JPH03191793A - ブラシノステロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物細胞を培養してブラシノステロイドを生
産する方法に関する。

〔従来の技術と問題点〕

ブラシノステロイドは、ステロイド骨格を有する植物成
長調節物質であり、各種の植物体、例えば、アブラナ花
粉、クリの虫嬰、チャの葉、イスツキ虫嬰、フジマメ未
熟種子、インゲン未熟種子、イネ茎葉、トウモロコシ花
粉等から単離されている。ブラシノステロイドは、ブラ
シノライド及びその同族体を総称するもので、その同族
体は現在までに２２種のものが明らかにされている。

ブラシノステロイドは、広く高等植物が生産しているも
ので、前記のように各種の植物体に含有されるが、その
植物体中の含量は１μｇ−１００μｇ／ｋｇ生体重と極
めて微量である。そして、このブラシノステロイドは、
植物に対する生理作用として、イネラミナジョイント試
験において０．０００１ｐｐｍの濃度で活性を示すほか
、エントウ上胚軸、キュウリ下胚軸などに対して伸長促
進作用を示す。

従来、ブラシノステロイドの各種同族体が化学合成され
、その農業作物に対する生理作用が広範囲にわたって調
べられるにいたっている。現在までに次のような効果の
あることが確められた。すなわち、コムギ、トウモロコ
シ、キュウリに対する増収効果、イネ、キュウリ、ナス
に対する耐冷性の増強、ハクサイに対する耐病性の強化
のほか。

薬剤耐性、耐塩性の増強などの有用な効果のあることが
明らかにされた〔「化学と生物」、２３，７１７（１９
８５））。

ブラシノステロイドは、上記のように農業用薬剤として
の有用性が実証されつつあるが、その製造法に関しては
今のところ化学合成による手段しかない。ブラシノステ
ロイドの化学合成は、複雑な化学反応の組み合わせから
成り立っており、副成する異性体の分離など高度の技術
を要する。試験用の試料調製は可能となっているものの
、化学合成は農業用薬剤の製造法としては限界があると
されている。そこで、生物生産による調製が試みられて
いて、例えば、ブラシノステロイドを生産する微生物の
探索などが行なわれているが未だ成功するには至ってい
ない。

本発明者らは、先に、植物細胞にアグロバクテリウム属
細菌を感染させ、細菌が保持しているプラスミド遺伝子
の一部を植物細胞に導入して、腫瘍細胞へ形質転換を行
なった植物細胞（クラウンゴール細胞）が、ブラシノラ
イドを生産していることを見出し、培養した細胞を抽出
、精製の後、質量分析計を用いてブラシノステロイドと
カスタステロンの存在を確認した。そして、この知見を
もとにクラウンゴール細胞の培養によるブラシノステロ
イドの製造方法を提案した（特願昭６３−９９５４９号
）。

しかし、クラウンゴール細胞のブラシノステロイド生産
量は、１−１００μｇ／ｋｇ生体重と低く、経済的なブ
ラシノステロイドの製造方法とするには、さらに生産性
を向上させる必要がある。

〔発明の課題〕

本発明はクラウンゴール細胞の培養によるブラシノステ
ロイドの生産方法において、そのブラシノステロイドの
生産性を向上する方法を提供することをその課題とする
。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために、ク
ラウンゴール細胞の培養条件を種々検討した結果、培地
中に添加するとクラウンゴール細胞のブラシノステロイ
ド生産量を増加させる物質を、幾つか見出した。また、
クラウンゴール細胞の培養に際し、赤色光又は黄色光を
照射すると。

そのブラシノステロイドの生産量が向上することを見出
した０本発明はこれらの知見に基づいて完成されたもの
である。

すなわち１本発明によれば、ブラシノステロイド生産性
クラウンゴール細胞を培養してブラシノステロイドを生
産する方法において、該クラウンゴール細胞を培養する
培地に、オーキシン類、スチロール類、スクアレン及び
カザミノ酸の中から選ばれる少なくとも１種の培養助剤
を添加することを特徴とするブラシノステロイドの生産
方法が提供される。

また１本発明によれば、ブラシノステロイドを生産する
クラウンゴール細胞を培養してブラシノステロイドを生
産する方法において、該クラウンゴール細胞を培養する
培地に赤色光又は黄色光を照射することを特徴とするブ
ラシノステロイドの生産方法が提供される。

