JPH04210589A - 低分子量キトサンを使用する植物カルスの培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１１

【産業上の利用分野］本発明は植物細胞又は植物細胞よ
り２次的に産出する有用成分を目的とした植物カルスの
培養方法に関する。 ［０００２） 【従来の技術】毛状根組織培養を含む植物カルス培養で
は、微生物汚染対策としてオー１ヘクレブ滅菌とか増殖
時におけるクリーンベンチの利用とか、種々の高度のテ
クニックを採用して行なわれるのが普通であるが、１次
培養においては天然培地とか半合成培地などを用いるた
めに、ともすると微生物が発生してしまう危険が非常に
大きい。これらの微生物汚染を避けるために、無機塩濃
度を高くして行なう方法も提案されているが塩濃度が高
いために２次培養においては各成分の塩濃度調整が困難
になり、その結果有用成分の産出盪が減じたりする不都
合が発生したりする。 ［０００３］一方、植物細胞培養で産出する有用成分、
例えばロパンアルカロイド、ザボニン、パーオキシダー
ゼ、色素、ニコチン、香料、強心配糖体、インドールア
ルカロイド、アイリン、ビンブラスチン又はクロキシン
等を挙げることが出来るが、これらは全て細胞内に留ま
った形であり、この有用成分を取り出すためには、それ
らの細胞を系外に取り出し、物理的手段等を用いて組繊
細胞を破壊し、次いで抽出等の操作により有用成分を回
収する方法が行なわれている。 ［０００４３

【発明が解決しようとする課題］植物カルス培養におい
て、微生物汚染を低減させて、順調な植物細胞の増殖を
行なわせ、しかもその増殖速度を大幅に改善させる事を
考え、又一方では増殖した植物細胞内に産出する有用成
分を増殖時に植物細胞外に産出する方法はないかと検討
を加えた。 ［０Ｏ０７１ 【課題を解決するだめの手段］本発明は、これらの課題
を解決する事を目的としたものであって、分子量が１゜
５００以上３０，０００以下の低分子量キトサンを使用
して植物カルスを培養する方法を提供するものである。 ［０００８］植物カルス培養では不定形カルスまでをつ
くる１次培養と、さらに種々の薬品を添加してさらに分
化させたり有用成分を蓄積さぜたりする２次培養に分類
される。 ［０００９］１．次培養で使用される分子量が］、、５
００以上３０，０００以下の低分子量キＩ−ザンはｐＨ
を４゜６から６．０の範囲に調整し且又濃度としては０
．０５重量％から１．０重態％の範囲に調整して用いる
ことが好ましく、このように調整した主１−サン水溶液
を用いて固形培地をつくり、常法通り殺菌して、目的と
する植物細胞の移植を行ない、次いでクリーンベンチで
増殖を行なう。 ［００１０）一方、２次培養でも系内の微生物対策又は
培養速度上昇を目的として１次培養で調整したのと同じ
低分子量キトサン溶液を用いれば良いが、有用成分を植
物細胞外に産出ぜるためには液体培養で実施する事が望
ましく、本目的はト記低分子蟻キトサンを液体培地に対
して０．０５％以上、１％以下の濃度で添加する事によ
り達成される。 ［００１１１なお、二次培養で形態形成に必要な有機物
としてはビタミン、ミオイノシ１〜−ル、オーキシン、
サイ１へカイニン、ジベレリン、アブシジン酸等の中の
選ばれたものが使用される。 ［００１２３ 【作用］脱アセチル化度９４％以上の低分子量キトサン
は、官能基のアミン基がカチオンに荷電して、細胞壁に
キチン質を有する細菌やカビ類のゲルカンの特異部位に
結合し、その結果、これらの微生物のグルカンを加水分
解させて抗菌、抗ウィルス、又は抗カビ性を発現させる
。 ［００１，３］一方、低分子量キトサンは植物細胞内の
