JPH03279333A - エレウテロサイド類およびその他の生理活性物質を含有するエゾウコギ組識培養物の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、エゾウコギから得られるカルスを培養するこ
とによってエレウテロサイド類およびその他の生理活性
物質を天然物とほぼ同等に多（含有するエゾウコギ組織
培養物の生産方法に関する。

〈従来技術〉 エゾウコギ（学名：　Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ　５ｅ
ｎｔｉｃｏｓｕｓ）はウコギ科に属する低木で、ソ連、
中国および朝鮮半島の山野に分布し、わが国では北海道
にだけ生息している。エゾウコギのエキスは古くからソ
連や中国では健康増進用の民間伝承薬として用いられて
おり、その薬理効果としては慢性気管支炎症、動脈硬化
症、性機能減退症、低血圧症、高血圧症等に対する改善
効果がソ連、中国の研究者を中心として報告されている
。わが国においても、心因性性行動障害回復薬として有
効であること（特開昭５９−５３４２６）、血小板凝集
抑制剤として有効な成分が含まれていること（特開昭６
２−１６７７９１）が示されている。そして、このよう
な薬理効果を示すエゾウコギ中の主たる有効成分が、エ
レウテロサイドＢ、エレウテロサイドＢｌ、エレウテロ
サイドＥ等のエレウテロサイド類およびその他イソフラ
キシジン、クロロゲン酸等の生理活性物質であることが
明らかにされている。

二のように多彩な薬理効果を示す生理活性物質を含有す
るエゾウコギを得る方法としては、自生エゾウコギを採
取するか栽培する方法、又はエゾウコギの植物組織から
カルスを誘導し、誘導したカルスを組織培養法によって
増殖させる方法（特開昭６１−２３８７２７、特開平１
−２２８４６４）が知られている。

〈解決しようとする課題〉 しかし、自生エゾウコギを採取又は栽培する方法では、
わが国では北海道でのみ自生、栽培されているため資源
の枯渇が懸念されていること、種子から発芽に約２年さ
らに生育するまでには５〜７年を要し、生長が著しく遅
いこと、天然物に含有されている多彩な薬理効果を有す
るエレウテロサイド類およびその他の生理活性物質の成
分含有量が植物個体差及び産地格差によって異なること
等の理由により、高品質のエゾウコギを安定的に供給す
ることは難しい。

一方、エゾウコギの組織から誘導したカルスを組織培養
する方法では、増殖が速く比較的効率よく生産できる反
面、これまでは組織培養物中の生理活性物質としてエレ
ウテロサイドＢ、の含有が認められているだけで、他の
エレウテロサイド類やイソフラキシジン、クロロゲン酸
等の生理活性物質については、未だその含有状況が認め
られていない（例えば特開昭６１−２３８７２７号公報
）。また、従来の組織培養法では、エレウテロサイドＥ
を含有するエゾウコギ組織培養物の生産は困難であるこ
とも報告されている（第１１回植物組織培養学会大学会
大会、シンポジウム講演要旨集ｐ１５９）、このように
、組織培養法によって多彩な薬理効果を有するエレウテ
ロサイド類およびその他の生理活性物質を天然物と同様
に含有するエゾウコギ組織培養物の生産方法は未だ確立
されていない。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは、上述の如き情況に鑑みて、組織培養法に
よってエレウテロサイド類およびその他の生理活性物質
を天然物と同程度に含有するエゾウコギの生産方法につ
き鋭意研究を行った。その結果、エゾウコギの植物組織
から誘導したカルスを特定の成分を含有した培地を用い
て培養することにより、得られた培養物にエレウテロサ
イドＢ１以外のエレウテロサイド類およびその他の生理
活性物質が含有され、しかもその含有量が天然物と同程
度に高いものであることを知見し、本発明を完成させる
に至ったものである。

即ち、本発明の要旨とするところは、エゾウコギの植物
組織から誘導したカルスを硫酸アンモニウムを含有する
培地によって培養することを特徴とするエゾウコギ組織
培養物の生産方法である。

〈発明の構成並びに作用〉 以下、本発明について詳細に説明する。

エゾウコギの葉、茎、根、種子等の植物組織をアルコー
ル、アンチホルミン等で殺菌し、その小切片を植物ホル
モンであるオーキシンおよびサイトカイニンを添加した
栄養寒天培地に、無菌的に置床する。培養条件は、暗黒
下で、２３〜２７゛Ｃの温度とする。約３週間で小切片
よりカルスが発生する。このように誘導してなるカルス
を同培地により、４週間で３〜４倍の成長を示すように
なるまで継代する。

上記の培地に用いる植物ホルモンとしては種々使用でき
るが、好ましくはオーキシンとして、２゛４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、サイトカイニンとして
カイネチンの組み合わせがよい、濃度は共に０．１〜１
０ｐｐｍの範囲がよい。