本発明で培養基盤として用いるクラウンゴール細胞は、
ブラシノステロイド生産性のもので、常法によって得る
ことができる。即ち、ブラシノステロイド生産性の植物
細胞に植物腫瘍病菌、たとえばアグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉ＋）属細菌を感染させ、細菌
が保持しているプラスミド遺伝子の一部を植物細胞に導
入して、腫瘍細胞へ形質転換させることによって容易に
得ることができる。

植物体としては、例えば、ニチニチソウ、タバコ、キク
イモ、ヒマワリ、カブ、カランコニ、ヒナキク等の双子
葉植物および一部の単子葉植物（ユリ科、サトイモ科、
イネ科）が用いられる。

本発明においては、培養助剤として、オーキシン類、ス
チロール類、スクアレン及びカザミノ酸の中から選ばれ
る少なくとも１種を用いる。オーキシン類としては従来
公知のものが用いられる。

このようなものとしては、例えば、２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、インドール酢酸（ＩＡＡ
）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）等が挙げられる。

クラウンゴール細胞は増殖に必要なオーキシンとサイト
カイニンを自ら生産できるので、通常の培養細胞ｒは異
なり、植物ホルモンの添加しない培地で増殖し得るもの
である。従って、クラウンゴール細胞の培養にオーキシ
ンが添加されることはない。本発明のクラウンゴール細
胞の培養において、オーキシンの添加によりブラシノス
テロイドの生産性が向上するのは予想外のことである。

本発明で培養助剤として用いるスチロール類は。

ステロイド骨格を有するアルコールで、従来公知の各種
のものが挙げられる。このようなものとしては、例えば
、コレスチロール、デスモスチロール、チモスチロール
、ラノスチロール等が挙げられる。

本発明で用いる培養助剤は、培地に対して添加されるが
、その添加量は、培養助剤の具体的種類により異なる。

培地中濃度で表わして、オーキシン類では０．０１−１
００ｍｇ、ｌ、好ましくは０．１−１０ｍｇ／Ｌスチロ
ール類とスクアレンは、０．１〜１０００ｍｇ／１２、
好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｑ、カザミノ酸は、０．１
〜１００ｇ／Ｑ、好ましくは０．１〜１０ｇＩＱの割合
である。この培養助剤は、培地に対して最初から添加し
得る他、培養途中において添加することができ、特に、
クラウンゴール細胞の対数増殖期以降の時点で添加する
のが好ましい。培養助剤がクラウンゴール細胞の生育阻
害を示す時には、細胞の対数増殖期以降の時点で添加す
ることにより、良好な結果を得ることができる。

本発明においては、クラウンゴール細胞の培養に際し、
培地に対して赤色光（波長６００〜９００ｎｍの光）又
は黄色光（波長５００〜９００ｎｍの光）を照射するこ
とによって、ブラシノステロイドの生産性を向上させる
ことができる。この場合、前記培養助剤を添加すること
によってブラシノステロイドの生産性をさらに向上させ
ることもできる。

クラウンゴール細胞の培養は、通常の方法、例えばＭＳ
培地等で振どう培養により行うことができる。そして、
培養後、増殖した細胞をホモジナイザー等で磨砕し、メ
タノール、クロロホルム等の溶剤により抽出し、粗抽出
物をクロマトグラフィー等の常とう手段により分離精製
し、目的のブラシノステロイドを得る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ブラシノステロイド生産性クラウンゴ
ール細胞の培養に際し、特定の培養助剤を添加したこと
によって及び／又は特定の波長の光を照射したことによ
って、ブラシノステロイドを高生産性で生産することが
できる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

（１）ニチニチソウのクラウンゴール細胞（ＶＮＣ’）
の調製 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
　Ａ　２０ｇをＮｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈ寒天上に１
６時間培養して生じたコロニーをかきとり、これを、ニ
チニチソウ苗木（茎長１５−２０ＣＩＯ）の茎にメスで
１〜２１１Ｉ１１の傷をつけたところに塗布した。この
苗木をガラス温室中、２７〜２８℃で１月間栽培した。

接種部に約１ｃｍの腫瘍、クラウンゴール、が生じた。

このクラウンゴールを切り出し、１０％サラシコ溶液で
表面を殺菌後、腫瘍組織の内部より約３ｍｍ＋角の切片
をとり、抗生物質（２００ｍｇ／Ｑカルベニシリンと１
００ｍｇ／Ｑバンコマイシン）を含んだ下記組成の胚液
体培地に入れ、振どう培養した（２６℃、ｌ　ＯＯｒｐ
ｍ、暗所）。

