段階の培養に用いた。

（第１段階の培養工程） 前工程で得られた根（５００ｍＦ）を０．０２ｍＮ／＃
ＩＢＡおよび３％ショ糖を添加した２倍希釈のＭＳ培地
（硝酸イオンモル濃度：アンモニウムイオンモル濃度＝
２：１）（１５ｒｌＶ）を含むプラスチックシャーレ〔
ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　社製、φ９　ｃｍ　）中
で振盪培養（６０ｒｐｍ）した。培養液は１週間毎に交
換しつつ暗黒下、２５℃で４週間培養したところ、培養
根（３，９Ｆ、湿重量）が得られた。

（第２段階の培養工程） 前工程で得られた培養根を約１〜２（１）に切断し、硝
酸イオンモル濃度とアンモニウムイオンモル濃度の比を
１：１，１：２．１：４およびＯ：１と変えて、前工程
と同じ培地で、同様に培養した。

比較として、硝酸イオンモル濃度とアンモニウムイオン
モル濃度の比が１：０，１２．５：１，４：１．２：１
の培地で培養を行った。

かくして得られた植物体のサイコサポニン含量を次の方
法により測定した。

サイコサポニンの定量 定量はサイコサポニンａ、ｃ、ｄを酸処理で共役二重結
合を持つサイコサポニンｂ、、ｈ、ｂ、とし、そのＵＶ
吸収を測定することにより行った。

すなわち、培養根を５０℃で送風乾燥後粉末にした検体
ｓｏｍｇを２％水酸化カリウムを含む８０％メタノール
ＦＪｍｇで１時間超音波処理後、水冷上酢酸０．２　ｍ
ｌを添加し、さらに８０％メタノールで全量１０１ＴＶ
とした。この抽出液４ｍ１ｌを蒸留水６ｍｌで希釈し、
Ｓｍｌずつを２本の）ｉＰＬ。

サンプル前処理用カラム（ベーカーｓｐｃフェニル、ベ
ーカー社）に負荷し、それぞれのカラムを３０％メタノ
ール５　ｍｌ、　　次いで蒸留水１０ｍ１！で洗浄した
。その後、一方のカラムには４０％塩化第二鉄溶液２１
Ｍを通し、室温に２０分装いた後、蒸留水１０ｍ＃で洗
浄し、反応物はメタノール４．Ｓｍｌで溶出させた（Ａ
液）。もう一方のカラムは塩化第二鉄未処理のままメタ
ノール４゜Ｓｍｌで溶出させた（Ｂ液）。Ａ液、Ｂ液は
それぞれメタノールで全量５ｍｌとし、各々の溶液２０
μｌをＨＰＬＯ［：装置ニジステムゴールド（ベックマ
ン社）、カラム：ＯＤ８ウルトラスフェア４．６×１５
ａａ＋粒子径５μ（ベックマン社）、移動相ニア５％メ
タノール、流速：　１　ｒｎｌ　７ｍ　１　ｎ　１検出
＝２６４　ｎｍ　］分析に供試した。

Ａ液中のサイコサポニンｂ１．ｈ、ｂ、の量からＢ液中
の量を引いた差をそれぞれ検体中のサイコサポニンａ、
ｃ、ｄの量として換算した。

結果を第１表に示す。

第１表 ◆第２段階の培養工程で用いた培地で、Ｂ５培地を基本
としＮＯａ：ＮＨ，の比を変化させたもの。

第１表から明らかなように、本発明方法では公知方法に
比較してサイコサポニンａ、Ｃおよびｄが約３．３から
１．６倍も生成することが判る。

参考例１ 実施例１のキニウシュウサイコを用いる原料様製造工程
から得られた原料板を第２表中の穏々の培地を用いて、
他の条件は実施例１の第１段階の培養工程と同様にして
、培養した。また、ミシマサイコについてもキュウシュ
ウサイコの場合と同様に増殖培養した。

結果を第２表に示す。

以下余白 第 表 第２表から、硝酸イオンモル濃度がアンモニウムイオン
モル濃度より大きい培地ではミシマサイコもキュウシュ
ウサイコもサポニン含量が低いことが明らかである。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば、効率よく品質が一定のミシマサイ
コ属植物の根を製造することができる。

本発明方法で得られるミシマサイコ属植物の根は、有効
成分のサポニン含量が高く、医薬品としてきわめて有用
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ミシマサイコ属植物の根を組織培養してミシマサイコ属
   植物を製造するに際し、硝酸イオンモル濃度がアンモニ
   ウムイオンモル濃度の約１．５から２０倍の培地、つい
   で硝酸イオンモル濃度がアンモニウムイオンモル濃度以
   下の培地で培養することを特徴とする高サポニン含有ミ
   シマサイコ属植物の製造方法。