栄養寒天培地としては、通常寒天培養に使用せられるＬ
ｉｎｓｍａ　ｉｅｒ−ｓｋｏｏｇ、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
−ｓｋｏｏｇ、Ｗｈｉｔｅ、Ｗｏｌｔｅｒ−ｓｋｏｏｇ
等の培地を用いることができる。

次いで、誘導したカルスを固体または液体培地で培養す
る。培養条件は暗黒下２３〜２７°Ｃの温度とする。固
体培地の培養では置床し、液体培地の培養では振盪培養
、回転培養又は深部攪拌培養装置による培養を行うこと
ができる。

本培養で用いる植物ホルモンは、オーキシンとして、・
２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、イン
ドール酢ｆｉ（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）、
ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）等、サイトカイニンとしては
、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）　、イソペン
テニルアデニン、ゼアチン等、−ａに植物組織培養で用
いられているものが使用できるが、好ましくはオーキシ
ンとしてインドール酪酸（ＩＢＡ）、サイトカイニンと
してカイネチンの組み合わせがよい。濃度は共に０．１
〜３ｐｐ−の範囲がよい。

しかして、本培養で用いる栄養培地としては、硫酸アン
モニウムを含む培地であることが重要であり、好ましく
は１００〜２００ｍｇ／ｊ！の範囲である。このような
栄養培地としては、例えばＧａｍｂｏｒｇＢ−５培地を
用いることができる。

硫酸アンモニウムを含まない培地によれば、得られる組
織培養物中にはエレウテロサイドＢ、以外のエレウテロ
サイド類およびイソフラキシジン、クロロゲン酸等の生
理活性物質が含有されないか又はその含有量は少ない。

例えば、後述するようにエレウテロサイドＥやイソフラ
キシジン、クロロゲン酸の含有量は天然物に比べてかな
り少ないことが判明している。本発明によるときは、エ
レウテロサイドＢ、以外の他のエレウテロサイド類およ
びイソフラキシジン、クロロゲン酸等の生理活性物質が
天然物と同等又はそれ以上に多く含有されるもので、以
下、これを本発明の実施例により説示する。

〈実施例〉 実施例Ｉ ＭＳ培地にホルモンとして２．４−Ｄを１　ｐｐｍ、カ
イネチンを０．ｌｐｐｍ、寒天を３％添加し、これを５
０＋１ずつ１００ｍ１容量のマイヤーフラスコに分注し
、オートクレーブで滅菌した。この寒天培地上に、７０
％エタノールによる処理３０秒の後、２％アンチホルミ
ン処理３０分で殺菌処理をしたエゾウコギの根の小切片
を、無菌的に置床した。２３〜２７°Ｃで暗黒下で３週
間培養すると、小切片から淡褐色のカルスが発生した。

上記培地により数代、継代培養し、４週間で３〜４倍に
増殖するようになった。次いで、誘導したカルスｌＯｇ
（新鮮重量）を、Ｇａｍｂｏ　ｒｇＢ−５培地にホルモ
ンとしてインドール醋酸を３ｐｐｍ、カイネチンを０．
ｌｐｐｍ加え、また糖源としてシュークロースを３％添
加した寒天培地１００ｍ１を分注した３００ｍ１フラス
コに移植し、増殖させた。培養条件については、培養温
度が２５°Ｃ１培養期間が２１日間で、置床し、培養し
た。。培養終了後、収穫し、新鮮カルス重量を測定する
と４５ｇであった。

得られたカルスを乾燥させ、コーヒーミルによる破砕の
後、１８０μｍのステンレスメツシュに破砕物を通過さ
せ、通過物５００ｍｇを１００ｅａｌの栓付きマイヤー
フラスコに加えた。さらにこのフラスコに５０請ｌのメ
タノールを加え、栓をして超音波洗浄器（海上電気製ソ
ノクリーナー５０ａ）を用い、３０分間、超音波による
抽出を行った。次に抽出液を８０００回転、１０分間の
遠心分離することにより、上澄と残査に分け、注意深く
、上清メタノールをピペットで吸い取り、その内２０ｍ
１をエバポレーターにより濃縮し、乾燥後、２■ｌの１
４％アセトニトリルを加え、充分に溶解した。

得られた溶液を平均孔径０．２μｍのポリテトラフルオ
ロエチレン製フィルターで濾過し、２０μｌの濾液を高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に注入し、分析
した。分析は、検出波長が２７Ｏｎａｍ、ｉ離液がアセ
トニトリル：水：ギ酸−１４：８６：Ｌ流速が１．　２
ｓｌ／ｓｉｎ　、カラムが０ＤＳ−８０７Ｍ　（）−ソ
ー製、　４．６Ｘ２５０　ｍｍ）、カラム温度が４０°
Ｃにより行った。尚、定量法はエレウテロサイドＢ１エ
レウテロサイドＥ、イソフラキシジン、クロロゲン酸の
標準物質を用い、１点検量線による絶対検量線法により
行った。分析の結果、エレウテロサイドＢ（リテンショ
ンタイム＝Ｒ０Ｔ、＝５．６ｇ＋ｉｎ）　、エレウテロ
サイドＢ、（Ｒ，Ｔ、＝７．１ｍ１ｎ）　、エレウテロ
サイドＥ　（Ｒ，Ｔ、＝１５．８ｍ１ｎ　）　、イソフ
ラキシジン（Ｒ，Ｔ、　＝２０．０ｍ１ｎ）、クロロゲ
ン酸（Ｒ，Ｔ、　＝６．１ｍ１ｎ）を確認した。