ＭＳ培地組成（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ培地）
　　（ｍｇ／ＵＭｇＳＯ４・７）＋２０　　　　　　　
　３７０ＣａＣＱ２・２Ｈ２０４４０ ＫＮｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０Ｏ
Ｎ８４Ｎｏ、　　　　　　　　　　　　　　　１６５０
ＫｌＩ□Ｐ０．　　　　　　　　　　　　　　　１７０
ＦｅＳ０，４８２０　　　　　　　　　　　２？、８Ｎ
ａ２ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　３７．３
Ｍｎ５Ｏ，・４）１２０　　　　　　　　　　　２２．
３ＺｎＳＯ，・７１１．０　　　　　　　　　　　　８
　、６ＣｕＳＯ４・５Ｈ，ＯＯ，０２４ ＣｏＣＱ、　・６）１，０　　　　　　　　　　　　　
０．０２５ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｏ，８３Ｈ３ＢＯ３６，２ Ｎａ２Ｍｏ０４・２Ｈ２００，２５ シユクロース　　　　　　　３００００ミオイノシトー
ル　　　　　１００ ニコチン酸　　　　　　　　　０．５ 塩酸ピリドキシン　　　　　　０．５ 塩酸チアミン　　　　　　　　　０．１グリシン　　　
　　　　　　　２ １週間後、無菌化された液体培地に増殖した組織をとり
だし、上記のＭＳ培地に寒天２％を加えてなるＭＳ寒天
培地上に移植した。このようにして培養細胞ｖ２０８は
ＭＳ寒天培地上で急速に増殖し、同じ寒天培地上で２０
日毎に継代培養した。ｖ２０８細胞を、ＭＳ液体培地に
移植して振どう培養し１週間毎に継代培養して、液内懸
濁細胞としたｖ２０８株（ＶＮＣ’）細胞を得た。

このＶＮＣ’細胞のブラシノステロイド生産機能は安定
しており、継代培養を続けて一年後においても再現性の
在ることを確認した。

（２）　ＶＮＣ’細胞の培養 前記のようにして得たニチニチソウのクラウンゴール細
胞ＶＮＣ’株を前記したＭＳ培地（シュークロースは３
％、　ｐＨは６．７とした）１５０ｍＱを含む５０〇−
容の三角フラスコで、２７℃、暗所で振盪培養した（１
００ｒｐｍ）。培養の最初から、また培養ＩＯ日目止、
培地中に、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）の水溶液を濃度を変えて添加した。２．４−Ｄの添
加量は、培地ＩＱあたり、０．１ｍｇ、　０．５Ｈ，ｆ
ｍｇ、５ｍｇ、　１０ｍ１ｇ。

５０ｍｇとした。　２．４−Ｄ添加後さらに培養を続け
、１４日目止細胞を濾過して細胞と培養濾液を収穫した
。

収穫した細胞約５０ｇは、２００−のメタノールを添加
してホモジナイザーで粉砕し、ガラスフィルターで濾過
した。これを３回繰り返し、合すせたメタノール抽出液
をエバポレーターで減圧濃縮し、約４０−の水溶性濃縮
物とし、０．３ｇの炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨ
を弱アルカリ性とし、４ｏ−の酢酸エチルで３回抽出し
た。酢酸エチル溶液は無水硫酸ナトリウムで脱水後、減
圧濃縮し、酢酸エチル可溶性中性区（ＮＥ区）を得た。

収穫した培養濾液約１００−に０．５ｇの炭酸水素ナト
リウムを添加してＰＩ）を弱アルカリ性とし、６０−の
酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル溶液は無水硫酸
ナトリウムで脱水後、減圧濃縮しＮＥ区を得た。このＮ
Ｅ区はイネラミナジョイント試験において、ブラシノラ
イド（ＢＬ）標品の活性の強さと比較することにより、
ブラシノステロイド（Ｏ５）の定量を行った。

前記の実験結果を表−１及び表−２に示す。

表−１ （２，４−Ｄの培養を最初から添加した系）表−２ （２，４−Ｄを培養の１０日目止ら添加した系）表−１
、表−２に示したように、２．４−Ｄを培地に添加する
と添加量に従ってＢＳ量も増加した。但し、添加量に従
って植物細胞に対する生育阻害が大きくなり、細胞の収
穫量が減少した。そこで、ある程度、植物細胞を増殖さ
せた後に２．４−Ｄを添加することで良い結果を得た。