カルシウムイオン濃度を高め、カルシウム結合したカル
モジュリン量を増大せしめる。その結果、植物細胞の微
小管の再構築と細胞分裂が促進される。 ［００１４］又、低分子量キトサンは、植物細胞にエリ
ジター活性を起こさせると共に植物細胞内のインデュサ
ーと結合しＤＮＡ又はＲＮＡに関係すると推測される。 このようなことより、低分子量主１へサンを施用した毛
状根組繊細胞は、通常の植物細胞の生産形態と相違して
細胞外に生産物を誘導する。 （ｏ　ｏ　ｉ　ｓ） 【実施例】実施例１ カニ殻より得た主１−サンをさらに５０％過酢酸で処理
し、分子量範囲１，５００から３０，０００の低分子量
キトサンを得た。 ［００１６］所定の方法によるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　　ｒｉｚｏｇｅｎｅｓをピートモスの細胞組織に
感染させ、植物のＤＮＡにＡｇｒｏｂａｃ　ｔｅｒ　ｉ
ｕｍｒ　ｉｚｏｇｅｎｅｓの遺伝子を転写させ、植物の
細胞より毛状根を発根させた。発根した毛状根を約５ｍ
ｍ程度に切断して（毛状根の先端部は廃棄した）、植物
ホルモンの代わりに低分子量キｈサンを０．　１重量％
濃度とした溶液を一次培養寒天培地に練り込み、ＰＨを
５に調整した。 ［００１，７］あらかじめ滅菌した三角フラスコに、こ
のようにして調整した寒天培地を入れ、毛状根の組繊細
胞を電床してアルミホイールで口を覆い、環境温度２５
℃に調節した暗所において１分間１００往復の範囲で振
盪培養を１５日間行ないピー１ヘモスの毛状根組繊細胞
の増殖を行なった。 ［００１８］二次培養は、液状ガンポーグ（Ｂ−５培地
）培地に濃度として０．１重量％の低分子量キｌ−ザン
を練り込み、ＰＨ５としたのち１分間に１１の空気をジ
ャーファーメンタ−に送風し、温度３０℃で１５日間液
体培養を実施した。１５日後に細胞膜外に色素が組繊細
胞を中心として火炎状に生産されている事を確認した。 ［００１９］実施例２ 実施例１で用いたと同じ発根した毛状根を約５ｍｍ程度
に切断し、植物ホルモンを用いて常法通り滅菌した寒天
培地で毛状根の細胞培養を実施したが、テストを行なっ
たものの５０％にカビが発生し、好ましい一次培養とは
ならなかった。−次培養の中でコンタミのなかったもの
を取り出し、実施例１で行なったと同じようにして二次
培養を実施した結果、１５日後に細胞膜外に色素が生産
されている事を確認した。 ［００２０１ 【発明の効果］低分子量キトサンを使用して植物カルス
の培養を行なうと微生物汚染が軽減すると共に、植物細
胞増殖速度が向上し短期間に目的を達する事ができる。 一方、植物細胞外に有用成分を産出する事は植物細胞の
再利用又は有用成分の分離に好都合である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分子量が１，５００以上３０，０００以下
   の低分子量キトサンを使用する事を特徴とする植物カル
   スの培養方法。
2. 【請求項２】カルス２次培養において、系内に分子量が
   １，５００以上３０，０００以下の低分子量キトサンを
   加えて植物カルス培養を行ない、組織培養で産出する有
   用成分を細胞外に生成せしめる事を特徴とする請求項１
   の植物カルスの培養方法。
3. 【請求項３】分子量が１，５００以上３０，０００以下
   の低分子量キトサンを使用して、系内の微生物の増殖を
   抑制する事を特徴とする請求項１の植物カルス培養方法
   。
4. 【請求項４】分子量が１，５００以上３０，０００以下
   の低分子量キトサンを使用して、カルスの増殖速度を向
   上せしめる事を特徴とする請求項１の植物カルスの培養
   方法。