Ｒ，Ｔ、値は各々の標準物質と一致した。

エレウテロサイドＢ、以外の定量値について、第１表に
示す。

実施例２ Ｇａｍｂ　ｏ　ｒ　ｇＢ−５培地に添加するインドール
醋酸を０．５ｐｐｍとした以外は全て実施例１と同一の
条件で培養しく培養終了後の新鮮カルス重量は３８　ｇ
）　、同一の条件で抽出を行い、分析した。その結果、
実施例Ｉと同様に各生理活性物質の存在が確認され、定
量値は第１表に示す通りであった。

実施例３ Ｇａｍｂｏ　ｒ　ｇＢ−５培地に添加するカイネチンを
１ｐｐ−とした以外は実施例１と全て同一の条件で培養
しく培養終了後の新鮮カルス重量は４４ｇ）、同一の条
件で抽出を行い、分析した。その結果、実施例１と同様
に各生理活性物質の存在が確認され、定量値は第１表に
示す通りであった。

実施例４ ＧａｍｂｏｒｇＥ−５培地に添加するインドール酪酸を
０．５ｐｐｍ＋、カイネチンを１　ｐｐｍとした以外は
実施例１と同一の条件で培養しく培養終了後の新鮮カル
ス重量は４２ｇ）、同一の条件で抽出を行い、分析した
。その結果、実施例１と同様に各生理活性物質の存在が
確認され、定量値は第１表に示す通りであった。

実施例５ Ｇａｍｂ　ｏ　ｒｇＢ−５培地に添加するインドール酪
酸をｌｐｐｓｇ、カイネチンを１ρρ鋼とした以外は実
施例１と同一の条件で培養しく培養終了後の新鮮カルス
重量は４１ｇＬ同一の条件で抽出を行い、分析した。そ
の結果、実施例１と同様に各生理活性物質の存在が確認
され、定量値は第１表に示す通りであった。

実施例６ Ｇａｍｂｏ　ｒ　ｇＢ−５培地に添加するインドール酪
酸を２．４〜Ｄ　（０，５ｐｐｍ　）に代えた以外は実
施例１と同一の条件で培養しく培養終了後の新鮮カルス
重量は４１ｇ）、同一の条件で抽出を行い、分析した。

その結果、実施例１と同様に各生理活性物質の存在が確
認され、定量値は第１表に示す通りであった。

比較例１ 本培地としてＭｕｒａｓｈｉｇｅ−ｓｋｏｏｇ培地に代
えた以外は実施例６と同一の条件で培養しく培養終了後
の新鮮カルス重量は４３　ｇ）　、同一の条件で抽出を
行い、分析した。その結果、僅かに生理活性物質の存在
が認められ、定量値は第１表に示す通りであった。

比較例２ 本培地としてＬｉｎｓｍａ　ｉｅｒ−ｓｋｏｏｇ培地に
代えた以外は実施例６と同一の条件で培養しく培養終了
後の新鮮カルス重量は３８　ｇ）　、同一の条件で抽出
を行い、分析した。その結果、僅かに生理活性物質の存
在が認められ、定量値は第１表に示す通りであった。

参考例 １０ｇの市販の天然物エゾウコギ根皮（乾燥物）をコー
ヒーミルで破砕し、実施例１と同一の条件で抽出し、分
析した。その結果、各生理活性物質の存在が確認され、
定量値は第１表に示す通りであった。

尚、第１表における生理活性物質の定量値は生理活性物
質の重量／培養物の乾燥重量を％で示したものである。

第１表 上記の第１表からも明らかな通り、本発明の実施例にお
いてはエレウテロサイドＢおよびクロロゲン酸の含有量
が天然物よりもかなり上回り、又エレウテロサイドＥお
よびイソフラキシジンも比較例のように著しく少ないと
いうことはな（、天然物と同程度に含有されることが認
められる。

〈発明の効果〉 本発明によれば、特定の条件で組織培養を行うことによ
って、上述の如く、多彩な薬理効果を有するエレウテロ
サイド類およびその他の生理活性物質を天然物と同様に
含有するエゾウコギを大量に供給することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）エゾウコギの植物組織から誘導したカルスを硫酸ア
   ンモニウムを含有する培地によって培養することを特徴
   とするエレウテロサイド類およびその他の生理活性物質
   を含有するエゾウコギ組織培養物の生産方法。 ２）培地としてＧａｍｂｏｒｇＢ−５培地を使用する請
   求項１記載のエレウテロサイド類およびその他の生理活
   性物質を含有するエゾウコギ組織培養物の生産方法。