また、２．４−Ｄの代りに、インドール酢酸（ＩＡＡ）
及びナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を用いても同様の結果を
得た。

実施例２ 前記実施例１で得たニチニチソウのクラウンゴール細波
ＶＮＣ’株を実施例１と同様にして培養した。

但し、この場合、２．４−Ｄは添加しないで、培養１０
日目止、培養物中にコレスチロール又はスクアレンを添
加した。コレスチロール又はスクアレンの添加量は、培
地ＩＱあたり、１０（ｂｏｇ／Ｑとした。コレスチロー
ル又はスクアレンの添加後さらに培養を続け、１４日１
に細胞を濾過して細胞と培養濾液を収穫した。収穫した
細胞と培養濾液から、実施例１と同様にして抽出を行っ
てＮＥ区を得た。Ｎ［Ｅ区はイネラミナジョイント試験
において、ブラシノライド（ＢＬ）標品の活性の高さと
比較することにより、ブラシノステロイド（ＢＳ）の定
量を行った。なお、コレスチロール又はスクアレンは、
　ＮＥ区に回収されるが、イネラミナジョイント試験に
おいて、ＢＳ活性を持たない。

前記の実験結果を表−３に示す。

表−３ なお、コレスチロールとスクアレンの添加濃度を変えて
、検討した結果、１〜１００ｍｇ／Ｑが良い結果を得た
。

実施例３ 前記実施例１で得たニチニチソウのクラウンゴール細胞
ＶＮＣ’株を実施例１と同様にして培養した。

培養の最初から、培地中にカザミノ酸を濃度を変えて添
加した。添加量は、培地ＩＱあたり、０．０７ｇ、０．
７ｇ、７ｇとした。１４日１に細胞を濾過して細胞と培
養濾液を収穫した。収穫した細胞と培養濾液から、実施
例１と同様にして抽出を行ってＮＥ区を得た。ＮＥ区は
イネラミナジョイント試験において、ブラシノライド（
ＢＬ）標品の活性の強さと比較することにより、ブラシ
ノステロイド（ＢＳ）の定量を行った。

前記実験結果を表−４に示す。

表−４ 表−４に示したように、カザミノ酸を添加した場合に、
ブラシノステロイドの生産量が顕著に増加した。また、
カザミノ酸は、培地に添加した場合に、１ｇＩＱ以下の
添加量では、細胞の生育を阻害しなかった。

実施例４ 実施例１で得たニチニチソウのクラウンゴール細胞ＶＮ
Ｃ’株を実施例１と同様にして培養した。培養の最初か
ら、培養フラスコを色付きセロファンで包み、約１６０
００　ｌｕｘの白色光を照射し、培養を行った。比較例
として、アルミ箔で包んだものと。

何も包まないものを用いた。１４日１に細胞を濾過して
細胞と培養濾液を収穫した。収穫した細胞と培養濾液か
ら、実施例１と同様にして抽出を行ってＮＥ区を得た。

ＮＥ区はイネラミナジョイント試験において、ブラシノ
ライド（ＢＬ）標品の活性の強さと比較することにより
、ブラシノステロイド（ＢＳ）の定量を行った。

前記実験結果を表−５に示す。

表−５ 光を照射して培養すると、一般に、細胞の生育は阻害さ
れる。しかし、黄色光又は赤色光を照射して培養した場
合には、 ブラシノステロイドの生 産量が顕著に増加した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ブラシノステロイド生産性クラウンゴール細胞を
   培養してブラシノステロイドを生産する方法において、
   該クラウンゴール細胞を培養する培地に、オーキシン類
   、スチロール類、スクアレン及びカザミノ酸の中から選
   ばれる少なくとも１種の培養助剤を添加することを特徴
   とするブラシノステロイドの生産方法。
2. （２）該培養助剤が、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
   、インドール酢酸及びナフタレン酢酸の中から選ばれる
   少なくとも１種のオーキシンである請求項１の方法。
3. （３）該培養助剤を、培養細胞の対数増殖期以降の時点
   で添加する請求項１又は２の方法。
4. （４）該クラウンゴール細胞を培養する培地に、赤色光
   又は黄色光を照射する請求項１〜３のいずれかの方法。
5. （５）ブラシノステロイド生産性クラウンゴール細胞を
   培養してブラシノステロイドを生産する方法において、
   該クラウンゴール細胞を培養する培地に、赤色光又は黄
   色光を照射することを特徴とするブラシノステロイドの
   生産方法。